인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조

요약

여기서, 우리는 미리 분화된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포로 구성된 3D 자가 조립 심장 미세 조직 배열을 생성하는 사용하기 쉬운 방법론을 기술합니다. 심장 미세 조직을 생성하는 기술을 요구하는 이 사용자 친화적이고 낮은 세포는 질병 모델링 및 약물 개발의 초기 단계를 위해 구현될 수 있습니다.

초록

유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)에서 인간 심근세포(CM), 심장 섬유아세포(CFs), 내피세포(EC)의 생성은 조직 발달과 질병을 이끄는 다른 심혈관 세포 모형 사이에서 복잡한 상호작용을 연구할 수 있는 특별한 기회를 제공하고 있다. 심장 조직 모델의 영역에서, 몇몇 정교한 3차원 (3D) 접근은 세포 외 매트릭스와 크로스 링커의 조합으로 생리적 관련성 및 토착 조직 환경을 모방하기 위하여 유도된 다능성 줄기 세포 유래 심근세포 (iPSC-CM)를 이용합니다. 그러나 이러한 시스템은 미세 제조 전문 지식없이 조작하기가 복잡하고 자체 조립하는 데 몇 주가 필요합니다. 가장 중요한 것은, 이 시스템의 많은 것은 인간적인 심혼에 있는 비 myocytes의 60% 이상을 구성하는 혈관 세포 및 심장 섬유아세포부족입니다. 여기에서 우리는 심장 미세 조직을 제조하는 iPSCs에서 모든 3개의 심장 세포 모형의 파생을 기술합니다. 이 촉진 복제 성형 기술은 몇 주 동안 표준 다중 잘 세포 배양 판에서 심장 미세 조직 배양을 허용합니다. 이 플랫폼은 초기 시드 밀도에 따라 미세 조직 크기를 사용자가 정의한 제어를 허용하며 관찰 가능한 심장 미세 조직 수축을 달성하기 위해 자체 조립에 3 일 미만이 필요합니다. 더욱이, 심장 마이크로티슈는 유동 세포측정및 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 사용하여 단세포 심문을 위한 높은 세포 생존가능성을 유지하면서 쉽게 소화될 수 있다. 우리는 심장 미세 조직의 이 체외 모형이 약 발견 및 질병 모델링에 있는 검증 연구를 가속화하는 것을 도울 것이라는 점을 구상합니다.

서론

심혈관 연구 분야의 약물 발견 및 질병 모델링은 임상적으로 관련된 샘플과 부적절한 번역 도구의 부족으로 인해 몇 가지 도전에 직면하고 있습니다^. 매우 복잡한 전임상 모델 또는 체외 외 단일 세포 모델의 지나치게 단순화된 결과 재현 가능한 방식으로 병리학적 조건을 나타내지 않습니다. 따라서, 여러 소형 조직 설계 플랫폼은 높은 처리량 방식으로 적용의 용이성과 조직 기능의 충실한 회수 사이의 균형을 달성하는 것을 목표로, 격차를 해소하는 데 도움이 진화^했다2,3. 유도 된 다능성 줄기 세포 (iPSC) 기술의 출현으로, 조직 엔지니어링 도구는 연구 질문에 대답하기 위해 기본 심혈관 질환 상태 또는 없이 환자 특정 세포에 적용 할 수 있습니다^4,5,6. 심장 조직과 유사한 세포 구성을 가진 이러한 조직 설계 모델은 하나 또는 다중 세포 유형의 행동에 병리학적 변화에 의해 유도 된 심장 독성 및 기능 장애를 테스트하는 약물 개발 노력에 활용 될 수있다.

인간 iPSC에서 파생된 자가 조립 된 마이크로 조직 또는 오르가노이드는 생체 내 와 기능적 유사성을 나타내는 소형 조직과 유사한 어셈블리인 3차원 (3D) 구조입니다. iPSC의 지시된 분화를 통해 또는 배아 바디4의 대형을 통해 그(것)들에게 오르가노이드의 형성을 허용하는 몇몇 다른 접근이 있습니다^. 결과 오르가노이드는 유기 발생을 유발하는 형태 유전학 적 과정을 연구하는 데 필수적인 도구입니다. 그러나, 다양한 세포 집단의 존재와 자기 조직에 있는 다름은 다른 organoids5 사이 결과에 있는 가변성으로 이끌어 낼 수 있습니다. 대안적으로, 국소 세포 상호 작용을 연구하기 위해 조직 별 세포 유형을 가진 마이크로 조직으로 자체 조립되는 미리 분화된 세포는 자가 조립 된 성분을 분리하는 것이 가능한 우수한 모델입니다. 특히 인간의 심장 연구에서다세포 성분을 가진 3D 심장 미세 조직의 개발은 세포가 다른 환자 라인 또는 상업적 근원에서 파생될 때 도전적인 것으로 입증되었습니다.

