면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.
면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.
복잡한 질병 모델에는 생리학적, 병리학적으로 관련성이 있고 실행 가능한 통찰력을 제공하고 다른 방법으로는 보이지 않는 프로세스를 공개할 수 있는 최첨단 도구가 필요합니다. 생체 내 풍경을 밀접하게 모방한 고급 세포 분석은 암의 진행에 영향을 미치는 양방향 종양-숙주 상호작용을 시각화하고 측정하는 새로운 방법으로 자리 잡고 있습니다. 여기에서는 자연 및 치료 유발 면역 감시 하에서 종양 미세 환경(TME)의 복잡성을 모방하여 마이크로 장치에서 고도로 제어 가능한 2D 및 3D 공동 배양을 재현하는 두 가지 다목적 프로토콜에 대해 설명합니다. 섹션 1에서는 명시야 타임랩스 현미경으로 부착 종양 세포와 부유 면역 집단 간의 누화를 모니터링하기 위한 실험 설정이 제공됩니다. 적용 시나리오로서, 우리는 면역 세포의 모집 및 활성화에 대한 소위 면역 원성 암세포 사멸 유도제와 같은 항암 치료의 효과를 분석합니다. 섹션 2에서는 3D 종양 면역 미세 환경이 경쟁력 있는 레이아웃으로 조립됩니다. 차등 면역 침윤은 최대 72시간의 형광 스냅샷으로 모니터링되어 병용 치료 전략을 평가합니다. 두 설정 모두에서, 과다한 면역 세포 파라미터(예를 들어, 면역 세포 이동 및 상호작용, 치료제에 대한 반응)를 추출하기 위한 이미지 처리 단계가 예시된다. 이러한 간단하고 강력한 방법은 암, 기질 및 면역 세포 아형의 이질성과 가소성뿐만 아니라 암 진화의 동인으로서의 상호 상호 작용을 포함하는 TME의 복잡성을 시뮬레이션하기 위해 추가로 맞춤화될 수 있습니다. 빠르게 진화하는 기술을 라이브 셀 고함량 이미징과 함께 사용하면 대규모 정보 데이터 세트가 생성되어 새로운 문제가 발생할 수 있습니다. 실제로 삼각형 ''공동 배양/현미경/고급 데이터 분석'은 맞춤형 치료 프로토콜을 지원할 수 있는 정확한 문제 매개변수화를 향한 경로를 설정합니다. 우리는 고처리량 처리를 위한 인공 지능과 암 면역 온어칩의 향후 통합이 정밀 및 개인화된 종양학을 위한 예측 및 전임상 도구로서의 기능을 활용하는 데 있어 큰 진전을 이룰 것으로 기대합니다.
실험 분야로서의 다양한 의학 분야의 진화는 통제된 조건 하에서 세포 집단과 장기 기능을 조작하는 능력에 달려 있다1. 이러한 능력은 우리 몸에서 일어나는 과정을 요약할 수 있는 측정 가능한 모델의 가용성에 뿌리를 두고 있습니다.
면역요법 및 단세포 게놈 프로파일링 2의 시대에, 암 생물학은 적절한 시공간적 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위해 새로운 시험관 내 및 전산 모델을 활용해야 합니다 2,3.
종양미세환경4(TME)는 암세포가 다른 세포(면역, 기질 및 내피 세포) 및 비세포(세포외 기질, ECM) 구성 요소와 지속적으로 상호 작용하고 동적으로 공동 진화하는 복잡한 조직입니다. 이 복잡한 환경의 역동적인 특성은 면역 세포가 악성 세포의 친구 역할을 하는지 아니면 적으로 작용하는지 여부를 결정하여 질병 진행과 치료에 대한 반응 모두에 큰 영향을 미칩니다. 오늘날, 종양 면역학자, 생물 정보학자 및 시스템 생물학 전문가들의 많은 노력이 공간(즉, 뚜렷....
