성인 모기에 있는 배설 시스템의 Neuropeptides 및 그밖 규제기관의 활동을 공부하기

요약

이 프로토콜은 램지 분석, 이온 선택적 미세 전극, 스캐닝 이온 선택적 전극 기술 (SIET) 및 시험관 위축 분석 뒤에 방법론을 간략하게 설명하며, 말피기안 튜블러와 힌구트로 구성된 성인 모기 배설 시스템을 연구하기 위해 적용되어 이온 및 유체 분비 속도, 수축 활동 및 변형 변환을 공동으로 측정합니다.

초록

곤충 생리학의 연구, 특히 인간과 다른 척추 동물에서 질병을 일으키는 병원균의 벡터인 그 종에서, 해충 방제에 대한 새로운 전략을 개발하는 기초를 제공합니다. 여기서, 모기, Aedes aegypti의 배설 시스템에 신경펩티드 및 기타 뉴런 인자(즉, 생생아민)의 기능적 역할을 결정하기 위해 일상적으로 활용되는 일련의 방법이 기재된다. 1 차적인 소변 형성을 담당하는 말피기안 튜블러 (MTs)는 모기에서 제거 될 때 몇 시간 동안 계속 작동 할 수 있으므로 호르몬 치료에 따라 유체 분비 측정을 허용합니다. 이와 같이, 램지 분석법은 분리된 MT로부터 분비 속도를 측정하는 유용한 기술입니다. 이온 선택적 마이크로 전극(ISME)은 분비유체에서 이온 농도(즉, Na⁺ 및 K⁺)를 측정하는 데 순차적으로 사용될 수 있다. 이 분석은 주어진 시간에 여러 MT의 측정을 허용, 다양한 호르몬과 약물의 효과를 결정. 스캐닝 이온 선택적 전극 기법은 ISME를 사용하여 이온 수송 기관의 표면에 인접한 교반되지 않은 층에서 이온 활성을 대표하는 전압을 측정하여 거의 실시간으로 이온의 환피성 수송을 결정합니다. 이 방법은 상피를 통해 이온 흡수 또는 분비에 호르몬과 다른 레귤레이터의 역할을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 힌구트 수축 소는 또한 근활성 신경 펩티드를 특성화하는 유용한 도구입니다, 그 향상하거나 과잉 유체와 폐기물을 제거하는이 기관의 능력을 줄일 수 있습니다. 전체적으로, 이 방법은 배설 시스템이 성인 모기에서 어떻게 규제되는지에 대한 통찰력을 제공합니다. 이는 배설 기관의 기능적 조정이 백과기 후 탈수 스트레스와 같은 문제를 극복하고 혈액밀을 얻기 에 적합한 척추 동물 숙터를 찾기 전에 매우 중요하기 때문에 중요합니다.

서론

곤충의 소금과 수위 유지를 통해 다양한 수유 전략을 활용하여 많은 생태 및 환경 틈새 시장에서 성공할 ^{수 있습니다1}. 대부분의 곤충은 특정 환경과 관련된 다양한 과제를 견딜 수 있도록 좁은 한계 내에서 혈청림프의 조성을 조절하는 메커니즘을 진화시켰^습니다2. 육상 곤충은 종종 물을 보존하는 도전에 직면하고 배설 시스템은 물과 일부 필수 염의 손실을 방지하기 위해 안티 이뇨제를 겪습니다, 따라서, 건조를 피하기. 대조적으로, 이뇨는 곤충이 공급하고 과잉 물과 잠재적으로 소금^3,4로 도전할 때 생깁니다 ^3,4. 곤충은 전문적이고 능동적인 배설 시스템을 통해 삼투규제 문제에 대응하기 위해 작용하는 규제 메커니즘을 발전시켰습니다. 성인 Aedes aegypti 모기에서 배설 시스템은 말피기안 튜벌레 (MT)와 힌드구트로 구성되어 있으며, 그 중 후자는 전방 장막과 후방 직장5로 ^{구성됩니다.} MT는 1 차적인 소변을 생성에 대 한 책임, 일반적으로 NaCl 및/또는 KCl에 풍부한. 1 차적인 소변은 그 때 관의 하류를 여행하고 ^hindgut5를 입력할 때 분비및 재봉경 과정을 통해 수정됩니다. 최종 배설물은 수유/환경 조건에 따라 혈성 림프에 대한 하이퍼 또는 저체산소성일 수 있으며 독성 및 질소 폐기물²에서 농축됩니다2.

MT는 다양한 교통 및 배설 기능을 수행하므로 상피 유체 및 솔루트 운송의 많은 기능을 연구하는 데 이상적입니다^2,6. 호르몬 조절^{을 통해2}, MT는 혈액에서 튜룰 루멘⁷로 이온 및 기타 솔루트를 분비하여 기능하며, 수중 포린스^8,9에 의해 물을 수송할 수 있도록 하는 삼투성 그라데이션을 제공하여 1차 소변을 종합적으로 생성하며, 이는 재흡수형 힌구트²로 이동한다2. 따라서, 격리된 MT로부터 분비된 액체를 수집함으로써, 유체 및 이온의 환피성 수송을 지속적으로 모니터링할 수 있다. 분비 속도와 소변 구성측정은 환피성 이온 및 유체 수송을 담당하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 유체 분비 율을 연구하기위한 인기있는 방법은 램지 분석입니다, 이는 램지에 의해 처음 도입 된 ¹⁹⁵³¹⁰. 이 방법에서, 튜블러의 말단 (폐쇄) 끝은 호르몬 (또는 다른 시험 화합물/약물)으로 취급되는 반면, 근위 (개방) 끝은 1 차 소변을 분비하는 수포화 파라핀 오일의 핀 주위에 감싸고, 핀의 끝에 액적으로 축적된다. 격리된 MT는 생체외 조건에 최적화된 환경에서 장기간(최대 24시간) 동안 생존하고 작동할 수 있어 유체 분비 측정에 적합하고 효율적인 모델을 제공합니다. 곤충은 개방 순환 시스템을 가지고, 따라서 MT는 쉽게 해부하고 일반적으로 혈몰리프⁶에 자유롭게 떠 있기 때문에 제거된다. 또한, ^MTs11이 부족한 진딧물을 제외하고, 특정 곤충 종의 MT 수는 4개에서 수백 개(Aedes 모기 5개)로 크게 달라질 수 있어 곤충 1마리에서 여러 측정을 할 수 있습니다.