생리적으로 관련성이 있는, 개인화된, 체외 모델에서 세포 행동에 대한 기계적 이해를 향상시키기 위해, 이상적으로 모든 성분 세포 유형은 동일한 환자 라인에서 파생되어야 합니다. 인간의 심장의 맥락에서, 진정으로 대표적인 체외 모델은 주요 세포 유형, 즉 심근세포 (CM), 내피 세포 (EC), 및 심장 섬유 아세포 (CFs)^6,7 사이에서 크로스토크를 캡처할 것입니다. 심근의 충실한 회수는 생물물리학 적 스트레칭 및 전기 생리 자극뿐만 아니라 EC 및 ^CFs8과 같은 세포 유형을 지원에서 발생하는 세포 세포 신호가 필요합니다. CF는 세포 외 매트릭스의 합성및 조직 구조를 유지하는 데 관여합니다. 그리고 병리학적인 상태에서, CF는 ^CMs9에 있는 섬유증을 유도하고 전기 전도를 바꿀 수 있습니다. 마찬가지로, EC는 파라크리인 신호 및 중요한 신진 대사 요구를 공급하여 CM의 수축 특성을 조절할 수 있습니다¹⁰. 따라서 생리학적으로 관련된 고처리량 실험을 수행할 수 있도록 3가지 주요 세포 유형으로 구성된 인간 심장 미세 조직에 대한 필요성이 있습니다.

여기에서는 인간 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM), iPSC 유래 내피 세포(iPSC-EC), iPSC 유래 심장 섬유아세포(iPSC-CFs) 및 심장 조직 균등에서의 3D 배양에 의한 심장 미세 조직의 제조에 대한 상향식 접근법을 설명합니다. 자발적으로 심장 미세 조직을 생성하는이 촉진 방법은 질병 모델링 및 심장 생리학의 기능적 및 기계론적 이해를위한 약물의 신속한 테스트에 활용 될 수있다. 더욱이, 그 같은 다세포 심장 미세 조직 플랫폼은 만성 또는 급성 배양 조건하에서 시간이 지남에 따라 심장 질병 진행을 모방하기 위하여 게놈 편집 기술로 이용될 수 있었습니다.

