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방법 논문

전신 흡입 시스템을 사용하여 쥐의 담배 연기 노출

7.1K 조회수

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DOI:

10.3791/61793

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2020년 10월 22일

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1Program in Immunology, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Section of Infectious Diseases, Baylor College of Medicine, 3Department of Medicine - Immunology Allergy and Rheumatology, Baylor College of Medicine, 4Department of Medicine, Pulmonary, Critical Care, Sleep Medicine, Baylor College of Medicine, 5Department of Pathology and Immunology, Baylor College of Medicine, 6Department of Pediatrics, Research and Department of Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 7Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 8Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey VA Medical Center

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 사내에서 지어진 전신 흡입(WBI) 노출 시스템(WBI)을 통해 담배 연기(CS)의 병리학적 효과에 대한 연구를 보여줍니다. 이 시스템은 폐 기종및 혈청증에 대한 CS 중재 효과의 연구를 위한 통제된 반복조건하에서 CS에 동물을 노출할 수 있습니다.

초록

2018년 미국 성인의 14%에 가까운 사람들이 담배를 피우는 것으로 보고되었습니다. 폐와 심혈관 질환에 대한 담배 연기(CS)의 영향은 널리 연구되었지만 혈액및 골수와 같은 다른 조직 및 장기에서 CS의 영향은 불완전하게 정의되어 있습니다. 설치류에서 CS의 효과를 연구할 적절한 시스템을 찾는 것은 엄청나게 비싸고 시판되는 시스템을 구입해야 합니다. 따라서, 우리는 마우스에서 CS의 병리학적 효과를 연구하기 위해 저렴하고 신뢰할 수 있으며 다재 다능한 시스템을 구축하기 시작했습니다. 이 전신 흡입 노출 시스템(WBIS)은 CS와 깨끗한 공기에 대한 노출을 번갈아 가며 담배의 호흡과 퍼핑을 모방합니다. 여기서 우리는 이 do-it-yourself (DIY) 시스템이 담배 연기 노출의 4 달 후에 마우스에 있는 기도 염증 및 폐 폐기종을 유도한다는 것을 보여줍니다. 이 장치를 사용하여 골수에서 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSPC)에 대한 CS의 전신 흡입 (WBI)의 효과도 도시되어 있습니다.

서론

담배 흡연은 지난 50~60년 동안 담배 흡연 성인의 수가 꾸준히 감소했음에도 불구하고 미국에서 예방 가능한 질병의 주요 원인중하나입니다. 흡연은 폐종 과 만성 기관지염2,3,4를포함하는 질환군인 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)을 포함한 폐와 혈액의 여러 질환과 관련이 있는 것으로 널리 알려져 있다. 질병 통제 센터 (CDC)에 따르면, 2014년에, COPD는 이 질병 때문에 손해를 입은 1,500만 명 이상의 미국인과 미국에서 죽음의 세 번째 주요한 원인이었습니다5.

CS는 또한 최근에 단일 조혈 줄기 세포가 불균형하게 사람의 말초 혈액의 큰 비율을 생성하는 조건인 클로날 조혈 (CH)6,7을개발의 고위험과 연관되었습니다. 이 발견은 흡연과 골수 기능 사이의 잠재적인 연결을 나타냅니다. CS의 광범위하고 매우 중요한 건강 영향을 감안할 때 질병의 뮤린 모델은 생물 의학 연구에서 진보의 초석임을 감안할 때, 마우스에서 CS를 모델링하는 효율적이고 저렴한 시스템을 개발하는 것이 유용합니다.

여기에서, 우리는 폐 폐기종과 골수 항상성에 CS의 생체 내 효과를 치료하고 공부하기위한 저렴한 시스템을 구축하기위한 단계별 가이드를 제공합니다. 이 장비의 조립은 사용자가 전문 지식을 가질 필요가 없으므로 DIY 조립을 허용합니다.