Aedes 모기의 MT는 다른 엔옵티고트 곤충과 공통적으로, 간단한 상피^2,12를 형성하는 2개의 세포 모형으로 이루어집니다; 광피 성 Cl^-분비¹³에 도움이 되는 용온(즉, Na⁺및 K⁺)의 활성 수송을 용이하게 하는 대형 주체 세포( 즉, Na+및 K+)와 얇은 스텔레이트 세포. MT는 innervated2, 대신 이뇨제 및 반대로 이뇨 요인을 모두 포함 하 여 여러 호르몬에 의해 규제, 이온 전송의 제어를 허용 (주로 Na⁺, K⁺, 그리고 Cl^-) 그리고 osmotically 의무 물². 수많은 연구는 일시적인 전송에 내분비 요인의 역할을 이해하기 위해 Aedes MTs의 호르몬 조절을 조사14,15,16,17,18. 대표적인 결과에 나타난 바와 같이, 본 원에서 의정서는 이뇨제 및 항이뇨제 대조군을 포함하는 성인 여성 A. aegypti 모기로부터 분리된 MT에 대한 상이한 호르몬 인자의 효과를 보여준다(그림 1). 램지 분석은 항 이뇨 호르몬, AedaeCAPA-1, 이뇨 호르몬에 의해 자극 된 MT의 유체 분비를 억제 하는 방법을 입증 하는 데 사용 됩니다 31 (_DH31) (그림 1).

곤충의 작은 크기는 유체 샘플에서 이온 활성 및 농도를 측정하기위한 마이크로 방법의 개발을 요구하고있다, 또는 MT및 창자와 같은 고립 된 조직의 표면 근처. 이온 농도의 측정을 위해 분비된 유체 방울의 수집이 필요한 이온¹⁹의 방사성 동위원소 의 사용을 포함하여 다양한 방법이 구현되었다²⁰. 체외에서 자극 Aedes tubules 일반적으로 분비 ~0.5 nL/^min21, 따라서 이러한 작은 볼륨의 처리 는 도전을 제기 하 고 잠재적으로 전송 시 오류를 소개할 수 있습니다. 그 결과, 이온 선택적 마이크로전극(ISMEs)은 시험관내 MT의 분비된 액적에서 이온 농도를 측정하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 이 방법에서, 적절한 백필 용액 및 이오노포어로 채워진 기준 전극 및 ISME는 이온 농도²²를 결정하기 위해 분비된 소변 방울에 배치된다. 도니니와 동료²³에서 적응, 이 현재 프로토콜은 성인 Aedes 모기에 자극 된 MT에서 분비 된 방울에서 이온 활동을 측정하기 위해 Na ⁺선택적 ionophore를 사용합니다. 이온 선택적 미세 전극은 이온 활성을 측정하기 때문에, 이 데이터는 교정 솔루션 및 실험 샘플이 동일한 이온 ^{활성 계수를} 공유한다는 가정에 따라 이온 농도로 표현될 수 있다(도 1B,C).

스캐닝 이온 선택적 전극 기술(SIET)은 또한 ISMEs를 사용하여 이온을 운반하는 장기, 조직 또는 세포에 인접한 교반되지 않은 층의 이온 농도 그라데이션을 측정합니다. ISMEs는 전압 그라데이션을 측정한 다음 장기, 조직 또는 ^cell20을 가로지르는 이온 농도 그라데이션 및 방향 및 크기 및 크기를 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기법에서 ISME는 전산화된 마이크로 스테퍼 모터에 의해 제어되는 3개의 축 조작기에 장착되어 3D 위치가 마이크로미터 레벨²⁰으로 제어됩니다. 전압은 컴퓨터 소프트웨어에 의해 프로그래밍되고 제어되는 샘플링 프로토콜을 사용하여 교반되지 않은 레이어 내의 두 지점에서 측정됩니다. 두 점은 전형적으로 장기, 조직 또는 세포의 표면의 5-10 μm 이내의 1점과 20-100 μm의 거리로 구분되며 두 번째 점은 20-100 μm 더 멀리 떨어져 있다. 두 점 사이의 전압 의 크기 차이는 전압 그라데이션을 얻기 위해 계산24,25,26, 이는 다음 농도 그라데이션을 계산하고 그 후 Fick의 ^Law24,27을 사용하여 순 플럭스를 계산하는 데 사용된다. 이 방법은 곤충 창자와 MTs의 다른 지역에 걸쳐 특정 이온의 수송을 평가하는 데 유용, 또는 혈밀 또는 치료 노출 다음 특정 시점에서. 예를 들어, SIET는 모기 배설 시스템의 흡수 및 분비 과정이 호르몬²⁸뿐만 아니라 다른 수유 행동 및 양육 조건에 의해 규제되는 방법을 이해하는 데 사용할 수 있습니다²⁵. SIET를 활용한 이전 작품은 항문 유두와 성모의 직장인을 따라 이온 수송에 관련된 사이트를 공개했다^24,28. Paluzzi와 동료에 의해 이전에 기술된 현재 프로토콜²⁶는, 성인 여성 직장의 직장 패드 상피에 걸쳐 Na⁺ 플럭스를 측정합니다 (그림 2).

모기 배설 시스템의 최종 세그먼트는 음식을 혼합하고 폐기물을 분비하는 데 도움이 조정 된 근육 운동이 필요합니다²⁶. 미드구트에서 소화의 비 흡수성 제품, MT에 의해 분비 된 기본 소변과 함께, 유두 판막을 통과 하 고 ^hindgut2에 전달 됩니다. 자발적인 힌구트 수축은 유두 판막에서 시작하여 상피 세포의 기저 표면을 둘러싼 원형 및 세로 근육의 조정 된 수축을 통해 ileum을 통해 릴레이되는 연동 파에서 발생합니다²⁶. 마지막으로, 직장 내근육은 항문 운하를 통해 폐기물을 추진하고 제거하는 데 도움이됩니다. 비록 곤충 힌창 운동성 근생, 자발적인 수축을 생산 하기 위해 세포 외 ^{Ca2 +} 필요, 이러한 프로세스는 또한 뉴런^26,29,30 규제 될 수 있습니다. 동물이 창자에서 폐기물을 추방하고 혈굴량 균형을 복원해야하기 때문에 신경계에 의한 이 외인성 조절은 먹이기 후에 중요합니다³¹. 그 결과, 체외 생체 분해를 수행하여 심근 자극성 또는 심억제 신경 펩티드를 식별하는 것은 신경 화학 물질이 힌창 성 연골에 미치는 영향을 평가하는 데 유용합니다. Lajevardi와 ^Paluzzi28에 의해 수행된 현재 프로토콜은, 신경 펩티드에 응하여 일색 운동성을 검사하기 위하여 비디오 기록을 이용합니다 (그림 3). 마찬가지로, 힘 변환기 또는 임피던스 변환기는 데이터 수집 소프트웨어를 통해 수축의 흔적을 관찰하는 데 사용될 수도 있다^32,33. 그러나 비디오 기술을 사용하면 기관을 시각적으로 평가하고 매개 변수의 하위 집합을 사용하여 추가 분석하여 힌창 성 운동성에 대한 호르몬의 역할을 식별할 수 있습니다.

이러한 기술을 사용하면 힌창 운동성과 함께 배설 시스템을 따라 유체 및 이온 수송을 조절하고 조정하는 요인을 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중요한 것은, MT에 의한 이뇨반응과 힌창성 운동성 사이의 기능적 연결고리가 지원되며, _DH31 과 5HT와 같은 이뇨호르몬은 MT에 의한 유체 분비를 자극하는 능력을 특징으로 하며, 또한 모기 뒷받이^21,34,35를 따라 근영양 작용을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다^. . 이 사실 인정은 급속한 폐기물 제거를 요구하는 곤충에 있는 포스트 prandial 이뇨와 같은 사건 도중 MT와 hindgut 사이 엄격한 조정의 중요성을 강조합니다.

