장내 빌리 상피에서 오르가노이드의 3D 배양

요약

절차는 그들의 오르가노이드 형성 잠재력을 결정하기 위하여 변태를 겪고 있는 마우스 상피에서 융모의 격리를 기술합니다.

초록

장 상피에서 유기체의 clonogenicity는 그 안에 줄기 세포의 존재에 기인한다. 마우스 작은 장 상피는 지하실과 사악으로 구획된다 : 줄기와 증식 세포는 지하실에 국한된 반면, 사악한 상피는 분화 된 세포만 포함합니다. 따라서, 정상적인 장 지하실, 하지만 villi, 3D 문화권에서 오르가노이드를 초래할 수 있습니다. 여기에 설명된 절차는 줄기로 이끌어 내는 무관심을 겪고 있는 상피상에만 적용됩니다. 설명된 방법은 Smad4-loss-of-function:β-카테닌 게인-기능(Smad4KO:β-카테닌^GOF)조건부 돌연변이 마우스를 사용한다. 돌연변이는 사순에서 줄기 세포를 분화하고 생성하는 장 빌리를 일으키는 원인이 됩니다. 비차별화를 겪고 있는 장 내 의 빌리는 유리 슬라이드를 사용하여 장에서 긁어 내고, 70 μm 스트레이너에 배치하고 BME-R1 매트릭스에서 도금하기 전에 느슨한 세포 나 토굴을 걸러 내어 오르노이드 형성 잠재력을 결정합니다. 두 가지 주요 기준은 생성된 오르가노이드가 암호가 아닌 분산 된 빌루스 구획에서 개발되었는지 확인하는 데 사용되었습니다 : 1) 3D 매트릭스에서 도금 전후의 테더드 토굴의 부재를 보장하기 위해 고립 된 비방을 현미경으로 평가하고, 2) 빌리에서 오르가노이드 개발 과정을 모니터링. 빌리에서 유기성 개시는 도금 후 2 ~ 5 일 만 발생하고 불규칙한 모양으로 나타납니다, 같은 장 상피에서 crypt 유래 오르가노이드는 도금의 16 시간 이내에 명백하고 구형 나타납니다. 그러나 이 방법의 한계는 형성된 오르가노이드의 수와 비리로부터의 오르가노이드 개시에 필요한 시간은 비차별화 정도에 따라 달라지므로 이다. 따라서, 돌연변이의 특이성 또는 비차별화를 일으키는 모욕에 따라, 그들의 오르가노이드 형성 잠재력을 분석하기 위하여 빌리를 수확할 수 있는 최적 단계는 경험적으로 결정되어야 합니다.

서론

장 내 지하실은 빌리가 아니라, Matrigel 또는 BME-R1 매트릭스에서 배양 할 때 오르가노이드를 형성합니다. 이러한 오르가노이드는 생체 내 장 상피에 존재하는 다양한 분화 계보, 선조 및 줄기 세포의 존재로 인해 종종 "미니 창자"라고도 하는 자가 조직 구조입니다. 토굴에서 오르가노이드를 형성 할 수있는 잠재력은 줄기 세포^1의존재에 기인한다. 반면에 장 내 빌리는 분화 된 세포로만 구성되므로 오르가노이드를 형성 할 수 없습니다. 그러나, 돌연변이² 또는 빌루스 상피의 비차별화를 허용하는 조건은 빌리^2,3에서줄기 세포로 이어질 수 있다. 이 운명의 변화는 3D 매트릭스에서 차별화된 빌루스 상피를 도금하여 그들의 오르가노이드 형성 잠재력을 골라서 알루루스 에피테륨의 탈노보 줄기의 지표로서 확인할 수 있다. 따라서 이 절차의 중요한 측면은 토굴 오염이 없는지 확인하는 것입니다.

Smad4^KO:β-카테닌^GOF 조건부 돌연변이는 빌리에서 증식 및 줄기 세포 마커의 발현에 의해 표시된 ....

프로토콜

자궁 경부 탈구에 의한 타목시펜과 안락사의 사용을 포함하여 수행 된 모든 마우스 실험은 스티븐스 에첸학 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 마우스

참고 : Smad4^{f / f의}세대; 캐스롭^{록스 (ex3)}/⁺; 빌린-Cre^ERT2 마우스는 이전에^3로기술되었다. 성인 여성 마우스 사이 8 받는 다열 한 주 사용 했다.

