Summary
Bitki türevi ürünlerin antifungal etkilerini ölçmek için tasarlanmış modifiye edilmiş bir agar bazlı yöntemi açıklıyoruz. Antifungal aktiviteye hem uçucu hem de uçucu olmayan katkılar bu protokol ile değerlendirilebilir. Ek olarak, mantarlara karşı etkinlik tek bir deneysel kurulumda önemli gelişim aşamalarında ölçülebilir.
Abstract
Açıklanan protokol, mikroorganizma miktarlarının ve gelişim aşamalarının doğru belirlenmesini sağlayan bir tak-transfer tekniğine dayanmaktadır. Belirtilen sayıda spor bir agar tabağına yayılır. Bu agar plakası, inkübasyonun gerekli olmadığı sporlar dışında mantarların beklenen gelişim aşamasına ulaşmasını sağlamak için belirli bir süre kuluçkaya yatırılır. Sporlar, hyphae veya miselyum ile kaplı agar fişleri daha sonra çekilir ve mantarlardan uzak bir yere veya temas halinde test edilecek antifungal bileşiği içeren agar ortamına aktarılır. Bu yöntem hem sıvı özleri hem de katı numuneleri (tozları) test etmek için geçerlidir. Özellikle uçucu ve uçucu olmayan ajanların biyoaktif karışımlardaki göreceli katkılarını ölçmek ve özellikle sporlar, erken hyphae ve miselyum üzerindeki etkilerini belirlemek için çok uygundur.
Yöntem, biyokontrol ürünlerin, özellikle bitki kaynaklı ürünlerin antifungal aktivitesinin karakterizasyonu için son derece önemlidir. Gerçekten de, bitki tedavisi için, sonuçlar uygulama modu seçimine rehberlik etmek ve tetik eşiklerini belirlemek için kullanılabilir.
Introduction
Küresel meyve ve sebze kayıpları üretimin% 50'sine kadar ulaşabilir1 ve çoğunlukla tarlada veya hasat sonrası depolama sırasında mantar bozulmasının neden olduğu gıda çürümesinden kaynaklanabilir2,3, yirminci yüzyılın ortalarından bu yana sentetik mantar öldürücülerin kapsamlı istihdamına rağmen4. Bu maddelerin kullanımı, ciddi çevresel ve sağlık tehlikelerini temsil ettiği için yeniden gözden geçiriliyor. Kullanımlarının zararlı sonuçları ekosistemler boyunca ortaya çıktıkça ve potansiyel sağlık etkilerinin kanıtları biriktiğinden5,6, hasat öncesi ve sonrası tedaviler için eski profilaktik stratejilere yeni alternatifler geliştirilmektedir7,8,9. Bu yüzden karşılaştığımız zorluk ikiye katlanıyor. Yeni mantar öldürücü stratejiler, öncelikle fitopatojenlere karşı gıda korumanın etkinlik düzeylerini korumalı ve ikinci olarak, tarım uygulamalarının çevresel ayak izini önemli ölçüde azaltmaya katkıda bulunmalıdır. Bu iddialı hedefi gerçekleştirmek için, antimikrobiyal özellikleri için 1000'den fazla bitki türü vurgulandığı için bitkilerde geliştirilen doğal savunmalardan ilham alan stratejiler önerilmektedir8. Örneğin, fitopatojenlerle savaşmak için doğal mantar öldürücüler geliştiren bitkiler, yeni biyokontrol ürünlerinin geliştirilmesini keşfetmek için yeni bir kaynaktır2. Uçucu yağlar bu tür amiral gemisi molekülleridir. Örneğin, Origanum esansiyel yağı domates bitkilerini seralarda gri küfe karşı korur 10 ve Solidago canadensis L. ve cassia esansiyel yağlarının hasat sonrası çilekleri gri küf hasarından koruduğu gösterilmiştir11,12. Bu örnekler, biyokontrol ve özellikle bitki kaynaklı ürünlerin biyolojik etkinlik ve çevresel sürdürülebilirliği birleştiren bir çözümü temsil ettiğini göstermektedir.
Bu nedenle, bitkiler mahsul koruma endüstrisi için potansiyel ilgi alanı olan moleküllerin önemli bir kaynağıdır. Bununla birlikte, genellikle güvenli, fitotoksik olmayan ve çevre dostu olarak kabul edilseler de biyokontrol ürünleri olarak kullanılmak üzere sadece bir avuç bitki ürünü önerilmiştir2. Laboratuvardan alana transpozisyonda, in vivo2,9'dauygulandıktan sonra etkinliğin azalması gibi bazı zorluklar gözlenmiştir. Bu nedenle, laboratuvar testlerinin alan etkinliğini daha iyi tahmin etme yeteneğini geliştirmek önemli hale gelir. Bu bağlamda, bitki kaynaklı ürünler için antifungal test yöntemleri hem antifungal etkinliklerini değerlendirmek hem de kullanım için en uygun koşullarını tanımlamak için gereklidir. Özellikle, biyokontrol ürünleri genellikle kimyasal mantar öldürücülerden daha az verimlidir, bu nedenle uygun formülasyonlar önermek, alanlardaki uygulama modunu tanımlamak ve patojenin hangi gelişim aşamasının aday biyoproduct'a karşı savunmasız olduğunu tanımlamak için eylem modlarının daha iyi anlaşılması önemlidir.
