우리는 인간 1 차급성 골수성 백혈병 (AML) 견본에 있는 NKG2D 리간드 (NKG2DL) 검출을 위한 2개의 다른 염색 프로토콜을 제시합니다. 첫 번째 접근법은 융합 단백질을 기반으로 하며, 알려진 모든 잠재적으로 알려지지 않은 리간드를 인식할 수 있으며, 두 번째 프로토콜은 다중 항 NKG2DL 항체의 첨가에 의존한다.
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방법 논문
급성 골수성 백혈병의 대량 하위 집단으로부터 줄기 세포를 구별하기 위해 NKG2D 리간드 표면 검출의 두 개의 흐름 세포 측정 접근법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
동일한 환자 내에서, NKG2D 리간드 (NKG2DL) 표면 발현의 부재는 유사한 백혈병 특정 유전 돌연변이를 전송하지만 질병 개시 잠재력이 부족한 보다 분화된 상대 백혈병 세포로부터 줄기 세포 특성(소위 백혈병 줄기 세포, LSC)을 가진 백혈병 하위 집단을 구별하는 것으로 나타났다. NKG2DL은 생화학적으로 매우 다양한 MHC 클래스 I-like 자가 분자입니다. 상근 성 조건에서 건강한 세포는 일반적으로 세포 표면에 NKG2DL을 발현하지 않습니다. 대신, 이러한 리간드의 발현은 NKG2D 수용체 표현 면역 세포를 통해 용해를 통해 손상된 세포의 제거를 촉발하기 위해 세포 스트레스(예를 들어, 온코겐성 변환 또는 전염성 자극)에 노출되면 유도되어 천연 킬러(NK) 세포와 같은 면역 세포를 발현한다. 흥미롭게도, NKG2DL 표면 발현은 LSC 하위 집단에서 선택적으로 억제되어 이러한 세포가 NKG2D 매개 면역 감시를 회피할 수 있게 합니다. 여기서, 우리는 암세포에 대한 NKG2DL 표면 발현의 조사를 허용하는 2개의 상이한 유동 세포측정 방법에 대한 나란히 분석을 제시하고, 단일 리간드에 대하여 다중 항체로 염색하는 것을 포함하는 범리간 인식 및 방법을 관련시키는 방법. 이러한 방법은 NKG2DL 양성 비 LSC로부터 세포암 줄기 세포 특성을 가진 실행 가능한 NKG2DL 음성 세포 하위 집단을 분리하는 데 사용될 수 있다.
서론
NK 세포는 선행 항원 자극1없이 악성 세포 또는 스트레스가 있는 건강한 세포(예를 들어, 바이러스 감염에 의한)를 인식하고 제거할 수 있는 선천성 면역 계통의 중요한 이펙터이다. 이 과정은 자연 세포 독성 수용체(NcRs), NKG2D 및 CD16과 같은 활성 수용체의 복잡한 레퍼토리를 통해 엄격하게 조절되며, 주로 킬러 면역글로불린과 같은 수용체(KIRs)2에의해 표현되는 억제 수용체(IS) 2. 체세포에 대한 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 분자에 대한 KIRs의 결합은 자가 인식을 보장하고 NK 세포 내성을 전달합니다. 한편, 표적 세포상에서 자신의 리간드에 수용체를 활성화시키는 자기 인식및 증가된 결합의 부재는 NK 세포 매개 세포 독성1로이어지는 세포독성 과립의 방출을 유발한다. 마지막으로, NK 세포는 Ig(FcR) 2의 Fc 부분을 발현하는 표적에 활성 수용체 CD16의 결합을 함으로써 항체 의존성 세포 세포 독성(ADCC)을 발휘할 수있다. 직접적인 세포 독성 외에도, NK 세포는 적응형 면역 계통3을가진 선천적인 브리징 사이토카인 방출을 시작할 수 있다.
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프로토콜
환자 샘플은 바젤과 투빙겐 대학 병원의 윤리 검토 위원회의 승인에 따라 수집되었습니다.
1. NKG2D 융합 단백질의 바이오티니클레이션
참고: 이 단계는 제조업체의지시에 따라 생체 개화 키트(재료 표 참조)로 수행됩니다. 프로토콜의 이 단계는 염색하기 전에 적어도 24시간 수행되어야 합니다. 생체화 NKG2D 융합 단백질은 -20°C에 보관되어야 한다.
- 실온(RT)에서 바이오틴과 NKG2D 융합 단백질 튜브를 모두 해동합니다.
참고: 세포가 추가 실험용(쥐의 주입, 식민지 형성 단위 애세 등)을 위해 멸균되어야 하는 경우, 오염을 피하기 위해 라미나르 플로우 후드 하에서 융합 단백질을 재구성한다. 그렇지 않으면 각 단계는 벤치에서 수행 할 수 있습니다. - lyophilized NKG2D 융합 단백질의 50μg를 빠르게 회전시하십시오. 500μL의 인산완충식염(PBS)을 추가하여 분말을 재구성하고 P1000 마이크로파이프를 사용하여 철저히 혼합합니다.
