발견 중심의 숙주-병원균 상호 작용을 위한 라벨 프리 정량적 프로테오믹스 워크플로우

요약

여기서, 우리는 질량 분광계 기지를 둔 proteomics에 의하여 감염 도중 호스트와 병원체 사이 상호 작용을 프로파일기 위하여 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 실험에서 호스트(예를 들어, 대식세포)와 병원체(예를 들어, Cryptococcus neoformans)의단백질 풍부도의 변화를 측정하기 위해 라벨이 없는 정량화를 사용합니다.

초록

질량 분석법 (MS)기반 정량 적 프로테오믹스의 기술적 성과는 다양한 조건에서 유기체의 글로벌 프로테오메를 분석하기위한 많은 알려지지 않은 길을 열어줍니다. 원하는 숙주로 미생물 병원체의 상호 작용에 적용되는 이 강력한 전략은 감염에 대한 두 관점을 포괄적으로 특성화합니다. 본 명세서에서, 워크플로우는 불멸의 대식세포 세포의 존재에서 치명적인 질병 크립토코코시스의 원인성 제제인 크립토코커스 네오포만의 감염체의 라벨없는 정량화(LFQ)를 설명한다. 이 프로토콜은 단일 실험 내에서 병원균 과 포유류 세포 모두에 적합한 단백질 제제 기술을 자세히 설명하여 액체 크로마토그래피 (LC)-MS / MS 분석을위한 적절한 펩타이드 제출을 초래합니다. LFQ의 높은 처리량 일반 특성은 광범위한 동적 단백질 식별 및 정량화뿐만 아니라 모든 숙주 병원체 감염 설정으로의 전달 가능성을 허용하여 극도의 감도를 유지합니다. 이 방법은 감염 모방 조건 내에서 병원균의 광범위하고 편견없는 단백질 풍부 프로파일을 카탈로그화하도록 최적화되어 있습니다. 구체적으로, 여기서 입증된 방법은 독성에 필요한 단백질 생산과 같은 C. neoformans 병인에 대한 필수 정보를 제공하고 미생물 침입에 대응하는 중요한 숙주 단백질을 식별한다.

서론

침습적 곰팡이 감염의 보급은 크게 증가하고 면역 결핍 성소^1을가진 개별에서 가장 일반적으로 보고된 받아들일 수 없을 정도로 높은 사망률과 상관관계가 있습니다. Cryptococcus neoformans는 호스트 대식세포 세포 내의 세포 내 생존을 할 수 있는 악명 높은 기회성 곰팡이 병원체입니다. 부적절한 항진균 개입은 곰팡이 보급과 크립토 코칼 뇌막염 및 뇌막염^2,3의생명을 위협하는 증상을 초래합니다. 면역 손상 상태의 글로벌 증가는 항진균제의 사용에 병렬 증가를 요구하고있다, 있는 많은 곰팡이 종, C. neoformans를 포함하여, 점점^4,5,6을향해 저항을 진화하고있다. 따라서 호스트 방어 반응 및 미생물 병인에 관한 중요한 생물학적 질문에 답하기 위해 강력하고 효율적인 기술을 구현하는 것이 필수적입니다.

강력한 전산 및 생물정보 파이프라인 의 생성을 포함한 질량 분광법(MS)의 기술 발전의....

프로토콜

BALB/c 마우스에서 파생된 대식세포의 불멸의 선은 겔프 동물 활용 프로토콜 4193 대학에 의해 승인된 다음 프로토콜에 사용되었다. 특히, 마우스 또는 불멸의 세포의 다른 소스의 다른 변종은 상세한 매개 변수를 최적화하기에 충분한 테스트를 통해 설명된 프로토콜에 적용될 수 있다. 다음 프로토콜은 대식세포 세포의 얼어붙은 유리병으로 시작하는 단계를 탐색합니다. 세포는 10% FBS(태아 소 혈청), 1% L-글루타민 및 5% 펜/스트렙(페니실린-스트렙토마이신) 혼합물에서 DMEM(덜벡코의 수정이글 미디엄) 및 20% DMSO(디메틸 설프리산화물)에 저장됩니다.

