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방법 논문

항원 특이적 B 세포의 단일 단계 식별을 위한 Tetrameric Fluorescent Antigen Array

1.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61827

⸱

2020년 10월 20일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of Kansas, 2Bioengineering Graduate Program, University of Kansas, 3Department of Chemical and Petroleum Engineering, University of Kansas

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 항원 특이적 B 세포 표지를 위한 형광 프로브의 맞춤형 생산 및 사용에 대해 자세히 설명합니다.

초록

형광 항원 생산은 항원 특이적 B 세포를 식별하는 데 중요한 단계입니다. 여기에서는 동족 B 세포 수용체와의 열렬한 참여를 통해 항원 특이적 B 세포를 선택적으로 식별하기 위해 4군 형광 PEG-항원 접합체의 준비, 정제 및 사용에 대해 자세히 설명했습니다. 모듈식 클릭 화학과 상업적으로 이용 가능한 형광단 키트 화학을 사용하여 다발성 경화증 및 제1형 당뇨병의 쥐 모델에서 각각 중요한 자가항원인 단백질지질단백질(PLP139-151) 및 인슐린에 대한 별개의 어레이를 생성하여 맞춤형 형광 PEG 접합체를 준비할 수 있는 다양성을 입증했습니다. 분석은 유세포 분석을 사용하여 해당 질병 모델의 각 형광 접합체에 대해 개발되었습니다. 항원 어레이는 PEG 백본에 대한 다중합체화의 이점을 정량화하기 위해 1가 자가항원과 비교되었습니다. 마지막으로, 우리는 생체 외 항원 자극 후 항인슐린 B 세포 반응을 분리하고 평가함으로써 이 플랫폼의 유용성을 설명했습니다. 인슐린 특이적 B 세포를 라벨링하면 응집체 B 세포 분석에서 감쇠된 공동 자극(CD86)의 변화를 증폭하여 감지할 수 있었습니다. 이 보고서를 통해 형광 항원 어레이를 B 세포 집단을 조사하기 위한 강력한 도구로 생산할 수 있습니다.

서론

적응면역체계(adaptive immune system)는 자가면역, 암, 감염성 질환 등 많은 질병 상태의 진행 또는 퇴행에 중요한 역할을 한다1. 면역병리학 연구 또는 새로운 정밀 치료법 개발을 포함한 광범위한 응용 분야의 경우, 질병 진행의 기저에 있는 항원 특이적 B 및 T 세포 반응을 평가하는 것이 중요한 경우가 많습니다 2,3,4. 주요 조직적합성 복합체(MHC) 사량체는 항원 특이적 T 세포 클론을 식별하기 위해 널리 상업적으로 이용 가능합니다5. 이러한 형광단 표지 구조체는 4가 펩타이드-MHC 복합체를 나타내어 현미경 및 유세포 분석과 같은 라벨링 응용 분야를 위해 동족 T 세포 수용체와 적극적으로 작용합니다.

B 세포 심문에 대한 항원은 매우 다양한 분자량, 전하 및 용해도를 나타낼 수 있습니다 6,7. 단량체 항....

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프로토콜

이 작업에 포함된 모든 동물 절차는 캔자스 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 항원 어레이 합성(4-6일)

  1. 알킨 핸들(alkyne handle)로 변형되지 않은 항원을 기능화합니다(1시간). 20mL 유리 바이알에 1개의 등가 인슐린(100mg, 17.4μmol)을 교반 막대와 함께 넣고 무수 디메틸설폭사이드(DMSO)(2mL)에 녹이고 히트 건 또는 수조를 사용하여 40–50°C로 부드럽게 가열합니다.
    1. 무수 DMSO(0.3mL, 5.3mg, 23.6μmol)에 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘(40.2mg, 348.8μmol) 및 1.35 등가물을 갓 준비한 78.5mM 프로파르길 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS-에스테르) 원액을 추가합니다.
    2. 실온에서 30분 동안 저어준 다음 0.05% HCl(12mL)로 반응을 급냉합니다.
  2. 단일 변형 인슐린-알카인을 역상 액체 크로마토그래피(4시간)로 정제합니다. 10분 30–40% B 그래디언트(A, 0.05% 트리플루오로아세트산(TFA)가 함유된 물)의 분취용 C18 컬럼(19mm x 250mm, 300A ....

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결과

무게에 따라 결정된 인슐린-알카인(그림 2, 상단 패널)의 정제된 수율은 일반적으로 50-65%로 다양했습니다. 40% 미만의 수율은 무수 DMSO의 수질 오염 또는 프로파르길 NHS-에스테르의 가수분해로 인해 발생했을 가능성이 높습니다. 항원 다량체화(그림 1B)의 경우, 인슐린 항원 어레이(그림 2, 중간 패널)의 정제 수율은 60–75%로 다양했으며 SDS-PAGE 분석을 통해 주요 생성물이 4가 종임을 확인했습니다(그림 3A). 형광단 변형(그림 1C)의 경우, FITC 4-arm 인슐린 FAA(그림 2, 하단 패널)의 정제 수율은 일관되게 50%에 가까웠습니다. SDS-PAGE에 의한 분석은 4가 항원 .......