Antibakteriyel ve antifungal aktiviteleri ele alan güncel yaklaşımlar arasında agar-disk difüzyonu, seyreltme, biyoautografi ve akış sitometrisi gibi difüzyon yöntemleri yer almaktadır.13. Bu tekniklerin çoğu ve daha spesifik olarak, standart antifungal duyarlılık testi - agar-disk difüzyon ve seyreltme tahlilleri - sıvı süspansiyonlardaki bakteriyel ve mantar sporları üzerindeki çözünür bileşiklerin antimikrobiyal aktivitesini değerlendirmek için iyi uyarlanmıştır.14. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle kurutulmuş bitki tozu gibi katı bileşiklerin test etmek veya miselyum büyümesi sırasında antifungal aktiviteyi ölçmek için uygun değildir, çünkü agar plakalarına yayılan spor seyreltme veya spor ve/ veya antifungal bileşiklerin seyreltilmesini gerektirirler.13. Gıdadan zehirlenen yöntemde, antifungal ajanı içeren agar plakaları, miselyuma başlamanın kesin miktarı dikkate alınmadan 7 günlük bir mantar kültüründen örneklenen 5-7 mm çapında bir diskle aşılanır. İnkübasyondan sonra, antifungal aktivite radyal büyüme inhibisyonunun bir yüzdesi olarak belirlenir.17,18,19. Bu yaklaşımla misel büyümesi üzerindeki antifungal aktiviteyi değerlendirebiliriz. Buna karşılık, agar seyreltme yöntemi, antifungal bileşikleri içeren agar plakasının yüzeyine doğrudan aşılanan sporlar üzerindeki antifungal aktiviteyi belirlemek için gerçekleştirilir.13,20,21. Bu iki yaklaşım antifungal aktivite üzerinde tamamlayıcı sonuçlar verir. Bununla birlikte, antifungal bileşiklerin sporlar ve miselyum üzerindeki göreceli etkinliğinin doğru bir şekilde yan yana karşılaştırılmasını sağlamayan paralel olarak kullanılan iki bağımsız tekniktir.17,20,22 başlangıç mantar malzemesi miktarı iki yaklaşımda farklılık gösterir. Ayrıca, bitki türevi bir ürünün antifungal aktivitesi genellikle bitkiler tarafından sentezlenen antifungal moleküllerin patojenlerle yüzleşmek için birleştirilmesinden kaynaklanır. Bu moleküller proteinleri, peptitleri kapsar23,24ve polifenoller, terpenler, alcaloïds gibi farklı molekül sınıflarına ait ve geniş kimyasal çeşitliliğe sahip metabolitler25, glukozinolatlar8ve organosülfur bileşikleri26. Bu moleküllerin bazıları patojen saldırısı sırasında uçucudur veya uçucu hale gelir27. Bu ajanlar genellikle, bazıları antimikrobiyal faaliyetleri iyi kurulmuş olan uçucu yağlar olarak su damıtma yoluyla geri kazanılması gereken zayıf suda çözünür ve yüksek buhar basınçlı bileşiklerdir.28. Buhar fazı ile buharlaşma ve göçten sonra uçucu bileşiklerin antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için buhar fazı aracılı duyarlılık tahlilleri geliştirilmiştir.29. Bu yöntemler, mikrobiyal kültürden uzak bir mesafede antifungal bileşiklerin tanıtılmasına dayanmaktadır.29,30,31,32,33. Yaygın olarak kullanılan buhar fazlı agar tahlilinde, uçucu yağlar bir kağıt diske biriktirilir ve agar ortamına yayılan bakteriyel veya mantar sporları süspansiyonundan uzakta Petri kabının kapağının ortasına yerleştirilir. Büyüme inhibisyon bölgesinin çapı daha sonra agar-disk difüzyon yöntemi ile aynı şekilde ölçülür.20,24. İnhibitör buhar faz aracılı antimikrobiyal aktivitenin hesap edildiği et suyu seyreltme yönteminden elde edilen esansiyel yağların buhar fazı antifungal duyarlılığının nicel ölçümünü sağlamak için başka yaklaşımlar geliştirilmiştir.32veya agar-disk difüzyon testlerinden türetilmiştir31. Bu yöntemler genellikle buhar fazı aktivite çalışmalarına özgüdür ve temas-inhibisyon testlerine uygun değil. Bu, uçucu ve uçucu olmayan ajanların karmaşık bir biyoaktif karışımın antifungal aktivitesine göreceli katkısının belirlenmesini önler.
Geliştirdiğimiz nicel yöntem, kurutulmuş bitki tozunun kontrollü miktarlarda sporlar üzerindeki antifungal etkisini ölçmeyi amaçlamaktadır ve bitkilerin enfeksiyonu sırasında fitopatojenlerin havadan büyümesini çoğaltmak için bir agar ortamının yüzeyinde biriken miselyum15 ve birbirine bağlı bir misel ağı16. Yaklaşım, aynı deneysel kurulumda hem uçucu hem de uçucu olmayan antifungal metabolitlerin katkısının yan yana ölçülmesine izin veren agar seyreltme ve gıdadan zehirlenmiş yöntemlere dayanan değiştirilmiş bir deneysel kurulumdur. Bu çalışmada, yöntem iyi karakterize edilmiş üç antifungal preparatın aktivitesi ile karşıttır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inocula hazırlığı
- Deneyden önce, 5 μL Trichoderma spp döşeyin. SBT10-2018 sporları patates dekstroz agar ortamında (PDA) 4 °C'de saklanır ve konidia oluşumunu teşvik etmek için düzenli ışığa maruz kalarak 30 °C'de 4 gün kuluçkaya yatar42 (Şekil 1, panel A).
NOT: Trichoderma spp. SBT10-2018 ahşaptan izole edilmiştir ve hızlı büyümesi ve spor kurtarma kolaylığı için bu çalışmada model olarak kullanılmaktadır. Bu suş laboratuvarımız tarafından korunuyor. - Conidia'yı kurtarın (Şekil 1, panel A)
- Trichoderma miselyum üzerine 3 mL% 0.05 Tween-20 döşeyin.