본명, 모기, A. aegypti, 및 이온 선택적 마이크로전극의 사용을 측정하기 위한 램지 분석 기술의 뒤에 상세한 접근법이 설명되어 있으며, 이는 결합될 때 일시적인 이온 수송 속도를 결정할 수 있다. 또한, 스캐닝 이온 선택적 전극 기술과 힌드구트 수축 분석법은 각각 이온 플럭스와 운동성을 측정하여 힌드구트의 호르몬 조절을 해명하는 데 도움이 된다(도 4).

프로토콜

1. 실리콘 안감이 있는 요리 만들기

참고: 이 단계는 실험 전에 수행해야 합니다. 이 요리는 해부를위한 분석 접시를 준비하고 수축 분석 실험을 위해 만들어집니다.

1. 제조업체의 권장 사항에 따라 실리콘 엘라스토머 키트를 사용하여 실리콘을 준비합니다. 2부리 액체 성분을 10 대 1의 비율로 혼합합니다. 반전하여 부드럽고 철저하게 섞지만 거품 형성을 최소화하십시오.
2. 실리콘 엘라스토머를 표준 60mm 일회용 폴리스티렌 배양 접시에 7-9mm 의 깊이로 붓습니다. 필요에 따라 많은 요리를 준비하십시오. 접시에 실리콘을 붓은 직후 현미경 아래에 미세 핀을 사용하여 기포를 제거하십시오. 접시를 실온(RT)에서 적어도 48시간 동안 또는 오븐에 50°C로 오븐에 넣고 약 4시간 동안 경화(도 5A)한다.

2. 램지 분석 요리 만들기

참고: 요리는 실험에서 실험으로 재사용할 수 있으므로 접시가 손상되거나 파손된 경우에만 이 단계를 반복할 수 있습니다. 해부에는 별도의 요리가 사용됩니다.

1. 메스를 사용하여 (표준 날카로운 예방 조치와 함께), 실리콘 코팅 페트리 접시 중 하나에 우물을 만들어 분석 접시를 충분히 제거하여 - 약 ~ 5mm, 접시의 상단에서 (이것은 ~ 20 μL 입물 방울에 맞아야합니다). 이 전에는 영구 마커를 사용하여 접시 아래에 있는 위치를 표시하여 우물을 만드는 위치를 확인합니다. 우물은 ~1cm 떨어져 있어야 하며, 직경은 약 ~4mm로 튜블러의 단부 끝이 맞도록 합니다. 각 우물에는 1개의 유체 분비 튜블러가 포함되어 있으므로 20개의 우물이 들어 있는 접시를 통해 실험당 최대 20개의 MT를 분석할 수 있습니다.
2. Minutien 핀을 준비하려면 테이프의 축에 수직으로 라벨링 테이프 조각에 0.1mm 스테인리스 스틸 핀을 연달아 놓습니다. 가위를 사용하여 테이프의 길이를 따라 잘라 핀의 동일한 절반을 만듭니다. 각 우물에 반 핀을 사용합니다.
3. 무딘 한 쌍의 집게를 사용하여 각 하프 핀을 실리콘 코팅 분석 접시에 삽입합니다. 곤충 튜블러의 길이에 따라, 튜브의 말단 끝이 입욕 식염수와 근접 종에 몰입 할 수있는 거리에 반 핀을 삽입하여 핀 주위를 감싸는. 이 단계는 쉽게 우물을 시각화하기 위해 현미경으로 수행 할 수 있습니다. 그러나 핀을 다시 사용할 수 있지만 손상되거나 분실된 경우 하프 핀을 교체할 수 있습니다. (그림 5B)

3. 폴리 L-리신 코팅 SIET 접시 만들기

참고: 이 단계는 장기가 SIET 측정 중에 접시의 바닥을 부착하여 측정 부위가 각 샘플에 대해 동일하게 유지되도록 하는 것이 중요합니다. 이러한 요리의 준비는 실험 하기 전에 적어도 2 일 전에 수행 해야 합니다. 각 요리는 특정 치료를 적용 할 때 한 번만 사용해야합니다. 모든 샘플을 따르거나 폴리 L-리신 코트가 긁히거나 손상된 경우 폐기하십시오.

1. 모든 샘플에 대해 레벨 표면에 35mm 페트리 접시를 놓습니다. 각 접시의 중앙에 폴리 L-리신(0.1 mg/mL)의 뚜껑과 파이펫 70 μL을 제거합니다. 뚜껑을 다시 놓고 폴리 L-리신(~48h)을 방해받지 않고 건조시키십시오.
2. 일단 건조되면, 절제된 기관이 해부 후에 놓아야 하는 곳을 더 잘 시각화하기 위해 말린 폴리 L-Lysine 코트를 윤곽으로 한 원으로 접시 바닥을 표시하십시오. 실험에서 식염수 및 처리 솔루션의 양을 최소화하는 데 필요한 경우, 뜨거운 접착제 건을 사용하여 폴리 L-L-lysine 코팅을 둘러싸고 전극이 이동하고 배경 측정을 할 수있는 충분한 공간을 남겨 둡니다 (접착 원의 직경은 충분합니다). 이 코팅 된 요리는 RT (그림 5C)에서 무기한 보관 할 수 있습니다.

4. 실험을 위한 램지 와 수축 분석 요리 준비

참고: 접시를 다시 사용할 수 있습니다 (이전에 사용 된 식염수 / 처리를 제거하기 위해 적절한 세척을 제공), 따라서 접시가 손상되거나 중단되는 경우에만이 단계를 반복합니다. 해부에는 별도의 요리가 사용됩니다. 이 단계는 실험 당일에 수행됩니다.

1. 수축 분석 접시의 경우, 메스를 사용하여 (표준 날카로운 예방 조치와 함께), 실리콘 코팅 페트리 접시 중 하나에 우물을 만들어 분석 접시를 준비합니다. 우물이 삼각형 모양이 되어 가장자리에 해부된 조직을 고정시키는 방식으로 메스를 각도로 조정합니다. 우물은 최대 250 μL을 유지하고 전체 성우 운하에 맞게 충분히 커야합니다 (너무 깊이 파고가 아니라 약 0.5-1cm까지 충분히 넓게 만들수 있음) (그림 5D).
2. 램지 플레이트의 경우 파이펫을 사용하고 최대 20 μL의 용액(1X Aedes 식염수의 18 μL:슈나이더의 중간값은 5.2단계, 호르몬/약물의 2 μL)까지 충전하십시오. 자극되지 않는 컨트롤의 경우, 1X Aedes 식염수:슈나이더의 배지의 20 μL로 우물을 채웁니다. 모든 우물이 가득 차면 수화 미네랄 오일을 분석 접시에 붓고 우물과 미누티엔 핀이 물에 잠기때까지 붓습니다. 20 μL 파이펫 팁을 사용하여 분비된 물방울을 방해할 수 있는 기포를 터뜨리거나 제거합니다.