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프로토콜

실험과이 기술의 개발에 관련된 모든 동물은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)와 실험실 동물 관리 (AAALAC)의 평가 및 인증 협회에 의해 인가 된 베일러 의과 대학 및 MD 앤더슨 기관에서 승인 한 동물 사용 프로토콜에 따라되었습니다.

1. 장치 구축

  1. 밸브 시스템으로 공기 압축기 조립.
    1. 1/8 인치 나사 로 처리 된 남성 어댑터 젖꼭지 피팅을 사용하여 유량계 (Y 막대와 2 개의 전원 이륙과 2 개의 전원 이륙)를 소형 압력 조절기에 연결합니다. 스레드가 있는 모든 끝에 스레드 씰 테이프를 사용해야 합니다.
    2. 조립된 압력 레귤레이터를 컴프레서 공기 콘센트의 1/8 인치 육각 형 젖꼭지, 1/8 인치 나사 커플링 피팅 및 압력 조절에 연결되는 1/8 인치 나사 남성 어댑터 젖꼭지 피팅과 같은 유량계와 유량계를 연결합니다.
    3. 각 (4) 유량계에 산소 회전 가시 커넥터를 설치합니다.
    4. 공기 압축기의 상단 공기 콘센트에 남성 어댑터를 설치합니다 (의료 공기 압축기 기기에 포함 된 부분).
  2. 어셈블 챔버(4유닛 확인)
    1. 3/4 인치 염소 화 폴리 염화 비닐 (CPVC) 파이프를 8 개의 4 인치 세그먼트로 자른다.
    2. 각 세그먼트를 3/4 인치 90° 팔꿈치 CPVC 피팅에 삽입하고 팔꿈치의 피팅 측면을 3/4 인치 직경 CPVC 남성 어댑터에 부착합니다. CPVC 세그먼트는 8개여야 하며, 각 세그먼트는 하나의 CPVC 팔꿈치 피팅과 1개의 CPVC 남성 어댑터에 부착되어야 합니다.
    3. 뚜껑이 있는 8.5L 밀폐 용기(11.25 x 7.75 x 6인치)의 반대편에서 두 개의 구멍(직경 1 1/4인치)을 드릴링합니다(그림 1 노출 챔버 참조). 구멍의 위치는 위에서 아래로, 왼쪽에서 오른쪽으로 중앙으로 지정됩니다.
    4. 용기의 각 구멍에 미리 조립된 CPVC 수컷 어댑터의 나사측면을 삽입합니다.
    5. 용기 의 내부에서, 다른 쪽에 3/4 인치 CPVC 캡을 부착 (챔버 연기 입력) 한쪽에 3/4 인치 CPVC 드립 관개 여성 어댑터 (챔버 연기 출력).
    6. 챔버 연기 출력의 CPVC 캡 상단에 5 개의 3mm 구멍을 퀸쿤스 (샤워 헤드) 패턴으로 드릴. 이렇게 하면 담배 연기가 더 높은 속도의 챔버에 들어갈 수 있으며 모든 방향으로 챔버 내부에 고르게 퍼집니다.
  3. 조립 담배 챔버 (4 뮤린 노출 단위까지 구성)
    1. 1홀 고무 스토퍼(제조사 크기 8.5)를 가지고 넓은 면에 1/4 인치 가시 Y 커넥터와 좁은 면에 직선 가시 피팅 (8mm 개구부)을 삽입하십시오. 담배는 흡연 시술(담배 받침대)에 배치됩니다.
    2. 12인치 길이의 의료용 비닐 파이프의 한쪽 끝을 고무 스토퍼에 부착된 Y 커넥터의 가시 커넥터 중 하나에 연결하고 다른 쪽 끝은 1/4 인치 피팅에 부착하고 이 피팅의 반대쪽을 1 홀 고무 스토퍼 (제조업체 크기 1)에 삽입합니다.
    3. 다른 고무 스토퍼(제조업체 크기 8.5)에 1/4인치 직선 튜브 커넥터를 스토퍼의 넓은 측면에 삽입하고 피팅의 외부 끝을 7피트 의학적 등급의 비닐 파이프에 연결합니다.
    4. 실험실 유리 드레인 튜브에서 1.3.1-1.3.3 단계 에서 조립 된 두 개의 고무 스토퍼 구조를 8 인치 x 1.75 인치 유리 실린더에 연결합니다.
  4. 밸브 제어 시스템
    1. 이 시스템은 담배 연기와 깨끗한 공기의 흡입 (퍼핑)을 시뮬레이션하는 솔레노이드 밸브의 리듬 개폐에 의해 제어됩니다. 솔레노이드 밸브를 제어하는 시스템은 상업적으로 설계되었습니다(재료 표참조).
  5. 모든 구성 요소를 함께 조립(그림 1참조)
    1. 1인치 패스너를 사용하여 밸브 제어 시스템의 측면에 4개의 솔레노이드 밸브를 장착합니다.
    2. 솔레노이드 밸브를 제조업체의 지시에 따라 밸브 제어 시스템에 연결합니다.
    3. 10-32(M) 나사 직선 커넥터를 솔레노이드 밸브의 배기("EXH") 연결과 동일한 솔레노이드 밸브의 "IN" 및 "OUT" 연결에 나사로 된 포트 어댑터를 부착합니다.
    4. 7피트 의료급 비닐 튜브를 사용하여 "OUT" 연결을 통해 압축기에 부착된 유량계를 솔레노이드 밸브에 연결합니다.
    5. 1.3.3 단계에서 고무 스토퍼와 조립 된 7 피트 비닐 튜브를 연결합니다. 솔레노이드 밸브의 "IN" 커넥터에.
    6. 챔버 연기 입력에 담배 챔버의 작은 고무 스토퍼를 삽입합니다.
    7. 솔레노이드 밸브를 1.3.1 단계에서 조립한 담배 받침대에 가시 Y 커넥터의 두 번째 연결에 연결합니다.