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1. 부착 및 부유 세포 2D 공동 배양을 위한 칩 설계
참고: 2D 공동 배양 레이아웃(그림 1A-C)은 두 세트의 마이크로채널 어레이(500 x 12 x 10μm 3, L×W×H)로 상호 연결된3개의 챔버(높이 100μm)가 특징입니다. 중간 챔버는 로딩 단계 2.5 동안 종양 부위로 넘쳐 흐르는 부유 면역 세포를 차단하는 두 개의 폐쇄된 막다른 구획을 형성합니다. 이 장치 유형은 단일 세포(부착 또는 부유) 운동성 및 세포-세포 상호 작용(16,27,28,30,31)의 실시간 2차원 측정에 유용합니다. 전형적인 세포 이동 연구(몇 시간에서 며칠까지 수행됨)는 획득된 이미지 시퀀스를 수치적 특징(25)으....
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종양 면역 침윤은 숙주 항종양 반응의 파라미터이다. 종양은 침윤 백혈구의 구성, 밀도, 위치 및 기능적 상태에서 이질적이며, 암세포와의 상호 작용은 질병 경과 및 치료에 대한 반응을 예측하기 위해 임상적으로 관련된 정보의 기초가 될 수 있습니다. 이러한 의미에서 미세유체 기술은 종양의 면역 조직을 탐색하고 항암 요법에 대한 반응을 모니터링하기 위한 보완적이고 특권적인 체외 도구로 사용될 수 있습니다. 미세유체 분석, 생세포 이미징 및 추적 소프트웨어의 결합은 면역 세포가 다양한 맥락에서 이동 패턴을 조정하는 방법을 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 정량화 방법을 확립할 수 있습니다. 이 장에서는 표준 소프트 리소그래피 절차로 실현된 임시 미세 유체 장치에서 면역 및 표적 암세포의 다목적 2D 또는 3D 공동 배양을 설정하는 단계를 보고했습니다. 섹션 1에서는 부착성(MDA-MB-231 암세포)과 비부착성(PBMC) 집단 간의 화학적 및 물리적 접촉을 허용하기 위해 미세유체 장치를 사용했습니다. 일부 화학요법제(예를 들어, 다른 것.......
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설명된 방법은 보다 관련성이 높은 시험관 내 모델의 채택으로 이점을 얻을 수 있는 종양 면역학 분야의 두 가지 중요한 측면을 조정 가능한 복잡성으로 요약하기 위한 일반적인 접근 방식을 설계하려고 합니다. 첫 번째는 종양 세포 집단 측면과 관련이 있으며, 단일 세포 특성을 다루면 치료에 대한 내성, 전이에 대한 성향, 줄기 세포 및 분화 등급을 포함하여 이질성과 상관관계가 있는 생물학적 및 임상적 중요성에 대한 더 나은 설명으로 이어질 수 있습니다. 이야기의 다른 측면은 질병의 특성과 치료63, 특히 면역 요법에 대한 개인의 반응을 심오하게 형성할 수 있는 비암성 구성 요소(면역 및 기질 세포, 혈관) 및 화학적/물리적 환경(ECM 구성 요소, 케모카인 및 기타 용해성 인자 방출)을 포함하는 TME로 대표됩니다. 설명된 접근 방식을 다른 연구 분야로 내보내려면 새로운 모델의 개발 및 채택으로 인한 한계와 과제에 대한 깊은 이해가 필요합니다.