5. 솔루션 준비

1. 표 1에 설명된 바와 같이 2X Aedes aegypti 식염수와 10배 포도당을 준비하여 Petzel과 동료³⁶에서 적응합니다. 스톡 솔루션은 4°C에 저장해야 합니다. 1X Aedes aegypti 식염수(표 1)의 작업 주식을 만들고 4°C에 보관하십시오. 실험 당일, 작업 주식이 사용하기 전에 RT에 올 수 있도록하십시오. 곰팡이 또는 세균 성 성장의 증거가있는 경우 신선한 준비.
2. 입욕 방울을 준비하려면 Aedes 식염수(5.1단계에서)를 슈나이더의 매체와 1:1 비율로 섞는다. 필요한 양에 따라 작은 알리코에 준비하십시오. 슈나이더의 매체를 냉장고에 보관하고 곰팡이 또는 세균 성장의 증거가 있으면 폐기하십시오. (이 단계는 실험 당일에 이루어져야 합니다.)
3. SIET를 사용하여 Na⁺ 플럭스 측정의 경우 이전에 설명한 대로 수정된 ^Ca2+-free Aedes 식염수(표 2)를 준비합니다²⁶.

6. 모기 MT 및 힌구트 해부

1. 성인 모기 해부를 위해, 작은 비커에 강아지를 수집하고 먹이를 위한 자당 용액을 포함하는 항아리에 놓습니다. 모기의 나이를 결정하기 위하여는, 부화한 모기를 격리하고 미래 해부를 위한 모기의 나이 그리고 성별을 지적하는 다른 항아리에 두세요.
2. 간략하게 모기를 _CO2 패드에 해부하고 응답하지 않을 때까지 기다립니다. 미세 한 집게를 사용 하 여, 다리 또는 날개에서 모기를 집어 들고 1 단계에서 준비 된 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시에 배치. 한쪽에 모기를 놓고 (측면 은 위로), 그리고 Minutien 핀, 장소에 모기를 확보하기 위해 흉부에 침구. 선택적으로, 쉽게 해부를 위해 모기떨어져 날개와 다리를 제거합니다.
3. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 RT Aedes 식염수 한 방울을 추가하여 모기를 식염수에 완전히 담급다. 해부는 모두 식염수 아래에 있는지 확인합니다(Aedes 식염수를 만들기 위한 표 1 참조).
4. 입체 현미경 아래에 해부 접시를 놓습니다. 마지막 복부 세그먼트를 미세한 집게로 꼬집어 서서히 모기에서 멀리 당깁니다. 이 단계는 현미경의 밑에 동시에 보고하여 촉진됩니다. MT와 힌드구트와 함께 부착 된 미드 구트가 노출되어야합니다 (그림 6).
5. 램지 분석의 경우 미드구트 힌구트 교차로에서 각 튜룰을 조심스럽게 제거하여 장기를 손상시키지 않도록하십시오. 날카로운 미세 한 집게를 사용하여 튜블러를 개별적으로 제거하십시오 - 분석에 손상된 튜블러를 사용하지 마십시오. (설정은 7단계를 참조하십시오.)
6. SIET의 경우 ^Ca2+무료 Aedes 식염수(5.3단계)에서 힌드구트를 해부합니다. 폴리 L-리신 요리는 또한 ^Ca2+무료 Aedes 식염수의 고정 볼륨을 가지고 있는지 확인합니다. 창자에서 큐티클을 조심스럽게 제거하고 힌드구트를 폴리 L-L-리신 접시에 넣습니다(측정되는 것에 따라 다른 부착된 장기를 제거할 수 있음). 직장 패드 상피를 따라 이온 수송을 측정하는 경우, 마이크로 전극에 접근할 수 있도록 적어도 하나의 직장 패드의 혈청계 면을 배치(도 7).
   1. 가장 후방 끝을 잡기 위해 집게를 사용하여, (측정 될 어떤 구조를 손상시키지 않고) 접시의 바닥에 힌구트를 가져. 오르간이 폴리 L-리신 코트에 닿자마자, 그것은 고수됩니다. 이 해부된 샘플은 측정을 위한 준비가 되어 있습니다. (SIET 설정 및 측정을 위한 14-16단계를 참조하십시오.)
7. ileum 수축 분석의 경우, 해부 동안 힌드구트가 미드구트에 부착된 상태로 유지되는지 확인합니다(그림 4D). 신중하게 힌드구트의 방해받지 않는 보기를 갖도록 MT를 제거합니다. 이 장기는 4.1 단계에서 설명된 대로 준비된 새로운 요리로 옮겨질 것입니다. (분석 동영상 획득의 경우 17단계를 참조하십시오.)

7. 램지 분석 설정

1. 집게의 끝을 사용하여, 조심스럽게 집게 위에 드레이핑하여 튜블러의 근위 (개방) 끝을 들어 올려 (튜블러를 꼬집어하지 않음), 분석 접시의 우물로 전송. 이 단계는 또한 미세 유리 프로브를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
2. 튜블러가 우물에 담그면 집게로 튜블러의 근위쪽 끝을 집어 들고 입욕 방울에서 제거하고 핀 주위의 끝을 감싸십시오. 핀 주위에 튜블러를 두 번 감싸고 다른 튜블러와 일치하는 목욕 물방울에 남아있는 튜블러의 길이를 유지합니다. 이 시점에서, 튜블러의 말단 끝은 입욕 액적에 있어야하며, 근접 끝은 입욕 액적에서 핀 주위에 감싸서 분비 된 액체가 열린 근접 끝에서 핀 끝에 축적 될 수 있도록합니다.
3. 튜블러가 핀 주위에 감싸인 직후, 우물(예: A, B, C), 시간(유체가 튜블러에서 분비되기 시작하는 시점) 및 기타 식별 정보(예: 호르몬, 유전자형 등)를 기록합니다.
4. 각 모기에는 5개의 튜블러가 있으므로 나머지 튜블러와 함께 7.1-7.3 단계를 반복합니다. 제어 및 실험 치료를 위해, 다른 치료 내에서 다섯 개의 튜블러를 분할. 전체 분석 접시가 채워지때까지 다음 해부와 함께 계속하십시오. 연습을 통해 이 기술은 일반적으로 튜블러를 해부하고, 목욕식염수로 옮기고, 핀을 감싸는 데 일반적으로 2-3분 정도 걸리므로 각 튜블러 사이의 시작 시간에 2-3분 차이가 발생합니다.
   참고: 실험을 시작하기 전에 선택한 목표 하에서 단계 마이크로미터로 현미경의 안구 현미경을 교정합니다. 분비된 물방울은 40x-50배의 총 배율로 일상적으로 측정됩니다.
5. 할당된 인큐베이션 시간 이후에 분비된 액적액을 측정할 수 있습니다. 현미경의 안구 마이크로미터를 사용하여 분비 된 액적의 직경을 측정하고 기록합니다. 교정 변환(표 3)에 의해 측정된 안구 단위 직경을 곱하여 분비된 액적의 직경(d)을 계산합니다. 방정식, V = ^πd3/6을 사용하여 분비된 액적의 부피를 계산합니다.
6. 분비율(nL ^min-1)을 계산하려면, V가 단계 7.5에서 계산된 분비액의 부피인 방정식, 유체 분비 속도 = V/분비 시간을 사용하고, 분비 시간은 튜블러의 잠복기를 의미한다.

