유전적으로 통할 수 있는 선충성 Caenorhabditis elegans는 약물 발견을 위한 간단하고 저렴한 모델로 사용될 수 있습니다. 여기에 설명된 RAS 및 EGFR 단백질의 하류 신호를 억제하는 항암 치료제를 식별하는 프로토콜이 있다.
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이 논문에서
요약
초록
표피 성장 인자 수용체(EGFR)와 다운스트림 이펙터 RAS의 혈장 막 국소화의 변화는 암을 포함한 여러 질병에 연루되어 있다. 자유 살아있는 선충 C. elegans는 외음부의 발달을 위한 중심인 진화적이고 기능적으로 보존된 EGFR-RAS-ERK MAP 신호 폭포를 가지고 있습니다. RAS homolog LET-60 및 EGFR homolog LET-23에서 기능 돌연변이의 이득은 이러한 웜의 복부 바디 월을 따라 눈에 보이는 비기능성 외투 성 의사 물음부의 생성을 유도한다. 이전에는 이러한 웜에서 다발성(Muv) 표현형이 작은 화학 분자에 의해 억제되는 것으로 나타났다. 여기서 우리는 EGFR 및 RAS 단백질의 활동을 폐지하는 억제제를 확인하기 위해 액체 기반 분석에서 웜을 사용하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 분석법을 사용하여, 우리는 R-fendiline, K-RAS의 간접 억제제를 보여주고, let-60 (n1046) 및 let-23 (sa62) 돌연변이 벌레에 표현된 Muv 표현형을 억제합니다. 분석은 간단하고 저렴하며 설정에 시간이 많이 걸리지 않으며 항암 치료제의 발견을위한 초기 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.
서론
유기체 내의 발달 사건을 통제하는 세포 통로는 모든 메타조인 사이에서 높게 보존됩니다. 이러한 경로 중 하나는 EGFR-RAS-ERK 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 신호 캐스케이드이며 세포 증식, 분화, 이주 및 생존1,2를제어하는 중요한 통로이다. 이 신호 통로에 있는 결점은 암과 같은 병리학 또는 질병 국가로 이끌어 낼 수 있습니다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 구강 편평상피 세포 암종의 50%를 포함하여 인간 종양에서 높게 발현되는 것으로 나타났으며, 악성 종양3,4,5의발달에 기여한다. 3개의 RAS 동위상체에 있는 돌연변이는 H-, K-및 N-RAS는 다중 인간적인 암에 있는 악성 변환을 위한 중요한 동인인 인 반면. 이 세 가지 RAS 동소 형태 중, K-RAS의 종양 발생 돌연변이는가장널리 퍼진6,7,8. EGFR과 RAS가 작....
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프로토콜
1. 선충 성장 매체 (NGM) 플레이트 준비
- 2L 에렌마이어 플라스크에 포함된 970mL의 디온화 된 물에 펩톤 2.5 g와 NaCl 3 g을 추가합니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 내용물들을 저어줍니다. 그 후 플라스크에 20g의 한고를 넣습니다. 플라스크의 내용내용은 121°C에서, 30분 동안 15파운드/in2의 압력을 가한다. 살균 후 플라스크를 교반판에 놓고 온도가 50°C에 도달할 때까지 매체를 식힙니다.
- NGM 플레이트를 준비하기 위해 냉각 된 매체에 다음 시약을 추가 : 1 M 칼륨 인산염 버퍼 (pH = 6.0),1 mL의 1 mL4,1 M CaCl2의1 mL, 1 mL (95 % 에탄올에서 5 mg / mL) 콜레스테롤, 1 mL의 (에탄올에서 10% v/w) nystatin, 그리고 1 mL 의 25 mg/mL 연쇄 절제술.
- 라미나르 의 흐름 아래, 60mm x 15mm 멸균 페트리 접시에 냉각 된 매체를 부어. 플레이트가 2시간 동안 굳어지게 합니다. 이 플레이트는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. C. 예인자의 전파
- 하룻밤 재배된 대장균....