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토론

우리는 항원 특이적 B 세포를 식별하기 위한 맞춤형 FAA를 구성하기 위한 프로토콜(그림 1)을 개발하여 까다로운 항원 표적에 대한 B 세포 프로브 생성을 단순화했습니다. 우리는 PEG가 수용성을 부여하는 반면 기능적 아지드 핸들은 간단한 클릭 접합 반응을 가능하게 하기 때문에 FAA 구축을 위한 손쉬운 기판으로 말단 아지드기를 가진 4-arm PEG 폴리머를 선택했습니다33. 정의된 기능 핸들 수(4개 암)는 엄격한 반응 최적화의 필요성을 피하기 위해 과도한 몰에 항원을 사용할 수 있기 때문에 단순화된 화학적 항원 접합에 도움이 됩니다. 자체적으로 FAA를 구축하는 연구자는 항원을 설계할 때 알카인 기능의 필요성을 고려해야 합니다. 올리고펩타이드 에피토프는 합성 펩타이드 공급업체의 호모프로파르길 핸들과 함께 맞춤 주문하거나 합성할 수 있습니다. NHS 화학은 또한 알카인 .......

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공개 사항

CJB는 SAgA의 치료 용도를 조사하기 위한 SAgA 기술의 라이선스를 취득한 회사인 Orion Bioscience, Inc.의 공동 설립자입니다. 이 보고서는 보조금 번호 1946099에 따라 National Science Foundation 대학원 연구 프로그램의 지원을 받는 작업을 기반으로 합니다. 이 자료에 표현된 모든 의견, 연구 결과, 결론 또는 권장 사항은 저자의 것이며 반드시 National Science Foundation의 견해를 반영하는 것은 아닙니다.

감사의 글

데이터 수집에 도움을 주신 Colette Worcester에게 감사드립니다. 이 연구는 PhRMA 재단(JDG), 국립과학재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램(KDA) 및 NIH 보조금 R21AI143407, R21AI144408 및 DP5OD023118의 지원을 받았습니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,1,3,3-테트라메틸구아니딘Alfa AesarAAA12314AC
12 M 염산Fisher ChemicalA508-4
12% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 단백질 겔, 10-well, 30 ulBio-Rad4561043
20 kDa 4-arm PEG azideJenkem USAA7185-1
3.5 kDa MWCO 투석 튜브(재생 셀룰로오스)Fisher Scientific25-152-10
아세토니트릴, HPLC 등급피셔 케미컬A998-4
Alexa Fluor 647 안티 마우스 CD19 항체BioLegend115522
무수 디메틸설폭사이드ACROS OrganicsAC610420010
바륨ACROS Organics203135000
Brilliant Blue G-250 DyeFisher BioReagentsBP100-50
Cell Prime r-insulinEMD Millipore4512-01인슐린 FAA 합성을 위한 재조합 인간 인슐린
Copper (II) sulfate pentahydrateACROS OrganicsAC197722500
dimethylsulfoxideFisher ChemicalS67496
플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 이성질체 1Sigma-AldrichF7250-1G
빙초산피셔 케미컬A38-212
글리세롤ACROS 유기물15892-0010
글리신피셔 케미컬G46-500
호모프로파르길-PLPBiomatikNAem>맞춤형 합성(서열: 호모프로파르길-HSLGKWLGHPDKF, 순도: 97.29%)
요오드Sigma-Aldrich207772-100G
메탄올, HPLC 등급Fisher ChemicalA452-4
NHS-Rhodamine (5/6-carboxy-tetramethyl-rhodamine succimidyl ester), 혼합 이성질체Thermo Scientific46406 논문에 사용된 Rhodamine-B NHS 에스테르의 상용 아날로그
PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 AntibodyBioLegend100220
요오드화 칼시그마-알드리치30315
프로파르길 N-하이드록시숙신이미드 에스테르시그마-알드리치764221
아스코르브산나트륨시그마-알드리치A7631
바이오탄산시그마-알드리치S5761-1KG
도데실황산나트륨피셔 바이오시약BP166-100
나트륨 인산염 일 염기성 일 수화물Fisher ChemicalS468-500
트리 플루오로 아세트산Sigma-Aldrich302031-10x1mL
트리스 염기Fisher BioReagentsBP152-500
Tris (3- 하이드 록시 프로필 트리아 졸릴 메틸) 아민ClickChemTools1010-1000
xBridge BEH C18 3.5 um, 4.6 x 150 mm 컬럼Waters186003034
xBridge BEH C18 5um OBD 준비 컬럼, 19 x 250mmWaters186004021
염화<륨 나트륨

참고문헌

  1. Murphy, K., Weaver, C. Janeway's Immunobiology. , Garland Science. (2016).
  2. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Seminars in Neurology, Thieme Medical Publishers. , 115-127 (2016).
  3. Knutson, K. L., Disis, M.

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