- Konidiayı konidiophores'tan serbest bırakmak için bir tırmık kullanın; hyphae'nin yırtılmasını önlemek için miselyuma bastırmaktan kaçının.
- Agar ortamı tarafından emilmemesi için çözeltiyi bir mikropipette ile hızla kurtarın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Hemositometre kullanarak toplam spor sayısını sayın ve 3 x 106 spor/mL içeren bir çözelti hazırlayın.
NOT: Hyphae'nin ayıklanmasını önlemek için bu adım dikkatlice gerçekleştirilmelidir. Spor hazırlığı daha sonra mikroskop altında kontrol edilir. Sonunda, son derece havadan ve kabarık miselyum sunan suşlar için, artık miselyum parçasını ortadan kaldırmak için 40 μM süzgeç filtresi kullanarak bir filtrasyon adımı eklenebilir.
2. Mantar plakalarının hazırlanması(Şekil 1,panel B)
- 925 spor/5 mm çaplı agar fişine karşılık gelen4.800 spor/cm 2 elde etmek için PDA ortamı içeren 9 cm çapında petri kabı üzerine bir mikropipette ile 3 x 10 6 spor/mL'nin 100 μL'sini biriktirin.
- Steril bir spatula ile 10 g 2 mm çapında cam boncuk ekleyin ve sporları agar yüzeyine eşit olarak dağıtmak için operatörün koluna paralel ve dik ileri ve geri hareketler gerçekleştirin.
- Plakayı 90° döndürün ve dönen hareketleri tekrarlayın (bölüm 2.2'de olduğu gibi); plaka tamamen döndürülene kadar bu adımları tekrarlayın.
- Sporları gerektiren deneyler ayarlamak veya erken hyphae veya miselyum gerektiğinde plakaları 17 saat veya 24 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırmak için hemen plakayı kullanın.
NOT: Miselyum tak-devret ve miselyum disk aktarımı sonrası ölçülen antifungal aktiviteyi karşılaştırmak için steril cımbız kullanın ve steril 5 mm selüloz diskleri spor yayıldıktan sonra agar plakasının yüzeyine rastgele yerleştirin.
3. Antifungal bileşiklerin hazırlanması
- Bitki türevi ürün hazırlama: sarımsak-toz hazırlama
- Taze sarımsak karanfillerini soyun ve karanfilleri neşter bıçağı kullanarak 2-3 mm genişliğinde dilimler halinde kesin.
- Dilimleri 40 °C'de 2 gün boyunca havayla kurulayın.
- İnce bir toz elde etmek için dilimleri bir bıçak değirmeni kullanarak 3 x 15 saniye boyunca öğütün.
- Sarımsak tozlarını kullanmadan önce 50 mL tüplerde 4 °C'de saklayın.
NOT: Sarımsak otomatik olarak kapatılmayacağı için (sıcaklığa duyarlı antifungal bileşiklerin bozulmasını önlemek için) öğütücüyü, neşteri ve hava kurutucuyu kullanmadan önce% 70 etanol ile temizleyin.
- Uçucu yağ hazırlama
- %0,5, %1, %2,5, %5 ve %20 Timus vulgaris uçucu yağ çözeltilerini %0,5 Ara-80'de hazırlayın.
- PDA ortamına eklemeden önce bir emülsiyon oluşturmak için iyice karıştırın (bkz. bölüm 4.2).
- Carbendazim hazırlığı
- 200 mg/L etanol çözeltisi hazırlamak için carbendazim'i tartın (carbendazim suda zayıf çözünür).
- Çözeltiyi PDA ortamına eklemeden önce oda sıcaklığında saklayın (bkz. bölüm 4.2).
DİkKAT: Carbendazim sağlık ve çevresel tehlike arz eder. Bu ürünü kullanırken eldiven ve maske takın. Havalandırılmış bir alanda saklayın.
4. Temas-inhibisyon tahlilleri
- Sarımsak tozu içeren agar plakalarının hazırlanması
- PDA ortamını hazırlayın ve otoklavlayın.
- Genellikle 0,25 mg/mL ile 16 mg/mL arasında değişen konsantrasyonlar elde etmek için istenen sarımsak tozu miktarını steril bir spatula kullanarak 50 mL'lik bir tüpe tartın.
- Bileğin iç kısmına ortamın sıcaklığını kontrol ettikten sonra 10 mL PDA ekleyin. Hassas moleküllerin bozulmasını önlemek için sıcaklık mümkün olduğunca düşük olmalıdır. İdeal olarak, bu sıcaklık 45 ° C olmalıdır.
- Tozu PDA ortamına eşit olarak dağıtmak için tüpü ters çevirerek dikkatlice homojenize edin. 5 cm çapında bir Petri kabına (Şekil 1 , panel C)10mL hızla dökün.
- Petri kabı oda sıcaklığına yerleştirilmişken, agar katılaşana kadar bekleyin.
- Esansiyel yağ veya karbendazim içeren agar plakalarının hazırlanması
- 50 mL'lik bir tüpe 10 mL PDA sok. Bölüm 4.1.3 için sıcaklığı kontrol edin.
- %0,005, %0,01, %0,025, %0,05 ve %0,2 çözüm elde etmek için PDA'daki Thymus vulgaris esansiyel yağının farklı çözeltilerinden 100 μL ekleyin (bkz. bölüm 3.2.1).
- 0.0625-2 mg/L arasında değişen çözümler elde etmek için 200 mg/L çözeltisinden gerekli karbendazim hacmini ekleyin (bkz. bölüm 3.3.1).