프로토콜

1. 중간, 시약, 배양 판 준비

1. 세포 배양을 위한 세포 세척 용액: 칼슘이나 마그네슘 없이 1x 인산염 완충식식염(PBS) 또는 행크스 균형 소금 용액(HBSS)을 사용하십시오.
2. 심근세포 분화 미디어
   1. 분화 매체 #1을 추가하여 10mL 보충제(50x B27+인슐린)를 500mL 심근세포 기저(RPMI 1640)에 첨가하여 준비한다.
   2. 분화 매체 #2는 10mL 보충제(50x B27 마이너스 인슐린)를 500mL 심근세포 기저(RPMI 1640)에 추가하여 준비한다.
   3. 500mL 심근세포 기초 매체(RPMI 1640)에서 포도당을 뺀 보충(50x B27 +인슐린)을 추가하여 정화 매체 #3을 준비하십시오.
3. 내피 성장 매체 및 자기 활성화 세포 선별 (MACS) 시약
   1. 시판 가능한 내피 세포 성장 중간 보충 키트와 내피 성장 매체 (EGM)를 준비합니다.
   2. 헹구는 용액으로 소 세럼 알부민(BSA) 스톡 용액을 1:20으로 희석하여 세포 분리 선별 완충액을 준비합니다.
4. 심장 섬유아세포 분화 매체: 섬유아세포 기저배지(DMEM-high glucose) 및 혈청없는 섬유아세포 생명인자 키트로 심장 섬유아세포 분화 배지를 준비합니다.
5. 심장 미세 조직 제조 및 유지 보수 매체: 심근세포 기저형 배지(RPMI 1640)로 여과된 배지를 보충(50x B27 플러스 인슐린) 및 EGM을 70/30 v/v%비율로 준비합니다.
6. 소분자 및 성장 인자 주식 솔루션
   1. 3가지 세포 유형의 분화를 위해 GSK3 베타 억제제 CHIR 99021의 200 μL 알리쿼트(6-[2-[2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]-아미노리]를 준비하십시오.;아미노릴]-아미노리]-아미노리]-3];아미노리]-아미노리]-아미노릴 Wnt 억제제 IWR-1-엔도 (4-(1,3a,4,7a-헥사하이드로-1,3-디옥소-4,7-메탄노-2H-이소인돌-2-yl)-N-8-퀴놀리닐-벤자미드; 및 변형 성장 인자 베타 (TGF-β) 억제제 SB431542 (4-[4,3-벤조디옥솔-5-yl)-5-(2-피리디닐)-1H-imidazol-2-yl]벤자미드) 디메틸 설산화물(DMSO)에서 10mM 농도로.
   2. 인간 iPSC-EC 분화의 경우, 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF) (20 μg/mL), 혈관 내피 성장 인자 165(_VEGF165; 50 μg/mL), 뼈 형태유전학 단백질 4(BMP4; 20 μg/mL) 0.1%(w/v)의 100μL 알리쿼트(w/v)를 준비한다. -20°C에 알리쿼트 저장; 장기 보관을 위해 알리쿼트는 최대 1년 동안 -80°C로 저장할 수 있습니다.
7. iPSC-CC, iPSC-EC 및 iPSC-CF의 유지 관리를 위한 사전 코팅 플레이트.
   1. DMEM/F12에서 성장인자 감소(GFR) 지하 막 매트릭스 배지를 1:200 비율로 희석하여 iPSC-CM 재도팅을 위한 지하 막 매트릭스 배지 를 코팅한 6웰 플레이트를 준비한다. 6웰 플레이트의 각 웰에 희석 된 지하 멤브레인 매트릭스 배지 2 mL을 추가하고 적어도 2 ~ 4 시간 동안 설정하도록 둡니다.
   2. 6웰 플레이트 또는 젤라틴으로 10cm 접시를 미리 코팅하십시오. 37°C의 수조에 2% 젤라틴 용액을 액화하고 필요에 따라 PBS에서 0.2%(v/v) 젤라틴을 적절한 부피로 준비한다. 사용 전에 37°C에서 최소 30분 동안 10mL의 0.2% 젤라틴으로 배양판을 코팅한다.
      참고: 젤라틴 플레이트는 MACS 후 iPSC-CF및 iPSC-IC 모두에 사용할 수 있습니다.
8. 미세 조직 금형 의 제조 : 건조 100 mL 유리 병에 PBS에서 2 % 낮은 녹는 아가로즈 솔루션을 준비합니다. 아가로즈를 121°C, 15psi에서 20분 동안 살균한다. 121°C에서 주조 실리콘 마이크로 몰드, 15 psi에서 15분 동안 자동 클랩합니다.
9. 소화, 면역 염색 및 유동 세포측정을 위한 솔루션
   1. 미세 조직 소화를 위해 PBS에서 디스파스 I (1 U /mL) 및 Liberase (3 U/mL)의 효소 소화 완충액을 준비하십시오. 이 솔루션을 얼음 위에 보관하십시오.
   2. 세포 및 미세 조직 고정에 대해 4.2 %의 파라 포름알데히드 (PFA)를 포함하는 얼음 차가운 시판 가능한 고정 시약을 사용합니다.
   3. PBS에서 0.25% 트리톤 X-100을 준비하여 투과화를, 웨이엔-20은 0.1% 화합을 준비한다. 용액은 실온에서 보관할 수 있습니다.
   4. 형광 활성화 세포 선별 (FACS) 분석을 위해, FACS 버퍼 [2 % 태아 소 혈청 (FBS)] FACS 버퍼를 준비하고 4 ° C에 저장합니다.
   5. 면역 염색을 위해 PBS에서 2 % 일반 염소 / 당나귀 / 토끼 세럼을 준비하십시오. 항체가 제기된 숙주에 기초하여 혈청 종을 선택한다.

2. 심장 분화 및 정화

참고: 모든 iPSC는 심근 세포 분화 전에 ~75%에서 80%의 합류로 유지되어야 합니다. 이 프로토콜에 사용되는 iPSCs는 스탠포드 심장 혈관 연구소 (SCVI) 바이오 뱅크에서 수행 된 센다이 바이러스 재프로그래밍을 사용하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 파생되었다.