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저자는 공개 할 것이 없습니다. AS는 Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 # 18418) 및 Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273)의 지원을 받고 있습니다. GS 및 FM은 이탈리아 암 연구 협회(AIRC) 번호 21366에서 GS의 지원을 받습니다.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강>세포 배양 재료 | |||
| 50 mL 튜브 | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS430828 | 원심분리 튜브 |
| 5-aza-2'-deoxycytidine DAC | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | A3656 | DNA-하이포메틸화제 |
| 6-웰 플레이트 | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS3506 | 배양 접시 |
| 75cm2 세포 배양 처리 플라스크 | Corning, New York, NY | 430641U | 배양 플라스크 |
| A365M | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | br/> CVCL_B222 | 인간 흑색종 세포주 |
| 독소루비신 염산염 | Millipore-Sigma; 세인트루이스, MO | D1515 | 안트라사이클린 항생제 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM | EuroClone Spa, 밀라노, 이탈리아 | ECM0728L | SK-MEL-28 세포용 배양 배지 |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB4004L | Saline Buffer solution |
| Fetal Bovine Serum | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECS0180L 세포 배양 | |
| 보조 Ficoll | GE-Heathcare | 17-1440-02 | 인간 혈액에서 단핵 세포 분리. |
| 혈구계 | Neubauer | 세포 계수 | |
| Heparinized 바이알 | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 정맥혈 채취 | |
| 용 바이알 인터페론 알파 -2b | Millipore-Sigma; 세인트루이스, 미주리 | SRP4595 | 재조합 인간 사이토 카인 |
| L-Glutamine 100X | EuroClone Spa, 밀라노, 이탈리아 | ECB3000D | 세포 배양 보조 |
| 액체 질소 | |||
| 림프폴라이트 세포 분리 매체 | Cedarlane Labs, Burlington, Canada | 밀도 구배 원심분리에 의한 림프구 분리 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway | ||
| Matrigel | Corning, New York, NY | 354230 | 성장 인자 감소 기저막 매트릭스 |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection(ATCC), 버지니아주 매너서스 | HTB-26 | 인간 유방암 세포주 |
| 페니실린/ 스트렙토마이신 100X | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB3001D | 세포 배양 보조 |
| 피펫 에이드 | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | 액체 처리 |
| PKH26 적색 형광 세포 링커 | Millipore-Sigma; 세인트루이스, 미주리 | PKH26GL | 녹색 형광 세포 |
| 염료 PKH67 녹색 형광 세포 링커 | Millipore-Sigma; 세인트루이스, 미주리 | PKH67GL | 녹색 형광 세포 염료 |
| RPMI-1640 | EuroClone Spa, 밀라노, 이탈리아 | ECM2001L | MDA-MB-231 세포 |
| (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, | MO CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 | 액체 취급 |
| 멸균 팁 (1-10 μ L, 10-20 μ L, 20-200 μ L, 1000 &뮤; L) | EuroClone Spa, 이탈리아 밀라노 | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; | 마이크로피펫 |
| 타이머 | |||
| Trypan Blue 솔루션 | Thermo Fisher Scientific Inc., 매사추세츠주 월섬 | 15250061세포 | 생존율 평가를 위한 세포 염색 |
| Trypsin | EuroClone Spa, 이탈리아 밀라노 | ECM0920D | 부착 세포 |
| <강력>세포 배양 장비 | |||
| EVOS-FL 형광 현미경 | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 살아있는 세포용 형광 현미경 | |
| Humified cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230 | 37 °에서 세포 배양의 배양; C, 5% CO2 |
| Juli 현미경 | Nanoentek | ||
| 실험실 냉장고 (4 ° C) | FDM | ||
| 실험실 안전 캐비닛 (클래스 II) | 멸균 VBH 72 MP | 층류 후드 | |
| 광학 현미경 | Zeiss | ||
| 냉장 가능한 원심 분리기 | Beckman Coulter | ||
| 온도 조절 수조 | |||
| < 강>미세 가공 재료 | |||
| 3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes) | Sigma Aldrich | A3648 | 실란화 제제는 PDMS를 플라스틱 커버슬립에 접착하기 위한 것입니다 |
| 크롬 석영 마스크 / 4"x4", HRC / AZ 없음 | MB 승& 에이, 독일 | 포토리소그래피용 광학 마스크 | |
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| SU-8 3005 | 마이크로 레지스트 기술, 독일 | C1.02.003-0001 | 네거티브 포토레지스트 |
| SU-8 3050 | 마이크로 레지스트 기술, 독일 | C1.02.003-0005 | 네거티브 포토레지스트 |
| 바이오 펀치 제품군, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm | Tedpella | 15111-40, 15111-60, 15111-80 | 칩 저장소 용 피부 생검 펀치 |
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