figure-protocol-1
그림 1: CS에 노출하기 위한 WBIS 연결의 회로도. 이 그림은 모든 구성 요소가 작업 장치를 형성하기 위해 조립되는 방법을 보여줍니다. 이 그림은 기계가 작동 할 수있는 4 개의 조립 흡연 챔버 를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 담배 연기 노출

주의: 담배 연기에 대한 두 번째 및 세 번째 노출을 피하십시오. 담배 및 노출 챔버는 클래스 II 유형 B2 라미나르 흐름 생물학적 안전 캐비닛 내에서 사용되어야한다. 적절한 PPE는 연기 노출 실험 (즉, 마스크, 장갑, 헤어 넷, 가운)을 수행하는 동안 착용해야합니다.

  1. 압력 및 기류 설정
    1. 그림 1에표시된 대로 모든 구성 요소가 조립되면 공기 압축기를 켜고 안전 경보가 자체적으로 꺼지기를 기다립니다.
    2. 압력 조절기의 노브를 돌려 공기 압축기의 압력을 40-50 psi로 조정합니다.
    3. 유량계를 사용하여 공기 압축기에서 5L로 공기 흐름을 조정합니다.
    4. 밸브 컨트롤러를 켭니다.
    5. 밸브 컨트롤러의 디지털 타이머를 PULSE-C(디스플레이에 "Pu-c"로 표시됨)로 조정하여 SET/LOCK 키를 눌러 타이머의 첫 번째 숫자에서 UP 키를 누른다. 그런 다음 Pu-c 모드에 도달할 때까지 UP 키를 누릅니다. 리셋 키를 눌러 표시된 작동 모드(예: Pu-C)를 작업 모드로 설정합니다.
    6. SET/LOCK을 눌러 타이머 1을 변경합니다(디스플레이에 "T1"으로 표시됨).
    7. UP 또는 DOWN 키를 눌러 T1을 20s로 설정합니다.
    8. SET/LOCK을 눌러 타이머 2를 변경합니다(디스플레이에 "T2"로 표시됨).
    9. UP 또는 DOWN 키를 눌러 T2를 3으로 설정합니다.
      참고: 단계 2.1.5 ~ 2.1.9는 특정 타이머와 함께 사용할 수 있도록 조정됩니다(재료 표참조). 이 제품의 다른 용도에 대한 자세한 지침은 해당 사용자 설명서를 참조하십시오.
  2. 담배 연기 치료
    참고 : 이 시스템은 동시에 1-4 뮤린 노출 챔버의 사용을 허용합니다.
    1. 공기 압축기를 켜고 안전 경보가 자체적으로 꺼지기를 기다립니다.
    2. 밸브 컨트롤러를 켭니다.
    3. 8.5L의 부피를 가진 밀폐 된 탈착식 뚜껑을 가진 4개의 노출 챔버각각에 5 마우스를 전송하는 것은 클래스 II 타입 B2 Laminar 흐름 생물 안전 캐비닛 내의 마우스로 4개의 노출 챔버를 놓습니다.