1. 분화 하기 전에, 문화 iPSC 식민지 까지 통과 (P20).
2. 6-웰 플레이트에서 iPSC 배양 배지를 제거하고 2mL PBS로 한 번 세포를 세척한다.
3. 0일째에는 각 웰에 CHIR(6 μM 최종)로 차별화 매체 #1의 2mL를 추가하여 메센도데름 유도를 시작합니다. 최종 농도는 상이한 iPSC 라인에 대해 6~9μM 사이로 다를 수 있다. 따라서 최적의 심장 중소포성 유도를 식별하기 위해 6웰 플레이트에서 다른 CHIR 농도를 테스트하는 것이 좋습니다.
4. 2일째에, 각각 의 약에서 신선한 2 mL 중간 #1로 대체하여 세포를 복구합니다.
5. 3일째에는 각 웰의 배지를 2mL 분화 매체 #1로 Wnt 억제제 IWR-1-endo(5 μM)로 교체하여 심장 계보 사양을 유도합니다.
6. 5일째에, 매질의 배지를 각각 2mL 미디엄 #1로 교체하여 세포를 회복시다.
7. 7일째에는 매미를 2mL 미디엄 2로 교체합니다. 심근 세포의 자발적인 구타는 8-9 일 초에 관찰 될 수있다. 일부 라인의 경우, 박동 세포는 11 일 늦게 나타날 수 있습니다.
8. 분화 배양의 정화를 위해, 10일째에 각 웰에 2mL 마이너스 포도당 미디엄 #3로 바꿉다.
9. 13일째에, 매우물에서 2mL 플러스 포도당 미디엄 #2로 배지를 변경하여 세포를 회복한다.
10. 16일, 2mL의 중간 #3로 2라운드를 실시합니다.
11. 19일째에 2mL 플러스 포도당 미디엄 #2로 세포를 복구하십시오.
12. 20일째되는 날에는 1mL PBS로 우물을 한 번 씻고 37°C에서 6분 동안 1mL 10x 트립신을 사용하여 세포를 분리한다. 인큐베이션 후, 세포는 15s 미만의 단일 세포로 우물 표면을 들어 올려 효소를 중화하기 위해 중간 #2의 동일한 부피를 가진 15 mL 원원형 튜브에 첨가됩니다. 270 x g에서 3 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리합니다.
13. 3 mL 중간 #3에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포를 계산하고 새로운 지하 막 매트릭스 배지 의 각 우물에 ~ 3 백만 개의 세포를 플레이트에 중간 #3의 적절한 볼륨을 추가 6-웰 플레이트. 다시 도금 후 두 번째 날에, 신선한 2 mL 중간 #2로 매체를 교체하고, 동결 또는 미래의 실험을위한 심근 세포의 트립시화 때까지 격일로 2 mL 중간 #2로 보충.

3. 내피 세포 분화 및 MACS

1. 75%에서 80%의 iPSC 컨플루엔티지에서 PBS, 2mL로 플레이트를 잘 씻으시면 됩니다.
2. 6 μM CHIR로 분화 매체 #1의 2 mL로 대체하여 0일째에 차별화를 시작합니다.
3. 2일째에는 배지를 2mL의 분화 매체 #1을 2 μM CHIR로 교체하십시오.
4. 4일째, 20 ng bFGF-2, 50 ng _VEGF165, 및 20 ng BMP4로 보충된 EGM의 2mL로 매체를 교체하십시오.
5. 6일부터 10일까지 2일마다 성장 요인으로 보완된 EGM 2mL로 배지를 변경합니다. TGFβ 억제제(SB431542)를 8 μM 농도로 첨가하여 내피 확장을 촉진하고 다른 중간엽 기원 세포 유형의 분화를 억제하는 것이 선택사항입니다.
6. 12일, PBS 1mL로 각각 헹구고, 37°C에서 8분 동안 6웰 플레이트의 각 웰에서 10x 트립신1mL을 사용하여 세포 해리를 사용하여 MACS를 위한 단계를 시작한다.
7. 해리 효소를 중화시키기 위해 50mL 원문 관에서 EGM 배지의 동일한 볼륨을 준비한다. 50mL 원문 튜브에 40 μm 셀 스트레이너를 놓고 스트레이너를 통해 분리된 세포 현탁액을 전달합니다. 2개에서 3개의 분리된 우물에 대한 필터를 변경합니다.
8. 혈전계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 0.4% Trypan blue를 사용하여 총 실행 가능한 세포를 예매합니다.
9. 4°C에서 미리 냉각된 원심분리기에서 5분 동안 300 x g 의 셀 서스펜션을 펠렛.
10. 3.8단계의 총 개수를 기준으로 선별 버퍼의 적절한 부피로 셀 펠릿을 폐기하고 셀 펠릿을 재연한다.
    참고: 총 셀 ¹⁰⁷ 개당 80μL의 정렬 버퍼를 추가합니다.
11. 마그네틱 비드 라벨링의 경우 ¹⁰⁷ 세포당 20μL의 FcR 블로킹 시약을 추가하고 5분 동안 배양합니다.
12. CD144 또는 CD31 마이크로비드 20μL을 ¹⁰⁷ 세포당 추가하고 잘 섞는다. 15 분 동안 4 °C에서 어두운 세포 현탁액을 배양하십시오.
13. 라벨이 붙은 세포를 세척하고 4 °C에서 미리 냉각 된 원심 분리기에서 5 분 동안 셀을 300 x g 로 펠릿하는 정렬 버퍼 20 mL을 추가하십시오.
14. 셀 펠릿을 3mL의 정렬 버퍼로 다시 중단하고 얼음 위에 둡니다.
15. 분리기 노치에 열을 배치하여 자기 분리 열을 준비합니다.
16. 3mL의 정렬 버퍼로 헹구고 폐기물 원적 튜브에서 흐름을 수집하여 컬럼을 평형화합니다.
17. 헹구는 버퍼가 흐르면 셀 서스펜션을 철저히 다시 중단하여 덩어리를 부수고 셀 서스펜션을 열에 적용합니다.
18. 셀 서스펜션이 흐르면 라벨이 없는 셀을 제거하기 위해 3mL의 정렬 버퍼로 컬럼을 세 번 세척합니다.
19. 분리기에서 컬럼을 제거하고 CD144⁺/CD31⁺ 셀 용출을 위해 15mL 원문 튜브에 배치합니다.
20. 5mL의 정렬 버퍼를 열에 추가하고 즉시 플런저로 마그네틱 레이블이 부착된 셀을 플러시합니다.
21. 혈전계 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 0.4% Trypan blue를 사용하여 실행 가능한 셀 수를 결정합니다.
22. 3분 동안 300 x g 에서 미리 냉각된 원심분리기에서 세포 현탁액을 원심분리합니다.
23. 3.21단계의 총 수에 기초하여 TGFβ 억제제(SB431542)의 5-8 μM을 가진 EGM의 적절한 부피에서 세포 펠릿을 재연한다.
24. 이 통로 0(P0) 세포를 적절한 세포 밀도(4 x ¹⁰⁴ 세포/^cm2)에서 미리 코팅된 0.2% 젤라틴 플레이트에 플레이트.
25. P0 및 P1의 경우 TGFβ 억제제를 사용하여 2일마다 신선한 EGM으로 배지를 계속 보충합니다. P2로부터, 세포는 TGFβ 억제제 없이 내피 성장 배지에서 배양될 수 있다.