1. C. 네오포맨의 배양

1. 글리세롤 스톡을 사용하여, 일행 야생형 C. 네오포만스 스트레인(H99)을 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD) 천판에 사용하여 단일 콜로니를 분리한다.
2. 정적 인큐베이터에서 37 °C에서 16 시간 동안 하룻밤 동안 배양하십시오.
3. 느슨하게 덮인 10 mL 테스트 튜브에서 YPD 국물의 5 mL에서 야생 형 C. 네오포만스 변형과 문화의 단일 식민지를 선택합니다. 네 배로 수행합니다.
4. 200 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 37 °C에서 1....

결과

위에서 설명한 프로토콜은 단일 실험에서 곰팡이 병원균, C. neoformans및 숙주, 대식세포 세포 모두에서 파생된 단백질의 식별 및 정량화를 가능하게 합니다. 공동 배양에 이어, 세포는 수집 및 처리되며 각 종에 특정한 펩타이드 프로파일을 기반으로 생체정보학적으로 분리된다. 이것은 감염 도중 호스트 병원체 관계의 상호 작용을 정의하기 위한 강력한 접근입니다. 실험에서 확인된 단백질의 수는 시작 재료, 샘플 준비, 그라데이션 길이, MS 계측 및 생물 정보 학적 워크플로우에 따라 달라집니다. 본 명세서에 기재된 프로토콜을 사용하여, 우리는 전형적으로, 1,500C neoformans 단백질 및 6,500개의 숙주 단백질을 가진 실험에서 대략 8,000개의 단백질을 확인합니다. 데이터 집합의 처리에 따라, 우리는 우리의 분석을 구동 하는 중요 한 요인을 관찰 하는 주 성분 분석 (PCA) 플롯을 생성(그림 2A). 여기서, 우리는 실험 설계(.......