    4. 라미나르 플로우 생물학적 안전 캐비닛 내부에 담배를 밝히고 담배 실 내부에 담배를 삽입합니다. 켄터키 3RF4 연구 담배 (9.5 mg /cig tar 및 0.73 mg/cig 니코틴)에 비해 15 mg /cig 타르 및 1.1 mg /cig 니코틴8을 포함하는 시판되는 담배를 사용하십시오9.
    5. 현재 사용 중인 챔버에 해당하는 밸브 컨트롤러의 밸브를 켭전환합니다. 노출은 2단계로 나뉩니다: (T1) 깨끗한 공기는 20s용 노출실로 펌핑되고 (T2) 공기흐름은 담배챔버로부터 연소및 연기가 3s에 대한 노출실로 펌핑된다. 담배가 필터에 도달할 때까지 완전히 타버릴 수 있도록 합니다.
      1. 타이머 설정을 조정하여 ~4분 동안 평균 ~10퍼퍼/담배를 수행합니다. 타이머와 시스템은 조사자의 연구 요구에 따라 CS 투약 요법을 향상시크거나 낮추기 위해 쉽게 사용자 정의 할 수 있습니다.
    6. 담배 필터를 제거하고 담배 꽁초를 유리 비커에 물로 놓고 불을 끄고 냄새를 약화시킴으로써 폐기하십시오.
    7. 담배 실이 담배 없이 다시 닫혀 있는지 확인하십시오. 기계가 10 분 동안 깨끗한 공기를 펌프하자. CS에 노출된 척추동물에 대한 지속적인 모니터링을 유지하는 것이 가장 중요합니다. 이 노출 요법은 노출 챔버 당 9 주 이상 5 여성 마우스에 최적화됩니다.
    8. 하루에 챔버당 총 4개의 담배에 대해 2.3.4~2.3.7을 3회 반복합니다. 이 절차는 연구원이 그들의 실험을 위해 필요로 하는 한 주 5 일 반복됩니다.
    9. 노출 실에서 마우스를 해당 케이지로 다시 제거합니다.
    10. 밸브 컨트롤러와 공기 압축기에서 끕니다.
    11. 노출 및 담배 챔버를 제거하고 타르의 잔류물을 제거하기 위해 물과 비누로 씻어.
    12. 다시 사용하기 전에 챔버를 완전히 건조시키십시오.

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결과

CS 노출의 주요 특징 중 하나는 폐에서 공기 주머니 (폐포)의 손상과 파괴를 특징으로하는 폐기종입니다. 따라서, 초기 실험은 CS에 반복된 전신 노출시 여성 마우스의 폐에 있는 폐기종 변화를 유발하는 DIY 시스템의 기능에 초점을 맞추게 되었습니다. CS 투약 요법은 우리가 CS로 마우스를 치료하고 폐기종10,11, 12,13,14,15,16의분자 병리생리학을 연구하기 위해 여기에 설명된 DIY 시스템을 활용한 우리의 이전 간행물에 기초하여 선택되었다. 구체적으로, 마우스는 매일 필터를 가진 4개의 상용 담배의 연기...