- Tüpü ters çevirerek dikkatlice homojenize edin, 5 cm çapında bir Petri kabına 10 mL hızla dökün(Şekil 1, panel C).
- Petri kabı oda sıcaklığına yerleştirilmişken, agar katılaşana kadar bekleyin.
- Temas inhibisyon tahlilleri (Şekil 1)
- 5 mm çapında steril paslanmaz çelik boru ile, antifungal bileşikler de dahil olmak üzere PDA veya PDA içeren Petri kaplarının ortasına bir daire çizin. Agar silindirini steril bir kürdan (panel C) kullanarak atın.
- 5 mm çapında steril paslanmaz çelik boru ile bölüm 2'den mantar plakalarına rastgele daireler çizin. Plaka başına 15-20 daire (panel B) arasında çizim yapın.
- Sporlar, erken hyphae veya miselyumla kaplı agar silindirlerini steril bir kürdanla dikkatlice çekin ve fişleri antifungal bileşikler (panel C) dahil olmak üzere PDA veya PDA içeren Petri tabaklarının boş alanına yerleştirin.
- Spor içeren plakaları 30 °C'de 48 saat, erken hyphae içeren plakalar için 31 saat ve miselyum (panel C) ile kaplı plakalar için 24 saat kuluçkaya yatırın.
- Radyal büyümenin çapını ölçün ve formülü kullanarak mantar büyümesi inhibisyonunun kontrol üzerindeki yüzdesini hesaplayın (panel D)
% mantar büyüme inhibisyonu = (C - Klima)* 100
burada C, PDA ortamında radyal büyümenin çapı ve antifungal bileşikleri içeren PDA ortamında radyal büyümenin çapıdır.
NOT: Miselyum tak-devret ve miselyum disk aktarımı sonrası ölçülen antifungal aktiviteyi steril cımbız kullanarak karşılaştırmak için, daha önce antifungal bileşikler içeren PDA veya PDA içeren Petri kaplarının ortasına mantar plakalarının yüzeyine (bölüm 2 not) bir adet 5 mm çapında disk aktarın ve tam olarak agar-plug transferine devam edin
5. Buhar Fazı inhibisyon tahlilleri
- Sarımsak tozu içeren agar plakalarının hazırlanması
- Bölüm 3.1'deki gibi devam edin.
- Esansiyel yağ veya karbendazim içeren agar plakasının hazırlanması
- Bölüm 3.2 ve 3.3'teki gibi devam edin.
- Mantar plakalarının hazırlanması
- Bölüm 2'deki gibi devam edin.
- Buhar fazlı antifungal inhibisyon tahlili (Şekil 1)
- 10 mL PDA ortamı içeren 5 cm çapındaki Petri kaplarının kapağına 10 mL PDA ortamı veya antifungal bileşikler içeren 10 mL PDA ortamının kapağına tabakların dibine dökün. Agarın oda sıcaklığında (panel C) tamamen katılaşmasını bekleyin.
- Kapağın ortasında bir PDA çemberi elde etmek için kalibrasyon aracı olarak 50 mL santrifüj tüp kullanın; PDA'yı steril bir spatula (panel C) ile dairenin etrafından çıkarın.
- 5 mm çapında steril paslanmaz çelik boru ile kapağın içine yerleştirilmiş PDA ortamının ortasına bir daire çizin. Agar silindirini steril bir kürdanla (panel C) atın.
- Bölüm 4.3.2'de (panel B) olduğu gibi mantar plakalarına rastgele 5 mm çapında steril paslanmaz çelik boru ile fişler takın.
- Steril bir kürdan kullanarak, sporlar, erken hyphae veya miselyum ile kaplı fişleri mantar plakalarından tahlil plakalarının kapaklarına (panel C) dikkatlice aktarın.
- Bölüm 4.3.4'te olduğu gibi 30 °C'de kuluçkaya yatır (C paneli).
- Radyal büyümenin çapını ölçün ve bölüm 4.3.5'teki (panel D) formülü kullanarak mantar büyüme inhibisyonunun yüzdesini hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nicel yöntemin farklı antifungal bileşiklerin etki şeklini ayırt etme yeteneğini değerlendirmek için, üç iyi bilinen antifungal ajanın etkinliğini karşılaştırdık. Carbendazim, bitkilerde çok çeşitli mantar hastalıklarını kontrol etmek için yaygın olarak kullanılan uçucu olmayan sentetik bir mantar ilacıdır39,40. Timus vulgaris esansiyel yağı büyük ölçüde antibakteriyel ve antifungal aktivitesi için tanımlanmıştır ve doğal gıda koruyucu ajanolarak 41. Sarımsak tozu, bitkiden elde edilen bir biyoproduct modeli olarak seçilmiştir. Geleneksel olarak, büyük ölçüde uçucu organosülfur bileşiklerinin varlığına atfedilen antimikrobiyal aktivitelerle doğal bir ilaç olarak kullanılmıştır, aynı zamanda uçucu olmayan saponinlerin ve fenolik bileşiklerin varlığına da atfedilmiştir26Bu modele bu çalışmada ilgili bir karmaşıklık vermektedir.