4. 심장 섬유아세포 분화

1. iPSC가 90%에서 95%의 컨실라이짐이 되도록 허용합니다. 1 mL PBS로 각각 잘 씻으시면 됩니다.
2. 11 μM CHIR와 분화 매체 #1의 2 mL을 추가하여 0 일째에 차별화를 시작합니다. 민감한 iPSC 라인의 경우 농도는 9-10 μM 사이로 다를 수 있습니다.
3. 1일째에는 접시를 관찰하십시오. ~30%~40%의 세포가 플레이트에 부착된 상당한 세포 사멸을 관찰하는 것은 정상이다.
4. 3일째에는 5μM IWR-1-endo를 사용하여 2mL의 분화 매체 #1을 추가하여 심장 선조의 확장을 촉진합니다.
5. 4일째에, 배지를 심장 섬유아세포 분화 배지의 2mL로 바꿉다. 16일까지 2일마다 신선한 매체로 교체하십시오.
6. 18일째에, 37°C에서 10분 동안 6웰 플레이트의 각 웰에서 10x 트립신1mL을 사용하여 세포를 분리한다.
7. 세포 층을 철저히 방해하고 5% FBS로 보충된 DMEM/F12 배지의 동일한 부피를 포함하는 50mL 원판 튜브에서 70 μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과합니다.
8. 혈전계 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 0.4% Trypan blue를 사용하여 실행 가능한 셀 수를 결정합니다.
9. 300 x g에서 300 x g 에서 세포 현탁액을 원심분리하여 5분 동안 펠릿을 얻습니다.
10. 첫 번째 재도금의 경우, 세포 밀도(6 x ¹⁰⁴ 세포/^cm2)에서 적절한 분화 배지 및 플레이트의 적절한 부피에서 세포 펠릿을 0.2% 젤라틴 코팅 플레이트에서 90%의 수렴성까지 재보선한다.
11. 접시를 분할하고 젤라틴 코팅 플레이트에 10 % 혈청으로 일반 DMEM / F12에서 심장 섬유 아세포를 유지합니다.