1. Smad4^KO유도 :β 카테닌^GOF 돌연변이를 Smad4^f/f에서유도; 캐스롭^{록스 (ex3)}/⁺; 빌린-Cre^ERT2 와 천막 주입 옥수수 기름에 4 일 연속.
2. 첫 번째 타목시펜 주입 후 10 일 동안 마우스비 자궁 경부 탈구를 희생하십시오.
3. 마우스 털이 복막 구멍으로 들어가는 것을 방지하기 위해 70 % 에탄올로 복부를 스프레이하십시오.
4. 해부 가위로 복강을 열어 내장을 노출시다....

결과

절차의 성공을 위한 결정적인 요소는 토굴 오염을 방지하는 것입니다. 비리에서 유기성 개발 (그리고 어떤 오염 토굴에서) 네 가지 주요 기준을 확인하 여 보장: 1) BME-R1에서 빌리를 도금 전후 현미경 검사에 의해 수확 된 담블리의 순도 보장, 2) 모든 도금 된 villi개별적으로, 3) 모든 도금 된 빌리의 시각화를 허용 하기 위해 잘 당 한정된 수의 빌리를 도금; 시간 과정의 이미지는 빌리(그림 3)및 4)에서 유기체의 발달을 보여 빌리에서 시동하는 오르가노이드의 운동 및 형태학적 외관을 이론화; 빌리에서 개시하는 오르가노이드는 처음에는 불규칙하게 형성되어 2~5일 후에 4배 배율로 볼 수 있으며, 이는 암호화 유래 오르가노이드(EDTA/PBS 첼레이션 방법^1,4)를사용하여 토굴을 분리하여 배양하여 잘 정의된 테두리가 있는 구형 구조로 밤새 나타난다(그림

토론

이 방법은 생체 내에서 줄기 세포 마커를 획득하는 비차별화 된 악성 상피의 자체 갱신 능력을 확인할 수 있습니다. 일반적인 장 상피는 토굴^1에서줄기 세포의 존재때문에 3D로 배양 할 때 지하실에서 오르가노이드를 발생시키지만 빌리 컴파트먼트는 발생할 수 있습니다. 따라서, 3D 배양에서 배양된 탈분화된 빌리 상피로부터의 오르간구형 형성은 세포 운명 반전으로부터 줄기 세포 형성을 확인한다. 돌연변이 및/또는 부상으로 인한 장 상피에서 세포 운명 반전에 대한보고는^{2,3,9,10,11,12로}증가하고 있다. 따라서, 이 방법은 비.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
고급 DMEM F-12 미디어	Gibco	12634010
3,3-diaminobenzidine	Vector Labs	SK-4105
96 웰 U-바닥 플레이트	Fisher Scientific	FB012932
ABC 키트	Vector Labs	PK4001
앵글 가위	Fisher Scientific	11-999
무동물 재조합 인간 EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 보충제(50X), 비타민 A 뺀	12587010		Gibco
소 혈청 알부민(BSA) 프로테아제 무함유 분말	Fisher Scientific	BP9703100
CD44 항체	BioLegend
Cdx2 항체	세포 신호	12306
옥수수 기름	Sigma-Aldrich	C8267-500ML
Corning 70미크론 세포 여과기	생명 과학	431751
Cultrex 감소 성장 인자 기저막 추출물, 유형 R1	R& D	3433-005-R1
해부 가위	Fisher Scientific	22-079-747
집게	Fisher Scientific	17-456-209
글루타맥스 (100X)	Gibco	35050-061
HEK 293-T 세포 RSPO-1 발현	선물 Michael Verzi
HEPES 박사의 선물 (1M)	Gibco	15630-080
Histogel	Thermoscientific	HG-4000-012
메시 필터	Fisher Scientific	07-201-431
Micrscope 유리 슬라이드	VWR	89218-844
N-2 보충 (100X)	Gibco	17502048
N-아세틸 시스테인	Sigma-Aldrich	A9165
p200 블런트 팁	VWR	46620-642
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
프리모신(50mg/mL)	Invivogen	ant-pm-1
Quality Biological Inc PBS(10X)	Fisher Scientific	50-146-770
재조합 쥐 Noggin	Peprotech	250-38
신호 희석제	세포 신호	8112L
Tamoxifen	시그마-알드리치	T5648-1G
6-웰 조직 배양 플레이트	Fisher Scientific	50-146-770

1030001