토론

프로토콜의 중요한 단계는 세포에 최소한의 중단을 가진 단백질 처리를 위한 대식세포 의 준비 그리고 공동 배양 견본의 집합을 포함합니다. 수집하기 전에 세포의 불필요한 용해를 방지하기 위해 씻고, 접종하고, 부착 된 대식세포 세포를 부드럽고 신중하게 제거하는 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 실험에 대한 올바른 MOI를 확립하는 것은 지나치게 높은 MOI로 접종하면 급속한 대식세포 사망과 MS에 대한 샘플 수집 및 처리의 어려움을 야기할 수 있으므로, 반대로, 낮은 MOI 숫자는 더 적은 phagocytosed 곰팡이 세포와 생물학적 시스템에서 곰팡이 단백질의 제한된 검출으로 이어질 것입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 다양한 MOI를 가진 시험 실험을 수행하는 것이 좋습니다, 세포 사멸 분석 (예를 들어, LDH 정량화)에 의해 지원 호스트 응답을 시작하지만 수집하기 전에 숙주 세포를 죽이지 않는 곰팡이 세포의 수를 정의합니다. 실험을 위해, 우리는 고도로 풍부한 숙주 단백질 중 곰팡이 단백질을 적절하게 검출하기 위해.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100 mM Tris-HCl, pH 8.5	Fisher Scientific	BP152-1	4°C 유지; C
60 x 15 mm 접시, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
6웰 세포 배양 플레이트	ThermoFisher Scientific	140675
아세토니트릴, MS 등급	Pierce	TS-51101
아세트산	Sigma Aldrich	1099510001
아세톤	Sigma Aldrich	34850-1L
암모늄 중탄산염(ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500	실온에서 최대 1개월 동안 안정적인 50mM ABC 용액을 준비합니다.
벨 아트 &트레이드; HiFlow 진공 흡입기 수집 시스템	Fisher Scientific	13-717-300	필수는 아니며 혈청학 피펫을 사용하여 매체를 제거할 수 있습니다.
C18 수지	3M Empore	3M2215
세포 스크레이퍼	VWR	10062-906	필수는 아니며 대식 세포 세포를 방출하는 다른 방법을 사용할 수 있습니다.
Centrifugal vaccuum concentrator	Eppendorf	07-748-15
Complete Filtration Unit	VWR	10040-436
Conical falcon tubes (15 mL)	Fisher Scientific	05-539-12
Countess II Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	필수는 아니며 혈구계를 대안으로 사용할 수 있습니다.
CytoTox 96 비방사성 세포 독성 분석	Promega	G1780
디티오트레이톨(DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861	1M DTT의 벌크 저장 용액을 준비하고 급속 냉동 및 -20°C에서 보관합니다. C를 사용할 때까지. 사용 후에는 폐기하십시오(반복적으로 동결-해동하지 마십시오).
DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제	ThermoFisher Scientific	10566016
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	60°C에서 배양하여 열 비활성화; C를 30분 동안 누릅니다. 50ml의 부분 표본과 급속 냉동을 준비합니다. 매체 준비 전 해동
혈구계	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	40 mM HEPES/8 M 요소를 벌크 재고 용액으로 준비, 플래시 냉동, -20°C에서 보관; C를 사용할 때까지. 사용 후에는 폐기하십시오(반복적으로 동결-해동하지 마십시오).
고성능 액체 크로마토그래피 시스템	ThermoFisher Scientific	LC140	그래디언트 길이는 시료 복잡성을 기반으로 하며, 감염체 시료에 권장되는 120분 그래디언
고분해능 질량 분석기	ThermoFisher Scientific	726042
Iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich	I6125	0.55 M 벌크 재고 용액 준비, 플래시 냉동, -20°deg에서 보관; C를 사용할 때까지. 사용 후에는 폐기하십시오(반복적으로 동결-해동하지 마십시오).
L-글루타민	ThermoFisher Scientific	25030081	부분 표본 및 냉동하여 보관할 수 있습니다. 미디어 준비 전에 해동하십시오.
LoBind Microcentrifuge tubes	Eppendorf	13-698-794
Microcentrifuge	Eppendorf	13864457
	의 컴퓨터 분석 단계를 설명하는 MaxQuant Summer School과 같은 튜토리얼을 제공하는 공개 플랫폼입니다
			저장을 위해 분취 및 냉동 할 수 있습니다. 미디어 준비 전에 해동하십시오.
펩타이드 분리 컬럼	ThermoFisher Scientific	ES803
Perseus 소프트웨어	http://maxquant.net/perseus/
인산염 완충 식염수	VWR	CA12001-676	Puchase는 필요하지 않습니다. PBS도 준비할 수 있지만 사용하기 전에 멸균 여과를 수행해야 합니다.
Pierce BCA 단백질 분석	ThermoFisher Scientific	23225
피펫, 일회용 혈청학적(10mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
피펫, 일회용 혈청학적(25mL) Basix	Fisher Scientific	14955235
프로브 sonciator	ThermoFisher Scientific	100-132-894
프로테아제 억제제 칵테일 정제	Roche	4693159001
Sodium dodecyl sulfate	ThermoFisher Scientific	28364	20% (w/v)
분광광도계(나노드롭)	ThermoFisher Scientific	ND-2000
STAGE tipping centrifuge	Sonation	STC-V2
Thermal Shaker	VWR	NO89232-908
Trifluoroacetic acid	ThermoFisher Scientific	85183
Trypsin/Lys-C 프로테아제 혼합물, MS 등급	피어싱	A40007	-20°C에서 유지
초음파 욕조	Bransonic	A89375-450	냉장실 보관 (4C)
우레아	Sigma Aldrich	U1250-1KG	벌크 재고 용액에 40 mM HEPES / 8 M 우레아를 준비, 플래시 냉동, -20 °°C에서 보관; C를 사용할 때까지. 사용 후에는 폐기하십시오(반복적으로 동결-해동하지 마십시오).
효모 추출물 펩톤 포도당 육수	BD Difco	BM20

트입니다. MaxQuant https://maxquant.org/ MaxQuant는 대규모 MS 데이터 세트 Penicillin : Streptomycin 10k/10k VWR CA12001-692.