8. ISME 설정

1. ISME 스테이션을 설정하려면 스테레오 현미경의 양쪽에 미세 조작기를 배치합니다. 실버 와이어를 염화하는 것은 페리 염화물의 용액에 몰입하여 달성 할 수 있으며 각 실버 와이어를 각 미세 전기 전체 홀더 (또는 필요한 경우 동축 케이블에 전선을 납땜)에 실링할 수 있습니다. 은전선이 염화되지 않는 경우 이 단계를 반복합니다.
2. 실버 와이어를 앰프에 연결하여 데이터 수집 시스템에 읽어보입니다. 제조업체의 지침에 따라 시스템을 설정하고 보정합니다. 전기 간섭이 증가하는 경우 제대로 접지된 패러데이 케이지를 사용하십시오.

9. ISME 및 SIET용 미세 전극 준비

1. P-97 불타는 갈색 파이펫 풀러를 사용하여 1-5 μm의 끝으로 ~5-6 미립자 공보유리 모세혈관(외경 1.5mm, 내경 1.12mm, 길이 100mm)을 당깁니다. 이들은 이온 선택적 미세 전극으로 사용될 것이다. SIET 마이크로 전극의 경우, 결과 전극은 짧은 생크를 특징으로 하는 ~ 5 μm의 팁 개구부를 가져야 합니다.
2. 후드에 미세 전극을 핫플레이트에 놓습니다 (전극의 끝을 깨뜨리지 않도록 주의 깊게 설정하십시오). 15cm 유리 페트리 접시 안에 디클로로디메틸렐란을 넣고 핫플레이트의 전극위로 반전시다. 디클로로디메틸릴란을 사용하여 전극의 모든 표면에 소수성 외투를 추가하여 이온 선택적 전극을 사멸시켜 소수성 이오노포레³⁷을 유지할 수 있도록 한다. 사용하지 않은 사분해 전극은 몇 주 동안 방치될 수 있습니다. 따라서 이 단계는 몇 주마다 또는 새로 뽑은 전극을 위해 수행됩니다.
   참고: 인화성, 부식성 및 독성인 디클로로디메틸릴란을 취급할 때는 MSDS를 참조하여 안전한 취급을 하십시오.
   1. 핫플레이트를 350°C로 돌리고 75분 동안 그대로 둡니다. 유리 페트리 접시에 추가하는 디클로로디메틸렐란의 부피 (μL)에 미세 전극의 수의 1:2 비율을 사용합니다. 따라서, 10 개의 미세 전극의 경우 디클로로디메틸릴란 20 μL을 추가하십시오.
3. 75 분 후, 뜨거운 접시를 끕니다. 전극과 핫 플레이트가 냉각된 후 유리 페트리 접시를 제거하고 전극(집게)을 성형 점토가 있는 보관 상자로 옮킨다. 전극의 끝이 손상을 방지하기 위해 가리키고 있는지 확인합니다.
4. ISME에 대한 기준 전극을 만들려면 ~ 4-5 필라멘트 된 보로실리케이트 유리 모세관 튜브 (외부 직경 1mm, 내지 0.58 mm, 길이 100mm)를 당깁니다. 이 전극은 격리될 필요가 없습니다. 라벨을 부착하고 비슷한 상자에 보관하여 팁의 손상을 방지합니다.
5. SIET 기준 전극은 표준 유리 모세 혈관 (외부 직경 2mm, 내경 1.12mm, 길이 102mm)으로 만들어집니다. 모세혈관은 용융 1M KCl + 3% 한천으로 채워져 있으며 사용할 때까지 1M KCl(완전히 침수)되는 50mL 원심분리기 튜브에 보관해야 합니다. 거품이 형성되기 시작할 때까지 또는 한천이 파손될 때까지 반복적으로 사용할 수 있습니다. 영공이 있는 경우 유리를 폐기하고 새 유리를 사용하여 회로가 완료되었는지 확인합니다.

10. 백필 주사기 준비

참고: 이 단계는 ISME의 전극을 채우기 위해 미세 기울어진 주사기를 만들기 위해 수행됩니다.

1. 일회용 바늘로 1mL 슬립 팁 주사기를 사용하십시오. 바늘을 버리고 1 mL 마크까지 주사기를 다시 당깁니다. 연기 아래, 분젠 버너를 켜고, 그것이 녹기 시작할 때까지 주사기의 플라스틱 끝을 가열. 오래된 집게 를 사용하여 용융 된 주사기 팁을 조심스럽게 꼬집어 아래로 당겨 팁을 스트레칭합니다.
2. 가위를 사용하여 용융 된 팁을 원하는 길이로 자르고 직경을 충분히 작게 만듭니다 (다이어그램 참조). 주사기가 냉각된 후 주사기의 압력을 물로 테스트하여 막힘이 없는지 확인합니다. 필요한 각 백필 솔루션에 대해 하나를 만들고 그에 따라 레이블을 지정합니다(그림 8).

11. ISME 및 SIET용 이온 선택및 기준 마이크로전극 작성

참고: 마이크로 전극은 여전히 작동하는 한 재사용할 수 있습니다(각 실험 전에 교정). ISME의 경우 이 단계는 램지 분석에서 MT가 인큐베이션되는 동안 수행할 수 있습니다.

1. Na⁺선택적 마이크로전극을 만들려면 100mM NaCl로 전극을 백필하기 위해 10단계에서 생성된 1mL 주사기를 사용하십시오. 백필 용액이 전극의 끝이 될 때까지 채워지도록 합니다. 기포가 나타나면 마이크로 전극을 부드럽게 쓸어 넘기거나 용액을 제거하고 다시 채웁니다. 이것은 더 나은 시각화하는 입체 현미경의 밑에 행해져야 합니다.
2. 입체 현미경으로 10 μL 파이펫 팁을 Na⁺선택적 이오노포어 용액에 담급드세요. 파이펫에 수직으로 전극을 감싸고, 장갑을 낀 손가락을 끝 아래쪽에 놓고 압력을 만들고 작은 요오노포어 방울을 추방합니다. 현미경의 높은 목표에서 보고, 조심스럽게 팁을 깨는 피하기, 마이크로 전자 기 팁에 ionophore의 방울을 터치. 일반적으로 마이크로 전극은 이오노포어/백필 용액 테두리가 평평해질 때까지 150~300 μm 사이의 이오노포어 칵테일 컬럼 길이로 앞으로 채워져 있습니다.
   주의: 이 이오노포어는 독성이 있으며, 안전한 취급을 위해 MSDS를 참조하십시오.
3. 작은 비커에 100mM NaCl로 중간에 채우고, 일부 모델링 점토를 비커 의 상단에 내부에 놓습니다. Na⁺ ionophore를 채택 한 후, 전극 팁 아래로 비커의 벽에 배치, 팁100 mM NaCl 내에 앉아 있도록, 그것은 사용할 준비가 될 때까지 비커에 ISME를 유지.
4. ISME 기준 전극을 만들려면 500mM KCl로 전극을 채우기 위해 솔루션이 팁에 채워지도록 합니다(위와 동일한 프로토콜을 따르십시오). KCl을 비커에 보관합니다.