5. 심장 미세 조직 금형 및 세포 종자 주조

1. 100mL 유리 병에 넣고 끓일 때까지 아가로즈를 전자레인지에 녹입니다. 아가로즈 병을 스프레이하고 생물 안전 캐비닛에 놓습니다. 아가로즈가 ~3분 동안 식히도록 허용합니다.
2. 9 x 9 어레이의 실리콘 마이크로 몰드에서 용융 아가로즈의 파이펫 700 μL. 파이펫팅 하는 동안 거품을 발생 하지 마십시오.
3. 미리 냉각된 얼음 블록에 금형을 조심스럽게 배치하여 아가로즈 젤레이션을 가속화합니다.
4. 아가로즈가 겔화되면 반투명이 됩니다. 미세 금형의 가장자리를 조심스럽게 구부려 아가로즈 복제본을 느슨하게 합니다. 그런 다음 모든 면에서 복제본을 부드럽게 벗겨 실리콘 마이크로 몰드에서 아가로즈 복제본을 분리합니다.
5. 멸균 12웰 플레이트에 81개의 원형 오목(직경 800 μm, 깊이 800 μm)을 함유한 아가로즈 마이크로티슈 트레이를 이송한다.
6. 아가로즈 미세 조직 트레이에 PBS 2mL을 추가하고 갇힌 거품 이나 불규칙한 모양의 우물에 대 한 현미경에서 검사.
7. 아가로즈 트레이를 하룻밤 사이에 2mL 70% 에탄올에 담그고, 1시간 동안 생물안전 캐비닛에서 UV 처리를 한다.
8. 사용하기 전에 70% 에탄올을 제거하고 증류수로 두 번 씻고 2mL PBS로 최종 세척을 하십시오.
9. 트립시화, 중화, iPSC-C, 및 iPSC-CF를 계산하고 얼음에 세포 현탁액을 배치합니다.
10. 오목한 것을 만지지 않고 우물과 세포 시딩 챔버에서 PBS를 조심스럽게 제거합니다.
11. 새로운 튜브에서 iPSC-CM, iPSC-EC 및 iPSC-CF를 각각 7:2:1 비율로 혼합하여 ¹⁰⁶ 세포/mL의 최종 세포 밀도를 달성한다. 더 높은 세포 밀도는 더 큰 미세 조직을 초래할 것입니다.
    참고: 2 x ¹⁰⁶ 셀/mL을 초과하지 마십시오.
12. 조심스럽게 종전챔버에 셀 서스펜션의 200 μL을 드롭와이즈로 추가한다.
13. 세포가 _CO2 인큐베이터에서 37°C에서 2시간 동안 정착하도록 허용한다.
14. 아가로즈 몰드를 둘러싼 미세 조직 제조 배지를 추가하여 내부 챔버의 표면을 덮습니다.
15. 24시간 후, 세포는 원형 오목에서 크게 조립되고 컴팩트합니다. 유지 보수를 위해 2 일마다 신선한 매체로 교체하십시오.

6. 면역 염색을 위한 세포 및 심장 미세 조직의 고정 및 투과성

1. 각 개별 세포 유형에 대해, 지하 막 매트릭스 배지 또는 젤라틴 코팅 챔버 슬라이드 (약 2.5-3 x ¹⁰⁵ 세포 /mL)에 세포를 별도로 배양한다. 심장 미세 조직은 원형 오목에서 부드럽게 씻어 15 mL 원추형 튜브에서 수집 할 수 있습니다.
2. 배지를 흡인시키고 1mL PBS로 세포 또는 마이크로 조직을 헹구십시오. 그 후, 챔버 슬라이드에 대해 20분 동안 4.2% PFA를 함유한 고정 버퍼와 실온에서 미세 조직에 대해 1h를 수정한다.
3. PFA를 흡습하고 1mL의 퍼메라빌라이징 용액(PBS에서 0.25% 트리톤 X-100)을 챔버 슬라이드용 5~7분, 15mL 원내 마이크로티슈에 20분 간 추가한다.
   참고: 이 단계에서부터 샘플은 벤치탑 흔들 플랫폼에서 부드럽게 흔들수 있습니다.
4. PERMEabilizing 용액을 흡습하고 PBS의 2 ~ 3 mL로 한 번 헹구세요.
5. 챔버 슬라이드에 대해 최소 1시간 동안 500-1,000 μL의 블로킹 용액(2%~5% 정상 염소 혈청 또는 당나귀 혈청)으로 세포를 배양하고 미세 조직을 위해 3~4h를 배양한다.
6. 세포를 배양하여 시료를 커버하기에 충분한 블로킹 용액에 제조된 공주 항체를 구배한다. 항 심장 트로포닌-T (cTnT2) (1:50), 안티 CD31 (1:75), 및 항 DDR2/Vimentin (1:50)를 가진 배양챔버 슬라이드에 대한 1 시간 및 심장 미세 조직에 대한 4 °C에서 하룻밤.
7. 챔버 슬라이드를 500 μL 0.1% Tween-20으로 각 세척과 PBS로 최종 세척 할 수 있습니다.
8. 심장 미세 조직의 경우, 각 세척 사이에 20 분 지속 시간으로 2 mL 0.1 % Tween-205 번 세척하십시오. 추가 20 분 동안 마지막 세척 단계를 수행합니다.
9. 공초점 현미경 검사전에 세포 또는 마이크로 조직을 4',6-diamidino-2-페닐린돌(DAPI)(1 μg/mL)으로 배양한다.
10. 심장 미세 조직의 경우 35mm 유리 바닥 접시에 조심스럽게 옮기고 PBS를 침수 마이크로 조직에 추가하십시오.
11. 3D 이미징의 경우, 마이크로 티슈의 20배 또는 40배 오일 침지 객관적인 게인 센터 포커스를 사용하고 각 플루오로포어에 대한 노출 파라미터를 조정한다.
12. Z 스택을 얻기 위해 5-10 μm 슬라이스 간격으로 100-200 μm의 총 이미징 깊이로 라이브 모드에서 첫 번째 및 마지막 좌표를 설정합니다.