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토론

여기서 우리는 CS에 마우스의 WBIS에 대한 장치의 건설에 필요한 정보를 제공합니다. 시스템의 설치 후, 조사관이 동물에서 니코틴 또는 코티닌의 전달 된 복용량에 따라 시스템을 보정하는 것이 매우 중요합니다. 이 장치에는 담배 퍼프 볼륨, 퍼프 주파수, 결합된 연기 노출 기간 및 동물이 각 담배 사이에 받는 휴식 간격을 조절하는 데 사용할 수 있는 타이머 및 압력 게이지가 포함되어 있습니다. 더욱이, 매일 투여되는 담배의 실제 수는 타르 및 니코틴 함량에 따라 달라질 수 있다. 마지막으로, 담배 연기에 노출된 모든 성분은 동물의 적절한 연기 순환과 일관된 연기 노출을 보장하기 위해 정기적으로 청소해야 합니다.

CS 및 공기 독성물질을 가진 마우스의 처리를 위해 적어도 반 다스 상용 시스템 및 프로토콜이 있습니다. 그러나 이러한 목적으로 사용되는 장비의 대부분은 상업용 공급업체 또는 조립용 전자 제품 및/또는 전기 공학에 대한 심층적인 지식이 필요합니다. 그 시스템 중 일부는 W...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

AR, XH 및 PE는 NIH 보조금 R01HL140398 및 길슨 롱겐바우 재단 보조금에 의해 지원되었습니다. DEMM과 KK는 NIH 보조금 R01HL136333 및 R01HL134880(KYK)과 헬리스 의학 연구 재단의 보조금으로 지원받았습니다. DEMM은 또한 하워드 휴즈 의학 연구소에 의해 지원됩니다 (HHMI) 고급 연구를위한 길리엄 펠로우십. PE는 또한 정밀 환경 건강 과학 NIEHS T32 ES027801 펠로우십 프로그램 교육을 통해 지원됩니다. JC와 MF는 후성 유전학 및 분자 발암발생학과와 MD 앤더슨의 후성유전학 센터(MF에 대한 학자 상)의 담배 연구 기금에 의해 지원됩니다. FK와 YZ는 NIH 보조금 R01 ES029442-01 및 R01 AI135803-01뿐만 아니라 VA 메리트 보조금 CX0000104에 의해 지원됩니다. 이 프로젝트는 베일러 의과 대학의 세포 측정 및 세포 선별 코어에 의해 지원되었으며 CPRIT 코어 시설 지원 상 (CPRIT-RP180672), NIH (CA125123 및 RR024574), 조엘 M. 세더스트롬의 지원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 인치 패스너Lowes756990
1/4 인치 바베드 Y 커넥터VWR89093-282
1/4 인치 스트레이트 튜빙 커넥터VWR62866-378
1/8 육각 니플Lowes877221
1/8 인치 나사식 커플링 피팅Lowes877208
1/8 인치 나사식 남성 어댑터 니플 피팅Lowes877243
10/32 (M) 나사산 직선 커넥터BimbaEB60
3/4 in 90도 엘보우 CPVC 피팅Lowes22643
3/4 in 염소화 폴리염화비닐 (CPVC) 파이프Lowes23814
3/4 in CPVC 캡Lowes23773
3/4 in CPVC 드립 관개 암 어댑터Lowes194629
직경 3/4 인치 CPVC 남성 어댑터Lowes23766
8.5 L 밀폐 용기 뚜껑 포함 (11.25in x 7.75in x 6 in)KomaxN/A"Komax Biokips 대형 빵 상자"로 등재됨 | (280온스) 대형 저장 용기"
유리 배수관(직경 1.75인치 x 길이 8인치)KIMAX6500
아이소닉 솔레노이드 밸브빔바V2A02-AW1
말보로 레드 100's말보로N/A
산소 회전 철조망 커넥터Global Medical SolutionsRES002
파나소닉 타이머 LT4H-W파나소닉LT4HW항목은 Shepherd Controls & Associates
압력 조절기Allied Electronics and Automation70600552"Norgren R07-100-RGKA"로도 등재
있습니다. 고무 마개 # 1 (한 구멍)VWR59581-163
고무 마개 # 8.5 (한 구멍)VWR59581-389
Scireq inExpose 시스템Scireq 및 Emka TechnologiesN/A우리의 비교를 위해 사용되는 상업용 시스템입니다. DIY WBIS
스트레이트 바브 피팅 (8mm 개구부)VWR10028-872
스레드 실란트 테이프Lowes1184243
스레드 포트 어댑터BimbaP1SA1
Timeter Aridyne 2000 의료용 공기 압축기MFI MedicalAHC-TE20
Timeter 유량계Allied Healthcare Products15006-03YP2또한 "청교도 공기 미터"로 나열
된 밸브 제어 시스템Shepherd Controls and AssociatesN / ACompany는이 모델의 밸브 제어 시스템을 맞춤 설계했습니다.
비닐 파이프바이탈리티 메디컬RES3007
되어