12. ISME용 전극 보정

참고: 이 단계는 분비된 유체(~10~15분 전)를 측정하기 직전에 수행됩니다. 경사가 일관되도록 모든 ~5-6 측정을 수행해야 합니다.

1. 파라핀 오일에 침수될 때 이온포에 침전되는 것을 피하기 위해 - 3.5 %(w /v) 폴리 염화 비닐의 용액을 사용하여 전극 팁을 코팅하십시오.
   주의: 이것은 인화성이며, 안전한 취급을 위해 MSDS를 참조하십시오.
2. Na⁺ 전극을 보정하려면 다음 NaCl 표준 농도의 10 μL 방울을 인큐베이션 된 MT와 램지 접시의 가장자리에 배치하십시오 : 200 mM NaCl 및 20 mMM + 180 mM LiCl. 표준 물방울 ~ 2cm 를 분리하고 더 높은 농도를 위에 놓습니다.
3. 클로리드 실버 와이어 위에 기준 전극과 이온 선택적 전극을 모두 삽입하고 미세 조작기에 부착된 전극 홀더를 사용하여 안전하게 고정합니다. 전극을 마이크로 조작기로 200m NaCl 액적쪽으로 이동하여 전극 팁이 접시의 바닥에 닿지 않도록 합니다. 전기계를 켜서 레코딩을 시작하고 판독값이 안정화되도록 합니다.
4. 판독값을 기록하고 다음 표준(20mM NaCl + 180m LiCl)으로 계속 이동합니다. 경사를 계산하고 전극 판독값이 안정적이고 경사가 범위 내에 있는 경우 분비된 액적 측정을 위해 전극을 사용합니다. 판독값이 불안정하거나 적절한 기록이나 경사를 주지 않거나, 평형화하는 데 잠시 복용하지 않으면, 새로운 이온 선택적 전극을 준비하거나 끝을 가로질러 조직을 실행하여 기준 전극의 끝을 깨뜨린다. Na⁺ 의 경사면은 ~58-60 ^mV38이어야 하지만 허용 범위는 50~60mV입니다.

13. ISME 녹음 및 계산

1. 유체 분비 속도(단계 7.7 참조)의 측정에 따라, 마이크로 조작기를 사용하여 분비된 액적으로 기준 및 이온 선택적 전극을 신중하게 이동합니다. 레코딩을 켜고 판독값이 안정화되고 레코드되도록 합니다. 다른 물방울에 대해 이 단계를 반복합니다(반복 보정 측정은 매 ~5-6측정).
2. 양이온 농도는 이전에 설명된 방정식을 사용하여 계산된다^22,38, [ion] = [C] x ^10ΔV/m, 여기서 [C]는 ISME를 보정하는 데 사용되는 교정 용액의 mmol ^L-1의 농도이며, ΔV는 분비된 유체 방울과 동일한 교정 용액의 전압 에서 기록된 전압 간의 전압 변화, 동일한 교정 용액의 전압 변화, 및 m은 경사인 두 표준 교정 간의 전압 차이입니다.

14. SIET 설정

참고: SIET 시스템은 이전에 설명되었습니다^27,39. 배경 소음을 줄이기 위해 라이트 현미경과 헤드 스테이지 주변에 패라데이 케이지가 설치됩니다. 이 논문에 제시된 실험은 자동 스캐닝 전극 기술(ASET) 소프트웨어 2.0에 대한 다음 설정을 사용합니다: 이온 그라데이션이 다음 미세 전극 움직임을 완전히 재확립할 수 있도록 하는 4초의 대기 기간, 대기 기간 이후에 0.5초동안 전압이 기록되고, 100μm의 소풍 거리 및 모든 레코딩에 대해 3개의 반복이 기록됩니다. 필요에 따라 특정 설정은 ASET에서 사용자 수정할 수 있습니다.

1. IPA-2 이온/폴라로그래피 증폭기, 광 현미경(부착된 비디오 카메라 사용) 및 이러한 실행 중인 각 ASET 및 cellSens에 연결된 컴퓨터(들)를 켭니다.
2. 단계 9.1-9.3, 9.5, 10 및 11.1-11.3 단계에 설명된 마이크로 전극 및 기준 전극을 준비한다. 이온 선택적 마이크로 전극에는 100m NaCl 백필이 있는 Na⁺ ionophore가 포함되며 기준 전극(한천 교량 포함)은 항상 3M KCl으로 채워집니다.
3. Na⁺선택적 마이크로전극을 은염화물(AgCl) 와이어로 구성된 홀더에 놓고 여성 커넥터 잭에 부착합니다. 주사기를 사용하여, 참조 전극 홀더를 신선한 3 M KCl로 채우면 (실험 일 전에 만들어 RT에 보관 할 수 있음).
   참고: 실험 후 _ddH2O로 기준 전극 홀더를 씻어내세요.
4. 3M KCl에 잠긴 모든 기준 전극을 포함하는 비커에서 하나의 기준 전극을 제거하고 한쪽 끝에 한 손가락을 놓고 유리 모세관을 이 손가락쪽으로 기울여 서 고서가 떨어지는 것을 방지합니다. 조심스럽게 거품이 형성되지 않도록 홀더에 한쪽 끝을 배치합니다. 거품이 있는 경우, 기준 전극을 제거하고 홀더를 3M KCl로 다시 채우고 반복한다. 전극 홀더를 여성 커넥터 잭에 넣습니다.