7. 심장 미세 조직의 소화 및 유동 세포 측정을위한 세포의 준비

1. 마이크로 티슈를 소화하기 위해, 15 mL 원추형 튜브에 넓은 보어 1 mL 파이펫 팁을 사용하여 원형 오목에서 중간 #1로 마이크로 티슈를 부드럽게 플러시합니다.
2. 마이크로조직이 배지를 신중하게 정착시키고 흡인시키고 1mL PBS로 세포 또는 미세 조직을 헹구고 37°C에서 20분 동안 효소 소화 버퍼200-300 μL을 첨가하도록 한다. 10분에서 미세 조직을 1분 동안 부드럽게 섞고 남은 시간 동안 37°C에서 다시 배양합니다.
3. 인큐베이션 후, 일반 1mL 파이펫 팁을 사용하여 미세 조직을 적극적으로 혼합하여 탁탁세포 현탁액을 얻습니다.
4. 마이크로 조직이 단일 세포로 충분히 소화되면 5% FBS를 함유하는 배지 5mL로 세포 현탁액을 즉시 중화시키고 40 μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 변형시니다. 총 세포 수와 원심분리기단일세포 현탁액을 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 계산합니다.
5. FITC 부속서 V및 100 μg/mL 프로피듐 요오드(PI) 또는 To-Pro3 죽은 세포 배제 염료를 100 μL 별관 결합 버퍼에서 1 x ^105-1 x ¹⁰⁶ 셀을 흡인및 재중단합니다.
6. 인큐베이션 후, 감속력 해석을 위해 별관 결합 버퍼의 300 μL을 세포 분석용 원형 측정 분석을 위해 둥근 바닥 FACS 튜브로 이송한다. 선택한 형광에 올바른 레이저 및 방출 필터를 사용합니다.
7. 고정 된 세포를 사용하여 세포 표면 마커의 정량화를 위해, 단계 6.2 및 6.3에 설명 된 바와 같이 세포 펠릿의 고정 및 투과화를 수행합니다.
8. 투과화 후, 세포 펠릿을 헹구고 각각의 공액 항체를 1h로 배양한다. 세포 펠릿을 4mL FACS 버퍼(PBS의 2% FBS)와 원심분리기를 3분 동안 300 x g 로 세척합니다. 워시 스텝을 두 번 반복합니다.
9. 유동 세포 측정 분석을 위해 200-300 μL FACS 버퍼에서 세포를 다시 중단합니다.
10. 스테인드 되지 않은 샘플로 전방 및 측면 분산 특성을 조정하고 각 형광에 대한 동형 제어를 사용하여 레이저 전압을 조정하는 것이 좋습니다. 데이터 분석을 위해 최소 20,000개의 이벤트를 수집합니다.

8. 자발적으로 심장 미세 조직을 때리는 수축 분석 수행

1. 적어도 3 개의 비트를 캡처하는 심장 미세 조직의 비디오를 녹화합니다. 기록 해상도를 프레임 속도 >초당 30프레임으로 최소 1280 x 720픽셀로 설정하고 비디오를 저장할 수 있습니다. AVI 형식입니다.
2. MATLAB 환경에서 MotionGUI ^script11 을 실행하여 사용자 인터페이스를 시작합니다.
3. 를 찾을 수 있습니다. 비디오를 로드하려면 폴더의 AVI 파일 위치입니다. 그런 다음 입력 패널에서 비디오가 캡처된 프레임 속도를 입력합니다.
4. 고급 입력 패널에서 해상도 및 캡처 배율에 따라 픽셀 크기를 지정할 수 있습니다.
5. 적절한 매크로블록 픽셀 크기를 지정(기본 값 16) 및 마이크로 조직 수축강도에 따라 감지 가능한 픽셀 모션을 지정할 수 있습니다.
6. 매개 변수를 조정한 후 모션 벡터 가져오기를 클릭하여 분석을 시작합니다.
7. AOI 선택 라디오 버튼으로 관심 영역을 선택하여 원형 오목에서 단일 마이크로 티슈 주변 영역을 제외합니다.
8. 함수 맵 타임 애비뉴 를 사용하여 X 및 Y 축에서 감지된 모션에 따라 평균 수축 히트맵을 생성합니다.
9. 피크 추적 데이터의 경우 수축 데이터 받기 함수를 사용하여 수축 및 완화 피크를 자동으로 측정합니다.
10. 신호 대 잡음 비율이 낮은 경우 피크 높이 및 거리 임계값을 적용하여 최대 수축 속도(파란색 점)와 최대 이완 속도(빨간색 삼각형)에 올바르게 음응합니다.
11. 올바른 임계값을 설정한 후 피크 분석분석을 선택하여 비트 속도와 비트 간격으로 수축 및 이완 값을 얻습니다.
12. 통계 분석을 위해 최소 25개의 개별 미세 조직에서 측정을 가져옵니다.