Bu nicel yöntem, sporlardan miselyuma kadar farklı gelişim aşamalarında kontrollü miktarlarda mantar içeren agar tıkaçlarının transferine dayanırken, gıdadan zehirlenen yöntemde, 5 günlük ila 7 günlük miselyum selüloz disklerden aktarılır13. Tahlilde mantar malzemesi olarak sporlar, erken hyphae (17 saat inkübasyon) ve miselyum (24 saat inkübasyon) kullanılmıştır. Disk aktarımının kullanımı, conidia veya artık hyphae'nin disk aktarımı sonrası en azından kısmen agar ortamında kalması nedeniyle ilgili olmayabilir, daha sonra Şekil 2'degösterildiği gibi büyüme inhibisyonunun yanlış ölçümüne yol açtı. Selüloz disklerin altında bulunan agar alanlarının aktarılmasından sonra farklı mantar-radyal büyüme çapları gözlenmiş ve ardından disk transferinde agar üzerinde artık mantar hyphae varlığını vurgulayan 24 h inkübasyon(Şekil 2, paneller A, B ve C) gözlenmiştir. Kalıntı hyphae'nin nicelemesi% 22 çapa kadar değişkenliğe yol açan büyüme ölçümü ile doğrulanmıştır(Şekil 2, panel D). Büyüme inhibisyonu üzerindeki etkisi daha sonra antifungal bileşik olarak Thymus vulgaris esansiyel yağı kullanılarak ve agar-plug transferi sonrası elde edilen inhibisyon ile karşılaştırıldığında değerlendirildi(Şekil 2, panel E). Disk aktarımından sonra büyüme inhibisyonu, düşük Timus yağ konsantrasyonları için agar-plug transferinden daha yüksekti ve mantar malzemesinin eksik transferinden kaynaklanabilecek ve agar-plug transferine dayalı yaklaşımı destekleyebilecek inhibitör etkinin aşırı tahmin edilmesine yol açtı.
Trichoderma spp. Üç antifungal bileşik tarafından tetiklenen SBT10-2018-büyüme inhibisyonu daha sonra her mantar aşaması için temas ve buhar fazı inhibisyon tahlilleri kullanılarak değerlendirildi (Şekil 3). Sporlar 4.800 spor/cm2elde etmek için agar plakalarına dikkatlice yayılmıştır. Doğrudan 5 mm steril paslanmaz çelik tüp kullanılarak agar-plug ekstraksiyonu yoluyla antifungal bileşikler içeren agar plakalarına aktarıldılar ve deneyin sporlardan başlamasını sağladılar. Diğer iki gelişim evresi için, sporlarla kaplı agar plakaları, hyphae (17 h) ve miselyum oluşumunun (24 saat) çimlenmesine ve erken gelişimine izin vermek için agar fişini aktarmadan önce 30 °C'de 17 saat veya 24 saat kuluçkaya yatırıldı(Şekil 3, panel A). Aktif uçucu moleküllerin genel antifungal aktiviteye katkısını ölçmek için, temas inhibisyon tahlili uyarlanmış ve temas-inhibisyon testine olduğu gibi PDA ortamına dökülen antifungal bileşiklerden bir mesafeye sporlar, erken hyphae ve miselyum yerleştirilmiştir. Trichoderma-radyal büyüme 48 saat boyunca ölçüldü ve inhibisyon yüzdesi kontrol koşullarına göre belirlendi. Minimum inhibitör konsantrasyon (MIC), 30 °C'de 48 saat inkübasyondan sonra görünür büyümeyi önleyen en düşük antifungal bileşik konsantrasyonu olarak tanımlanmıştır.
Şekil 3(panel B), Trichoderma ve antifungal bileşikler temas halindeyken sırasıyla 0.25 μg/mL karbendazimde sırasıyla %50, %22 ve %30 büyüme inhibisyonu ile erken hyphae ve miselyum ağlarına kıyasla karbendazime karşı daha yüksek spor duyarlılığı göstermektedir. Buna ek olarak, spor çimlenmesinde 0,5 μg/mL'lik bir MIC değeri tahmin edilirken, erken hyphae uzaması ve miselyumda 0,75 μg/mL'ye bir artış elde edilmiştir. Bunun aksine, mantar bu maddenin düşük volatilitesine uygun olarak mantar ilacının uzaklığına yerleştirildiğinde carbendazim'in Trichoderma üzerinde antifungal bir etkisi yoktu. Antifungal bileşik olarak Thymus vulgaris esansiyel yağı (TEO) kullanılarak elde ettiğimiz sonuçlar (Şekil 3, panel C) teo'ya karşı daha yüksek bir spor duyarlılığı göstermiştir erken hyphae ve miselyum ile karşılaştırıldığında% 65 ve yaklaşık% 50 büyüme inhibisyonu sırasıyla% 0.01 TEO'da. Elde edilen MIC değerleri spor çimlenmesi ve erken hyphae uzama (%0.025 TEO) için benzer, miselyum büyümesi için daha yüksek (%0.05 TEO) idi. Beklendiği gibi, Thymus vulgaris esansiyel yağı, mantar ve yağ arasında mesafe beTpectek bağımsız olarak aynı antifungal aktiviteyi sundu. Benzer MIC değerleri (%0.025 TEO) temas ve buhar fazı tahlilleri için spor çimlenmesi ve erken hyphae uzaması üzerinde elde edildi, ancak daha düşük yüzdede TEO ve Trichoderma sporları temas halindeyken daha yüksek bir duyarlılık gözlenmiştir (temas halinde% 60 büyüme inhibisyonu ve uzaktan% 45 büyüme inhibisyonu). Şaşırtıcı bir şekilde, miselyumda elde edilen MIC değerleri temas ve buhar fazı inhibisyon testlerinde farklıydı (%0.05'e karşı %0.1) uçucu moleküllerin bir kısmının iyi gelişmiş bir miselyuma karşı aktif olmadığını öne sürüyor. Son olarak, sarımsak tozu antifungal bileşik olarak kullanılırken (Şekil 3, panel D), spor çimlenmesine (0,25 mg/ mL sarımsak tozunun% 50 büyüme inhibisyonu ve 0,5 mg / mL MIC değeri) ve erken hyphae uzaması karşı daha yüksek bir etkinlik gözlenmiştir. (0.25 mg/mL'de %59 büyüme inhibisyonu ve 0.5 mg/mL MIC değeri) miselyum büyümesine göre (%29 büyüme inhibisyonu 0.5 mg/mL sarımsak toz ve MIC değeri 0.75 mg/mL). Temas ve buhar fazı tahlilleri karşılaştırıldığında, sonuçlar mantarın gelişim aşamasından bağımsız olarak antifungal aktivitede önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. MIC değerleri spor çimlenmesi için 0,5 mg/mL'den 1 mg/mL'ye, erken hyphae uzaması için 0,5 mg/mL'den 2 mg/mL'ye ve miselyum büyümesi için 0,75 mg/mL'den 4 mg/mL'ye taşındı (Temsili resimler içinŞekil 3, panel D ve Şekil 4). Bu nedenle, bu sonuçlar sarımsak tozunun antifungal özelliklere sahip hem uçucu hem de uçucu olmayan bileşiklerin bir karışımını içerdiğini göstermektedir.