15. SIET용 전극 보정

1. Na⁺ 측정의 경우 150mM NaCl 및 15mM NaCl + 135mM LiCl 솔루션²⁴를 사용하십시오. 식염수(표 2)의 Na⁺(20mM) 레벨의 범위를 포괄하는 두 솔루션 간의 Na⁺ 농도에 10배 차이가 있어야 합니다.
2. 실험을 수행할 때 RT에 50mL 원심분리기 튜브와 알리쿼트에 교정 솔루션을 저장합니다. 이 알리쿼트는 하루가 끝날 때 폐기됩니다. 주식 솔루션에 오염의 증거가있는 경우, 처분하고 신선한 솔루션을 합니다.
3. 보정하려면 두 교정 솔루션(15.1 단계)을 개별 35mm 페트리 접시에 알리쿼트하고 현미경 단계에 배치합니다. 컴퓨터 모션 제어 장치에 선택한 "비활성화"로 스테퍼 모터를 제어하는 수동 조정 노브를 사용하여 미세 전기 전하 팁이 교정 솔루션 내부에 배치되도록 합니다. 팁이 파손될 수 있으므로 너무 멀리 잠기지 마십시오. 팁이 파손되면 새로운 이온 선택적 미세 전극을 준비하고 다시 보정합니다.
   1. 앰프에 연결된 컴퓨터에서 ASET 소프트웨어를 엽니다. 캘리브레이션 설정을 엽니다. 교정 유형에 대한 Nernst 경사 를 선택하고 샘플을 3초 동안 설정하고 교정 솔루션의 농도를 입력합니다. 예를 들어 Na⁺ 측정의 경우 솔루션 1에서 150mMM를 입력하고 Na⁺선택적 마이크로 전극 팁과 기준 전극을 이 교정 솔루션 내부에 배치합니다. 증폭기의 전압 판독은 안정적이어야 합니다. 솔루션 1을 클릭하고 전압(mV)이 기록될 때까지 기다립니다. 다음으로, 15mM NaCl + 135m LiCl 용액 내부에 마이크로전극 및 기준 전극을 배치하고, 용액 2에 15mM를 입력하고 용액 2 를 클릭하여 전압 판독을 얻습니다. 경사는 이러한 설정에서 계산된 이 두 전압간의 차이입니다. 교정 후 확인을 클릭 합니다.
   2. 이온 농도의 10배 변화를 위한 Na⁺선택적 마이크로전극의 슬로프는 약 59.0± 1.624여야 한다. Nernst 경사가 이 범위에서 크게 벗어난 경우 새로운 미세 전극 또는 알리쿼트 새로운 표준(오염될 수 있음)을 준비합니다. 전압 안정성에 따라 모든 2-3 샘플 전에 교정이 필요합니다. 전압이 불안정해지고 변동하기 시작하면 새로운 이온 선택적 마이크로 전극을 준비하십시오.

16. SIET 측정

참고: 컴퓨터 모션 제어 장치의 모터 스위치는 ASET을 통해 컴퓨터 키를 사용하여 전극을 조작하거나 측정 녹화 중(이 시점에서 키를 인에이블(Enable으로 전환해야 함)을 제외하고 항상 비활성화로 전환되어야 합니다.

1. 교정 후 장기를 해부합니다(6.6단계 참조). 폴리-L-리신 접시를 현미경 단계에 해부된 시료와 함께 놓고 식염수 내부에 기준 전극의 끝을 삽입합니다. 이온 선택적 마이크로 전극의 끝을 식염수에 담그지 않도록 주의하십시오.
2. 수동 조정 노브를 사용하여 가벼운 현미경 아래에서 보이는 동안 미세 전극 위치를 조정합니다. 그 끝이 기관 또는 조직과 같은 평면에 있도록 마이크로 전디의 수직 위치를 조정합니다. 원하는 위치에 도착하면 모터 스위치를 사용 가능하게 전환합니다. 이 시점에서 스테퍼 모터는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여만 작동할 수 있습니다.
3. 컴퓨터 화살표 키를 사용하여 미세 전극을 조직에서 3mm 떨어진 위치로 수평으로 이동하여 배경 기록을 측정합니다. F2를 눌러 노트를 삽입합니다. 준비가 되면 F5를 눌러 녹화를 시작합니다. 배경 활동의 다섯 가지 측정을 가져옵니다. 모든 샘플의 평균 배경 전압 활동은 동일한 샘플에 대한 조직을 따라 측정된 전압 그라데이션에서 빼됩니다.
4. 마이크로 전하 끝을 조직에 가깝게 다시 이동하여 장기를 관통하지 않도록 주의하십시오. 키히트 감도를 줄여 미세 전극 팁 2 μm을 조직에 수직으로 직접 배치합니다. 직장 패드를 따라 각 사이트에서 세 개의 레코딩을 가져와 가장 큰 이온 활동의 사이트를 식별합니다. 가장 큰 활동("핫스팟" 사이트)을 표시하는 사이트에서 기준식 염선 측정값을 가져옵니다.
5. 모터를 전환하여 비활성화하고 최종 원하는 복용량을 얻기 위해 접시에 적절한 치료를 추가합니다. 다음 응용 프로그램, 새 노트를 만듭니다 (즉, 치료 이름 및 복용량), 활성화 로 다시 모터를 전환하고 F5를 사용하여 전압 기록을. 시간이 지남에 따라 변경 사항을 관찰하는 것이 목표인 경우 특정 시간 간격으로 계속 측정합니다. 연구원의 목적에 따라 SIET를 사용하는 특정 응용 프로그램에 대해 여러 프로토콜을 만들 수 있습니다.
6. ASET 소프트웨어가 조직을 따라 현장에서 전압을 기록하고 조직에서 100 μm 떨어진 소풍 거리(그림 7)에서 전압에서 이를 빼는 것을 지켜보십시오. 첫 번째 레코딩은 조직에서 촬영되기 때문에, 양전압 차이는 전압이 상피(도 7B)에서 멀리 떨어져 있는 것보다 상피(tissue)(도 7A)에서 더 높다는 것을 나타내며, 따라서 양이온이 흡수되고 있다. 음극 전압 그라데이션은 양이온 분비를 나타냅니다.
7. 치료 후 다시 배경 기록을 얻고 (3mm 거리) 치료 후 이온 플럭스를 계산할 때 이를 사용합니다. "기준선"에서 배경 기록 의 한 세트를 확인하고 치료 후 한 세트. 마이크로 전디제가 컴퓨터 키로 조정되지 않거나 전압이 기록되지 않을 때 언제든지 비활성화하도록 모터를 전환합니다. 데이터를 텍스트 파일로 내보내고 Excel을 사용하여 열어 모든 계산을 수행합니다.
8. 이전에 설명된 방정식을 사용하여 이온 플럭스를 계산합니다^24,26. 각 처리에 대한 순 이온 플럭스는 기준선 이온 플럭스 측정에서 절대적인 변화로 표현될 수 있다. 결과의 중요성을 확인하기 위해 차량 제어(예: 처리 대신 접시에 단독으로 식염수를 추가)를 사용할 수 있습니다. 호르몬 치료 다음 이온 수송의 변화는이 제어에 대한 응답으로 변화에 따라 평가되어야한다.