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결과
우리는 먼저 R-펜딜린이 DMSO 처리 된 웜에 비해 let-60 (n1046) 돌연변이 균주에서 Muv 표현형을 억제 할 수 있음을 입증한다. 우리의 데이터는 R-fendiline이 용량 의존적 방식으로 let-60(n1046)에서 Muv 표현형을 차단할 수 있음을보여줍니다(그림 2A, B). 그러나, Muv 표현형의 비반전은 R-fendiline(도2B)의농도 증가에 대응하여 린-1 널 돌연변이 균주에서 관찰되었다. 데이터는 R-fendiline 블록이 C. elegans의RAS 수준에서 활성화 된 let-60 신호임을 시사한다. 유사하게, 우리는 Muv 표현형이 DMSO 처리된 벌레(도 2C,D)에비해 3, 10 및 30 μM R-fendiline 치료에 반응하여 let-.......
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토론
우리가 벌레를 사용하여 설명하는 소사는 EGFR 및 RAS 기능의 억제제를 확인하기 위하여 간단하고 저렴합니다. C. elegans는 짧은 수명 주기(20°C에서 3일)와 많은 수의 애벌레를 생성하는 능력으로 인해 실험실에서 쉽게 성장할 수 있기 때문에 약물 발견을 위한 매력적인 모델이다. 더 중요한 것은, EGFR-RAS-ERK MAPK 통로는 EGFR 및 RAS 억제제의 효력을 분석하기 위하여 유전으로 기관시스템을 제공하는 포유동물로 진화적이고 기능적으로 보존됩니다. 또한, 벌레의 투명한 특성으로 인해 조사관은 DIC 및 형광 현미경 검사법에 의해 관심 있는 단백질에 융합된 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 기타 형광제의 뚜렷한 구조와 국소화를 시각화할 수 있습니다.
우리가 전파하고 이 연구에서 사용된 각종 C. elegans를 유지하는 데 사용한 프로토콜은 이전에20,
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공개 사항
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
Let-60(n1046)을제공한 와티 아루르 박사(MD 앤더슨 암 센터)에게 감사드립니다. 우리는 또한 린 -1 균주에 대한 박사 데이비드 라이너 (휴스턴의 생명 과학 및 기술의 텍사스 A&M 건강 과학 센터 연구소)에 감사드립니다. 마지막으로, 우리는 시약의 일부를 제공 에 대한 박사 다니엘 Garsin과 그녀의 실험실 (텍사스 대학, 맥거번 의과 대학)에 감사드립니다. 일부 웜 균주는 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40 OD010440)에 의해 투자되는 CGC에 의해 제공되었다. 이 연구는 JF 핸콕에 RP200047을 부여 텍사스의 암 예방 및 연구소 (CPRIT)에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강한>미디어 및 화학 물질 | |||
| 아가로스 | 밀리포어 시그마 | A9539-50G | |
| 박토 펩톤 | 피셔 사이언티픽 | DF0118-17-0 | |
| BD Difco 한천 | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB 육수 | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| 염화칼슘 | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| 콜레스테롤 | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| 황산 마그네슘 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros 유기물 | ||
| AC455500050 인산칼륨 이염기성 | 피셔 사이언티픽 | BP363-500 | |
| 포타슘 인산염 단일염기 | 성 피셔 사이언티픽 | BP362-500 | |
| R-펜딜린 | 상업적으로 합성된 (제약 등급) | ||
| 아지드나트륨 | 밀리포어 시그마 | S2002-25G | |
| 염화나트륨 | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| 수산화나트륨 | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% 하이포염소산나트륨 | 표백제 | ||
| 인산나트륨 디베이직 | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| 스트렙토마이신 설페이트 | 피셔 사이언티픽 | BP910-50 | |
| (&마이너스;)-테트라미솔 하이드로클로라이드 | 밀리포어 시그마 | L9756 | |
| UO126 (MEK 억제제) | 밀리포어 시그마 | 19-147 | |
| 소모품 | |||
| 15mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| 일회용 폴리스티렌 혈청학 피펫 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| 일회용 폴리스티렌 혈청학 피펫 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18mm X 18mm 커버 슬립 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| 투명 뚜껑이 있는 페트리 접시(60 x 15mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| 투명 뚜껑이 있는 페트리 접시(100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 일반 유리 현미경 슬라이드(75 x 25mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12웰 조직 배양 플레이트 | Fisher | Scientific 50-197-4804 | |
| <강력한>소프트웨어 | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| emE. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | 출처 |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
참고문헌
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H.
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