Tamamen, bu sonuçlar, bitki türevli ürünlerde bulunan uçucu ve uçucu olmayan ajanların göreceli katkısının, deneysel koşullar karşılaştırılabilir olduğu için farklı mantar büyüme aşamalarında belirlenebileceğini göstermektedir. Bu yaklaşım daha sonra özellikle antifungal bileşiklerin karmaşık karışımları için çok uygundur. Timus vulgaris esansiyel yağı uçucu bileşiklerin bir karışımıdır ve spor çimlenmesi ve erken hyphae uzaması için uzakta ve temas halinde benzer bir aktivite gösterir, bu buhar fazı ve temas-inhibisyon testinin karşılaştırılmasını destekler ve buhar fazına göçün agar ortamına dökülerek bozulmadığını vurgular. Sonuçlar ayrıca, bu çalışmada model olarak kullanılan sarımsak tozunun, genel antifungal aktivitede önemli bir katkısı olan ve allium27,28'denelde edilen uçucu tiyosülfinatlar lehine ihmal edilen uçucu olmayan aktif bileşenler içerdiğinin altını çizmektedir.
Şekil 1: Temas ve buhar fazı tahlilleri için protokolün sinoptik şeması Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Selüloz diskten mantar transferi ile ilişkili yanlışlık. A. Sporlarla kaplı agar plakalarına disk transferini ve antifungal bileşikler içeren agar plakalarında yüzeye disk transferini temsil eden şema B. Selüloz diskleri altındaki alanların agar transferini temsil eden şema ve ardından inkübasyon ve artık büyüme ölçümü. C. Selüloz diskleri altındaki alanların artık miselyumdan sonra transferinin radyal büyümesinin temsili resmi. D. Artık miselyumun radyal büyüme ölçümü. E. Timus vulgaris esansiyel yağının selüloz disk veya agar-plug'ten aktarılan miselyumun büyümesi üzerindeki etkisi (N=2, ortalama ± SD) Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sporlar, erken hyphae ve miselyum üzerinde buhar fazı ve temas inhibisyonu tahlilleri kullanılarak antifungal aktivitelerin karşılaştırılması. A. Trichoderma sporlarının temsili resimleri, erken hyphae (17 h büyüme) ve miselyum (24 saat büyüme). Carbendazim (B), Timus vulgaris esansiyel yağı (C) ve sarımsak tozu (D) ile trichoderma büyüme inhibisyonu. (N=2, ortalama ± SD) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Temas halinde agar plakalarında sarımsak antifungal aktivitesinin temsili resimleri- (A) veya buhar fazı (B) inhibisyon tahlilleriBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek içinlütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yaklaşım, minimum işlenmiş bitki türevi ürünlerin antifungal özelliklerinin değerlendirilmesine izin verir. Bu protokolde, agar yüzeyindeki sporların homojen dağılımı 2 mm cam boncuk kullanılarak elde edilir. Bu adım, boncukları düzgün bir şekilde dağıtmak ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için elleçleme becerilerini gerektirir ve sonuçta mantar büyümesinin farklı aşamalarında antifungal etkilerin karşılaştırılmasına izin verir. Yayılma sırasında homojenizasyon sırasında 5 mm cam boncuk veya aşırı dönmenin değişken büyüme çapına neden olabileceğini gördük. Bu nedenle, denemeden önce spor dağılımında ustalaşmak için eğitim öneriyoruz. Ek olarak, bitki tozlarının test edilmesi gerektiğinde, ürünün agar ortamına homojen dağılımına dikkat edilmelidir. Tozun plakanın dibine yerleşmesini önlemek için, erimiş ortamın sıcaklığı 45 °C'ye ulaştığında (oda sıcaklığı 24 °C olduğunda) ürünün agar ortamına karıştırılması gerekir. Bu sıcaklık, çökeltiyi önlemek için yerel oda sıcaklığına göre ayarlanmalıdır.
Burada tarif ettiğimiz yöntem değerli içgörüler sağlayabilirken, birkaç dezavantaj göz önünde bulundurulmalıdır. Bu yöntem, cevaplanması gereken sorulara bağlı olarak hazırlanacak agar plakalarının sayısı büyük olabileceği için önemli miktarda hazırlık süresi pahasına tek bir deneysel kurulumda doğru ve yan yana karşılaştırmalara olanak tanır. Ek olarak, bu test 5 cm Petri yemekleri için tasarlanmış orta ölçekli bir tahlildir. Bu nedenle, tüm yönleri test etmek için gereken aktif madde miktarı önemli olabilir. Bu, nadir maddelerin bu protokol için uygun test adayları olmayabileceği anlamına gelir. Tahlil ölçeğinin küçültilmesi, daha küçük Petri tabakları kullanılarak ve fişlerin boyutunun azaltılması düşünülebilir. Bu, burada açıklanan kıyaslama protokolü kullanılarak, agar-plug ekstraksiyonu için özel dikkat ile test edilebilir, bu da zor olabilir. Radyal büyüme ölçümlerinin doğruluğu bu küçük ölçekte azaltılabilir.