17. 힌구트 수축 에세이

1. 4.1 단계에서 설명된 요리의 우물 중 하나를 Aedes 식염수(단계 5.1)의 알려진 부피로 채웁니다. 해부 (단계 6.7)에 따라, 조심스럽게 검사되는 장기 (ileum)를 꼬집어하지 않도록, 다른 접시에 미드 구트에 부착 된 해부 힌구트를 조심스럽게 전송합니다. 용기를 우물 안쪽의 식염수에 잠그고 미누티엔 핀을 미드구트와 직장에 넣습니다. 이렇게 함으로써, 일레움은 장력 하에 있어서는 안되며, 전방 장막의 유러믹 밸브에서 유래한 자발적수축을 관찰해야 한다.
2. 비디오 카메라를 입체 현미경에 연결하고 비디오 캡처 소프트웨어(예: 루미나라의 인피니티 캡쳐)를 사용하여 비디오를 녹화합니다. 해부된 장기를 함유한 접시를 현미경 으로 놓고 2분 동안 기록합니다. 이 조건은 "기준선" 조건이 됩니다.
3. 공지된 부피 1X Aedes 식염수(단계 5.1)를 우물에 추가하여 우물 내에서 볼륨이 증가하면 장색 운동성의 변화를 설명합니다. 다음 응용 프로그램 후 1 분 기다린 다음 2 분 동안 다시 기록하십시오. 이것은 "식염수"상태입니다.
4. 치료의 알려진 된 볼륨을 추가 (10 배 재고 농도에서 잘 원하는 복용량을 얻을 수). 다음 응용 프로그램 후 1 분 기다린 다음 2 분 동안 다시 기록하십시오. 이것은 "치료"상태가 될 것입니다.
5. 모든 비디오를 저장하고 MP4로 변환합니다. 분석하려면 2분 간격으로 수축 수를 계산합니다(유실 판막에서 시동파를 시작하고 ileum 전체로 확장하는 연동파로 정의). 이 숫자를 2분으로 나누어 수축률을 얻습니다. 수축 또는 이완 기간과 같은 다른 매개 변수도 평가될 수 있습니다. 원시 데이터 수집에 따라 모든 샘플에 대한 "기준" 조건에 대한 데이터를 기준으로 각 매개 변수를 표현합니다. "식염수"와 "치료"에 대한 접이식 변화를 "기준선"에 기준으로 모든 플롯합니다.

결과

자극되지 않은 MT에 대한 _DH31 의 적용은 액분비율의 현저한 증가를 초래하며, Aedes 모기에서 이뇨 호르몬으로서의 역할을 확인합니다(그림 1A). 튜블러가 AedaeCAPA-1로 처리될 때, _DH31 자극 된 MT에서 분비 속도의 감소가 관찰됩니다. 그림 1B 는 분비 된 물방울에서 Na⁺ 농도를 측정하기 위해 이온 선택적 전극의 사용을 보여줍니다. MT에 _DH31 의 치료는 분비 된 방울에 Na ⁺ 농도에 영향을 미치지 않았다; 그러나, AedaeCAPA-1의 적용으로, 분비된 액체에 있는 Na⁺ 농도는 현저하게 증가했습니다. 또한 자극되지 않은 컨트롤과 비교하여 _DH31 은 Na⁺ 전송 속도가 현저히 커진 반면...

토론

혈액 식사를 섭취 할 때, haematophagus 곤충은 그들의 혈성 림프²에 과잉 solutes및 물의 도전에 직면합니다. 이에 대처하기 위해, 그들은 호르몬 요인에 의해 단단히 통제되는 전문 배설 시스템을 가지고 있어 곤충이 급속히 후 prandial 이뇨를 시작할 수 있습니다. 램지 분석 및 이온 선택적 미세 전극의 사용은 격리 된 곤충 MT에서 이온 농도 및 전송 속도와 함께 유체 분비 속도를 측정 할 수 있습니다. 이러한 접근 방식 내에서 중요한 단계는 곤충 MT의 적절한 해부를 보장하는 것을 포함한다. 에이데스 () MT는 자극되지 않는 대조군에서 쉽게 분비하지 않으므로 호르몬과 약물은 분비를 자극하기 위해 적용 될 수 있습니다. 그러나, 이뇨 제비 또는 신중한 해부에도 불구하고 일부 MT는 손상된 경우 분비하지 못할 수 있습니다 (육안 검사가 전혀 명확하지 않더라도), 따라서 여러 번의 분석이 수행되어야 할 수 있습니다. ISME 및 SIET 측정 중에 이...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 mL 주사기	Fisher Scientific	14955456
35 mm 페트리 접시	Corning Falcon (Fisher Scientific)	C351008
Borosillicate 유리 모세관 필라멘트 튜브 (OD 1 mm, ID 0.58 mm, 길이 100 mm)	ISME 기준 전극
에 사용되는 World Precision Instruments 1B100F-4Borosillicate 유리 모세관 필라멘트 튜브 (OD 2 mm, ID 1.12 mm, 길이 102 mm)	SIET 참조 전극에 사용되는	World Precision Instruments	1B200F-4
Borosillicate 유리 모세관 비필라멘트 튜브 (OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, 길이 100 mm)	ISME 및 SIET 전극에 사용되는	World Precision Instruments	TW150-4
CO2 패드	Diamed	GEN59-114
디메틸 트리메틸 실릴 아민 용액	Sigma-Aldrich	41716
패러데이 케이지	사용자 정의		지역 기계 공장에서 제작 가능
염화철	Sigma-Aldrich	157740
집게 (Dumont # 5)	Fine Science Tools	91150-20
유리 페트리 접시	Fisher Scientific	08-748A
수화 미네랄 오일	Fisher Scientific	8042-47-5	특정 브랜드는 중요하지 않습니다
INFINITY1-2CB 비디오 카메라	Luminera	INFINITY1-2CB
Micromanipulators (왼손잡이 및 오른손잡이)	World Precision Instruments	MMJL 및 MMJR	특정 브랜드는 고품질 매니퓰레이터
미네랄 오일, Light	Fisher Scientific	0121-4
Minutien 핀(0.1mm 스테인리스 스틸)	Fine Science Tools	26002-10
비경화 모델링 점토	Sargent Art		특정 브랜드는 중요하지 않습니다
Olympus 광학 현미경(SIET용)	Olympus	맞춤형 시스템
플라스틱 파스퇴르(전사) 피펫	Fisher Scientific	13-711-7M
폴리-L-라이신 용액 (0.1 mg/mL)	Sigma-Aldrich	A-005-M	84 kDa
폴리염화비닐(PVC)	Sigma-Aldrich	81395
메스 블레이드	Fine Science Tools	10050-00
메스 핸들	Fine Science Tools	10053-09
Schneider's Drosophila medium	Sigma-Aldrich	S0146
SIET system	적용 가능한 전자 맞춤형	시스템	세부 정보 사용 가능: http://www.applicableelectronics.com/overview
Silver wire	World Precision Instruments	AGW1010
Sodium ionophore II cocktail A	Fluka	99357
표준 폴리스티렌 페트리(배양) 접시	Fisherbrand	FB012921	모든 크기가 작동하지만 60mm 접시는 해부와 해부 모두에 좋습니다.
안구 마이크로미터를 사용한 실체 현미경	분석 Nikon	SMZ800
Sutter P-97 불타는 갈색 피펫 풀러	Sutter Instruments	FGPN7
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Dow Chemical Company	NC9285739
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
VWR 고급 핫플레이트 교반기 - 알루미늄	VWR	9578	특정 브랜드는 중요하지 않습니다.