- 100 μg/mL의 최종 재고 농도를 얻기 위해 비오틴 튜브에 NKG2DL 융합 단백질의 100 μL을 추가합니다.
- P100 마이크로파이프와 ....
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결과
여기에 제시된 두 프로토콜 모두 LSC17의알려진 마커인 CD34를 사용하여 AML LSC의 농축을 허용하며, NKG2DL 표면 발현과 함께 개별 리간드에 대한 풀링된 항체로 염색함으로써. 도 1에서,분석된 AML 샘플은 CD34 및 NKG2DL에 대해 양수이지만 부정적인 하위 집단도 존재하며, 이는 총 4개의 상이한 집단의 존재에 의해 나타난다. 우리의 데이터는 그들의 FSC와 SSC를 통해 세포의 주요 인구의 선택으로 시작하는 그 같은 염색을 위한 일반적인 게이팅 전략을 보여줍니다. 이중 및 죽은 세포는 다운스트림분석(도 1A)에서제외된다. 게이트는 FMO 컨트롤을 사용하여 양수셀(그림 1B)을적절하게 식별하도록 조정합니다.
도 1C에서,.......
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토론
여기서 우리는 인간 1차 AML 세포에서 NKG2DL 표면 발현을 검출할 수 있는 2개의 유동 세포측정 방법을 제시합니다. 우리는 두 가지 검출 방법이 다른 항체 염색체와 함께 사용될 수 있음을 보여줍니다 (예를 들어, CD34 발현을 검출). 유사한 얼룩은 또한 그밖 1 차적인 세포 모형 및 세포주에서 수행될 수 있습니다.
우리는 최근에 AML 환자 폭발의 표면에 NKG2DL의 부재가 LSC14를풍요롭게 할 수 있음을 보여주었다. AML에서, NKG2DL은 부정적이지만 NKG2DL 양성 백혈병 하위 집단은 clonogenic 및 생체 내 백혈병-발병 용량을 가지고 있다. 향후 연구는 NKG2DL 표면 발현의 부재가 다른 암 유형의 줄기 세포를 풍요롭게하는 도구로사용될 수 있는지 여부를 보여줍니다.
CD34는 AML에서 LSC를 표시하는 것으로 고전적으로 나타났지만, AM.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (179239), 암 퇴치 재단 (Zuerich), CL에 빌헬름 산더 재단 (2019.042.1), 그리고 C.L에 의료 생물 연구를위한 노바티스 재단의 보조금에 의해 지원되었다. 또한, 이 프로젝트는 마리 Skłodowska-Curie 보조금 계약 번호 765104 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 받았습니다. 바젤의 플로우 세포측정 시설에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability 염료 |
| 96 웰 플레이트 U 하단 | Sarstedt | 833925500 | 96 유세포 분석기 용 웰 플레이트 |
| APC 마우스 Anti-Human cd34 | BD | 555824 | 항체 검출 CD34 RRID : AB_398614 |
| 소 혈청 알부민 | PanReac AppliChem | A1391,0050 | 염색 성분 완충액 |
| 에틸렌디아민테트라아세트산 | Roth | 8043.1 | 염색 완충액 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | 보충된 RPMI 배지의 구성 요소 |
| FlowJo 10.2 | BD/ | Software 유세포 분석 실험을 위한 데이터 분석 가능 | |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | MICA 및 MICB RRID에 대한 1차 항체를 검출하는 2차 항체: |
| AB_1037853 Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R& D | 1299-NK-050 | 모든 NKG2DL을 검출하는 융합 단백질 RRID: |
| Human ULBP-1 항체 | R& D | AF1380 | 항체 검출 ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 항체 | R& D | AF1298 | 항체 검출 ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 항체 | R& D | AF1517 | 항체 검출 ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal 항체 | Thermo Scientific | PA5-35346 | 항체 검출 MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal 항체 | Thermo Scientific | PA5-66698 | 항체 검출 MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | NKG2DL 융합 단백질용 비오틴화 키트 |
| 인산염 완충 식염수 | 시그마 | D8537-500ML | 염색 완충액 |
| 토끼 항염소 IgG(H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | ULBPs RRID에 대한 1차 항체를 검출하는 2차 항체: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles(8-peaks) 3.0 um | Spherotech 주식회사 | RCP-30-20A | 유세포 분석 장치 유지에 사용되는 비드 |
| RPMI 배지 | Sigma Aldrich | R8758-500ML | 세포 배양 배지 |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | 보상 매트릭스 |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | 생성에 사용되는 비드비오틴화된 NKG2DL 융합 단백질 검출을 위한 연속 단계 |
참고문헌
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clini....
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재인쇄 및 허가