결과

iPSC 유래 CM, IC 및 CF의 면역 염색 및 유동 세포측정 특성화
iPSC-CM, iPSC-EC 및 iPSC-CF로 구성된 심장 마이크로 조직을 생성하기 위해 세 가지 세포 유형모두 개별적으로 분화되고 특성화됩니다. iPSC-CM에 iPSC의 체외 분화는 지난 몇 년 동안 개선되었습니다. 그러나 iPSC-CM의 수율과 순도는 선마다 다릅니다. 현재 프로토콜은 9일 경에 자발적으로 이길 수 있는 75% 이상의 순수 iPSC-CM을 산출합니다(그림 1A). 9일부터 14일까지의 추가 정화 단계는 iPSC-CM 순도를 이전에 설명한 바와 같이 80% 이상으로 향상시킬 수 있다¹². 유사하게, 고순도 iPSC-EC는 4-5(그림 1B) 경에 중피에서 발생하는 내피 선조를 편화하는 여러 혈관 성장 인자를 첨가하여 페노를 잘 정의한 ...

토론

미리 분화된 iPSC-CM, iPSC-EC 및 iPSC-CF로부터 심장 마이크로티슈를 생성하기 위해서는 심장 마이크로티슈 내에서 접촉 억제된 세포 다짐 후 세포 수를 더 잘 제어하기 위한 고결한 배양을 확보하는 것이 필수적이다. 최근에는 지아코멜리 외. ^al.18 은 iPSC-CM, iPSC-EC 및 iPSC-CFs를 사용하여 심장 미세 조직의 제조를 입증했습니다. 설명된 방법을 사용하여 생성된 심장 미세 조직은 ~5,000세포(70% iPSC-CM, 15% iPSC-EC 및 15% iPSC-CFs)로 구성된다. 이 방법에서, 심근세포와 내피 세포 모두 CD34+ 마커를 사용하여 내피 전구체의 분리에 따라 공동 분화되었다. 여기서 설명된 현재 프로토콜은 마이크로 조직당 12,000개의 세포(70% iPSC-CM, 20%iPSC-C, 및 10% iPSC-CFs)로 구성되어 있으며, 이는 다운스트림 단일 세포 분석을 위한 구조당 더 높은 세포 수를 산출합니다. 더욱이, 3개의 세포 모형 은...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12웰 플레이트	Fisher Scientific	08-772-29
3D 마이크로 몰드	미세조직	12-81 형식
6웰 플레이트	Fisher Scientific	08-772-1B
AutoMACS 헹굼 솔루션	Thermo Fisher Scientific	NC9104697
B27 보충제 마이너스 인슐린	라이프 테크놀로지	A1895601
B27 보충제 플러스 인슐린	생명 기술	17504-044
BD Cytofix	BD Biosciences	554655
BD Matrigel, hESC 인증 매트릭스	BD Biosciences	354277
심장 트로포닌 T 항체	Miltenyi	130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads	Miltenyi	130-097-857
CD31 항체	Miltenyi	130-110-670
CD31 Microbeads	Miltenyi	130-091-935
CHIR-99021	Selleckchem	S2924
DDR2	Santa Cruz Biotechnology	sc-81707
Annexin V FITC 및 PI가 포함된 사세포 세포사멸 키트	Thermo Fisher Scientific	V13242
Dispase I	Millipore Sigma	4942086001
DMEM, 고포도당(4.5g/L) 글루타민 없음 배지		11960044
DMEM/F-12 기초 배지	Gibco	11320033
Dulbecco의 인산 완충 식염수(DPBS), 칼슘 없음, 마그네슘 없음	Life Technologies	14190-136
EGM2 BulletKit	Lonza	CC-3124
태아 소 혈청	Life Technologies	10437
FibroLife 무혈청 섬유아세포 LifeFactors Kit	LifeLIne Cell Technology	LS-1010
무포도당 RPMI 매체	Life Technologies	11879-020
염소 혈청	Life Technologies	16210-064
Human FGF-basic	Thermo Fisher Scientific	13256029
인간 VEGF-165	PeproTech	100-20
IWR-1-endo	Selleckchem	S7086
Liberase TL	Millipore 시그마	5401020001
LS 정렬 컬럼	Miltenyi	130-042-401
MACS BSA 재고 솔루션	Miltenyi	130-091-376
MACS 헹굼 버퍼	Miltenyi	130-091-222
MidiMACS 분리기	Miltenyi	130-042-302
RPMI 매체	Life Technologies	11835055
SB431542	Selleckchem	S1067
TO-PRO 3	Thermo Fisher Scientific	R37170
Triton X-100	Millipore Sigma	X100-100ML
TrypLE Select 10X	Thermo Fisher 과학적인	빨간
Vimentin Alexa Fluor® 488 공액 항체	R& D 시스템	IC2105G