Mevcut yöntemler çözeltideki bileşiklerin antifungal aktivitesini ölçmek için uygundur ve tozların incelenmesi için daha az uygulanabilir13. Oluşturduğumuz yaklaşım, minimal işlenmiş bitki türevi ürünlerin antifungal özelliklerinin değerlendirilmesini sağlayan hem sıvı hem de katı bileşikler için iyi uyarlanmıştır. Bu, özleri test etmek için gereken süreyi azaltır ve zayıf çözünürlük gösteren aktif maddelerle ilgili tuzakları azaltır. Bazı bitki türevli ürünler yüksek sıcaklığa duyarlı aktif moleküller içerdiğinden43Bu, bu tür bileşiklerin aktivite kaybı riskini sınırlama avantajı sunar. Bu yaklaşım, benzer deneysel ayarlar kullanılarak farklı mantar büyüme aşamalarında antifungal aktivitelerin doğrudan karşılaştırılmasını sağlamak için agar-difüzyon yönteminden ve gıdadan zehirlenmişyöntem 15 ,16,17 , 18 , 19'dan uyarlanmıştır. Agar-plug transferi, test içindeki mikroorganizma miktarlarının doğru kontrolünü sağlar. Bu, disk aktarımı üzerinde bir avantajdır, bu da sporların veya hyphae'nin eksik transferi ile ilişkili antifungal etkilerin aşırı tahmin edilmesine yol açar. Son olarak, buhar fazı tahlilleri genellikle temas inhibisyon tahlilleri27,28,29,30,31, önerdiğimiz yöntem, bitki tozları veya özler gibi karmaşık karışımlarda bulunan uçucu ve uçucu olmayan ajanların göreceli katkılarını ele almakta ve sonuçta antifungal aktivitelerin farklı mantar büyüme aşamalarında değerlendirilmesine izin vermektedir.
Burada tarif ettiğimiz yaklaşım, biyokontrol için bitki türevi ürünlerdeki antifungal özellikleri değerlendiren yöntemlere olan ihtiyacı desteklemek için özellikle ilgili olabilir. Önerdiğimiz nicel yöntem, operatörlerin uçucu ve uçucu olmayan bileşiklerin karmaşık bir biyoaktif karışımın antifungal aktivitesine ilgili katkılarını belirlemelerini sağlar. Bu, tedavi için uygulama modlarının seçimine ve sıvı ekstraksiyonunun uygunlığına rehberlik edebilecek değerli bilgiler sağlar. Hedeflenen fitopatojenden (örneğin, biyokontrol ürünün bir ambalaja dahil edilmesi) uzak bir mesafede düşünülebilecek veya biyokontrol ürünün etkinliğini optimize etmek için doğrudan temas gerekebilecek uygulamalar (bitkilere nebulizasyon veya meyveyi biyokontrol ürün çözeltisine daldırma). Ayrıca, spor çimlenmesinden daha sonraki aşama miselyum büyümesine kadar farklı mantar büyüme aşamalarında antifungal etkinliğin karşılaştırılmasını sağlar, bu da ürünlere biyokontrol ürünleri uygulamak için gereken kontrol eşikleri oluşturmak için önerilerin tanımlanmasına yol açar. Gerçekten de, maddelerin etkinliğini farklı mantar aşamalarında tanımlamak, maddelerin önleyici veya iyileştirici tedaviler olarak kullanılıp kullanılmayacağını kategorize etmeye ve biyokontrol ürünlerle bitki tedavileri için programı planlamaya yardımcı olabilir. Bu, tarlada veya hasat sonrası kullanıldığında ürünlerin etkinliğinden yararlanmak için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
hiç kimse
Acknowledgments
Değerli tavsiyeleri için Frank Yates'e minnettarız. Bu çalışma Sup'Biotech tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. International Journal of Food Microbiology. 166 (1), 1-14 (2013).
- Romanazzi, G., Smilanick, J. L., Feliziani, E., Droby, S. Postharvest biology and technology integrated management of postharvest gray mold on fruit crops. Postharvest Biology and Technology. 113, (2016).
- Morton, V., Staub, T.
- Brandhorst, T. T., Klein, B. S. Uncertainty surrounding the mechanism and safety of the post- harvest fungicide Fludioxonil. Food and Chemical Toxicology. 123, 561-565 (2019).
- Bénit, P., et al. Evolutionarily conserved susceptibility of the mitochondrial respiratory chain to SDHI pesticides and its consequence on the impact of SDHIs on human cultured cells. PLoS ONE. 14 (11), 1-20 (2019).
- Usall, J., Torres, R., Teixidó, N. Biological control of postharvest diseases on fruit: a suitable alternative. Current Opinion in Food Science. 11, 51-55 (2016).
- Tripathi, P., Dubey, N. K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology. 32 (3), 235-245 (2004).
- Abbey, J. A., et al. Biofungicides as alternative to synthetic fungicide control of grey mould (Botrytis cinerea)-prospects and challenges. Biocontrol Science and Technology. 29 (3), 241-262 (2019).
- Soylu, E. M., Kurt, Ş, Soylu, S. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. International Journal of Food Microbiology. 143 (3), 183-189 (2010).
- Liu, S., Shao, X., Wei, Y., Li, Y., Xu, F., Wang, H. Solidago canadensis L. essential oil vapor effectively inhibits botrytis cinerea growth and preserves postharvest quality of strawberry as a food model system. Frontiers in Microbiology. 7, 0-9 (2016).