참고문헌

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  4. Freedman, D. S., Flanders, D., Barboriak, J. J., Malarcher, A. M., Gates, L. Cigarette smoking and leukocyte subpopulations in men. Annals of Epidemiology. 6, 299-306 (1996).
  5. Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/copd/basics-about.html (2019).
  6. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. , (2014).
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  10. Shan, M., et al. Cigarette smoke induction of osteopontin (SPP1) mediates T H 17 inflammation in human and experimental emphysema. Science Translational Medicine. 4, 1-10 (2012).
  11. Yuan, X., et al. Activation of C3a receptor is required in cigarette smoke-mediated emphysema. Nature Mucosal Immunology. 8, 874-885 (2014).
  12. Yuan, X., et al. Cigarette smoke - induced reduction of C1q promotes emphysema. JCI Insight. 4, 1-17 (2019).
  13. Shan, M., et al. Agonistic induction of PPAR g reverses cigarette smoke - induced emphysema Find the latest version: Agonistic induction of PPAR γ reverses cigarette smoke - induced emphysema. Journal of Clinical Investigation. 124, 1371-1381 (2014).
  14. Hong, M. J., et al. Protective role of gd T cells in cigarette smoke and influenza infection. Nature Mucosal Immunology. 11, 834-908 (2018).
  15. Kim, M., et al. Cigarette smoke induces intestinal inflammation via a Th17 cell-neutrophil axis. Frontiers in Immunology. 10, 1-11 (2019).
  16. Lu, W., et al. The microRNA miR-22 inhibits the histone deacetylase HDAC4 to promote T H 17 cell - dependent emphysema. Nature Immunology. 16, 1185-1194 (2015).
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  19. Kheradmand, F., You, R., Gu, B. H., Corry, D. B. Cigarette smoke and DNA cleavage promote lung inflammation and emphysema. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 128, 222-233 (2017).
  20. Ha, M. A., et al. Menthol attenuates respiratory irritation and elevates blood cotinine in cigarette smoke exposed mice. PLoS ONE. , 1-16 (2015).
  21. Moreno-Gonzalez, I., Estrada, L. D., Sanchez-Mejias, E., Soto, C. Smoking exacerbates amyloid pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Nature Communications. 4, 1-10 (2013).
  22. Madison, M. C., et al. Electronic cigarettes disrupt lung lipid homeostasis and innate immunity independent of nicotine. Journal of Clinical Investigation. 129, 4290-4304 (2019).

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