- El-Mogy, M. M., Alsanius, B. W. Cassia oil for controlling plant and human pathogens on fresh strawberries. Food Control. 28 (1), 157-162 (2012).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Arikan, S. Current status of antifungal susceptibility testing methods. Medical Mycology. 45 (7), 569-587 (2007).
- Girmay, Z., Gorems, W., Birhanu, G., Zewdie, S. Growth and yield performance of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm (oyster mushroom) on different substrates. AMB Express. 6 (1), 87 (2016).
- Fischer, M. S., Glass, N. L. Communicate and fuse: how filamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network. Frontiers in Microbiology. 10, 1-20 (2019).
- Mohana, D. C., Raveesha, K. A. Anti-fungal evaluation of some plant extracts against some plant pathogenic field and storage fungi. Journal of Agricultural Technology. 4 (1), 119-137 (2007).
- Balamurugan, S. In vitro activity of aurantifolia plant extracts against phytopathogenic fungi phaseolina. International Letters of Natural Sciences. 13, 70-74 (2014).
- Ameziane, N., et al. Antifungal activity of Moroccan plants against citrus fruit pathogens. Agronomy for sustainable development. 27 (3), 273-277 (2007).
- Rizi, K., Murdan, S., Danquah, C. A., Faull, J., Bhakta, S. Development of a rapid, reliable and quantitative method - "SPOTi" for testing antifungal efficacy. Journal of Microbiological Methods. 117, 36-40 (2015).
- Imhof, A., Balajee, S. A., Marr, K., Marr, K. New methods to assess susceptibilities of Aspergillus isolates to caspofungin. Microbiology. 41 (12), 5683-5688 (2003).
- Goussous, S. J., Abu el-Samen, F. M., Tahhan, R. A. Antifungal activity of several medicinal plants extracts against the early blight pathogen (Alternaria solani). Archives of Phytopathology and Plant Protection. 43 (17), 1745-1757 (2010).
- Ng, T. B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides. 25 (7), 1215-1222 (2004).
- Hu, Z., Zhang, H., Shi, K. Plant peptides in plant defense responses. Plant Signaling and Behavior. 13 (8), (2018).
- Iriti, M., Faoro, F. Chemical diversity and defence metabolism: How plants cope with pathogens and ozone pollution. International Journal of Molecular Sciences. 10 (8), 3371-3399 (2009).
- Lanzotti, V., Bonanomi, G., Scala, F. What makes Allium species effective against pathogenic microbes. Phytochemistry Reviews. 12 (4), 751-772 (2013).
- Kyung, K. H.
- Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in microbiology. 3, 12 (2012).
- Bueno, J. Models of evaluation of antimicrobial activity of essential oils in vapour phase: a promising use in healthcare decontamination. Natural Volatiles & Essential Oils. 2 (2), 16-29 (2015).
- Doi, N. M., Sae-Eaw, A., Suppakul, P., Chompreeda, P. Assessment of synergistic effects on antimicrobial activity in vapour- and liquidphase of cinnamon and oregano essential oils against Staphylococcus aureus. International Food Research Journal. 26 (2), 459-467 (2019).
- Amat, S., Baines, D., Alexander, T. W. A vapour phase assay for evaluating the antimicrobial activities of essential oils against bovine respiratory bacterial pathogens. Letters in Applied Microbiology. 65 (6), 489-495 (2017).
- Feyaerts, A. F., et al. Essential oils and their components are a class of antifungals with potent vapour-phase-mediated anti-Candida activity. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Wang, T. H., Hsia, S. M., Wu, C. H., Ko, S. Y., Chen, M. Y., Shih, Y. H., Shieh, T. M., Chuang, L. C. Evaluation of the antibacterial potential of liquid and vapor phase phenolic essential oil compounds against oral microorganisms. PLoS ONE. 11 (9), 1-17 (2016).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Leadbeater, A. Recent developments and challenges in chemical disease control. Plant Protection Science. 51 (4), 163-169 (2015).
- Jin, C., Zeng, Z., Fu, Z., Jin, Y. Oral imazalil exposure induces gut microbiota dysbiosis and colonic inflammation in mice. Chemosphere. 160, 349-358 (2016).
- Kumar, R., Ghatak, A., Balodi, R., Bhagat, A. P. Decay mechanism of postharvest pathogens and their management using non-chemical and biological approaches. Journal of Postharvest Technology. 6 (1), 1-11 (2018).
- Talibi, I., Boubaker, H., Boudyach, E. H., Ait Ben Aoumar, A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied Microbiology. 117 (1), 1-17 (2014).
- Arya, R., Sharma, R., Malhotra, M., Kumar, V., Sharma, A. K. Biodegradation Aspects of Carbendazim and Sulfosulfuron: Trends, Scope and Relevance. Current Medicinal Chemistry. 22 (9), 1147-1155 (2015).
- European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance carbendazim. EFSA Journal. 8 (5), 1-76 (2010).
- Sakkas, H., Papadopoulou, C. Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils. Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (3), 429-438 (2017).
- Steyaert, J. M., Weld, R. J., Mendoza-Mendoza, A., Stewart, A. Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma. Microbiology. 156, Reading, England. Pt 10 2887-2900 (2010).
- Leontiev, R., Hohaus, N., Jacob, C., Gruhlke, M. C. H., Slusarenko, A. J. A Comparison of the antibacterial and antifungal activities of thiosulfinate analogues of allicin. Scientific Reports. 8 (1), 1-19 (2018).
- Scorzoni, L., et al. The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (3), 391-397 (2007).
