방법 논문

미세 유체 장치에서 전기장 유발 신경 전구체 세포 분화

DOI:

10.3791/61917

⸱

2021년 4월 14일

 ,  , 
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang Ming Chao Tung University, 3Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 4College of Engineering, Chang Gung University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에서는, 우리는 신경 줄기와 전구 세포 (NPC)의 분화를 위한 프로토콜을 제시합니다(NPC) 전적으로 미세 유체 시스템에서 직접 전류 (DC) 펄스 자극에 의해 유도.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생리전기장(EF)은 세포 이동, 분화, 분열 및 사망에 중요한 역할을 합니다. 이 논문은 현미경 검사를 사용하여 장기 세포 분화 연구에 사용 된 미세 유체 세포 배양 시스템을 설명합니다. 미세 유체 시스템은 광학적으로 투명한 전기 전술 칩, 투명한 인듐 틴-옥사이드(ITO) 히터, 배양 미디어 충전 펌프, 전기 전원 공급 장치, 고주파 파워 앰프, EF 멀티플렉서, 프로그래밍 가능한 X-Y-Z 동력 단계, 그리고 디지털 카메라가 장착된 반전 위상 마이크로 콘트라스트 등 다음과 같은 주요 구성 요소로 구성됩니다. 미세 유체 시스템은 전반적인 실험 설정을 단순화하고 시약 및 시료 소비를 단순화하는 데 유용합니다. 이 작업은 직접 전류 (DC) 펄스 자극에 의해 유도 된 신경 줄기 및 전구 세포 (NPC)의 분화를 포함한다. 줄기 세포 유지 배지에서, 마우스 NPC (mNPC)는 DC 펄스 자극 후 뉴런, 성상 세포 및 올리고드 엔드로시테로 분화되었다. 결과는 간단한 DC 펄스 처리가 mNpCs의 운명을 통제할 수 있고 신경계 무질서를 위한 치료 전략을 개발하는 것을 이용될 수 있었다는 것을 건의합니다. 이 시스템은 여러 채널의 세포 배양, 장기 EF 자극, 세포 형태 학적 관찰 및 자동 시간 경과 이미지 수집에 사용할 수 있습니다. 이 미세 유체 시스템은 필요한 실험 시간을 단축할 뿐만 아니라 미세 환경에 대한 제어 정확도도 증가합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경 전구체 세포(NPC, 신경 줄기 및 전구세포라고도 함)는 신경퇴행성 치료 전략1에대한 유망한 후보일 수 있다. 차별화되지 않은 NPC는 자체 갱신 능력, 다중 효능 및 증식 능력2,3을가지고 있습니다. 이전 연구는 세포외 매트릭스와 분자 중재자가 NPC의 분화를 조절한다고 보고했습니다. 표피 성장 인자(EGF) 및 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF)는 NPC 증식을 촉진하여 미분화 상태4를유지한다.

이전 연구는 전기 자극이 분열5,마이그레이션6,7,8,분화1,9,10및 세포 사멸(11)과 같은 세포 생리적 활동을 조절할 수 있다고보고하였다. 전기장(EF)은 중추신경계 개발12,13,14의개발 및 재생에 중요한 역할을 한다. 2009년부터 2019년까지, 이 실험실은 미세유체 시스템1,6,7,8,15,16,17에서 EF의적용에대한 세포 반응을조사했다. 멀티채널, 광학적으로 투명한, 전기전술(MOE) 칩은 공초점 현미경검사법에 면역형광 염색에 적합하도록 설계되었습니다. 칩은 높은 광학 투명성과 좋은 내구성을 가지고 있으며, 하나의 연구에서 세 개의 독립적 인 자극 실험과 여러 면역 스테인드 조건의 동시 수행을 허용했다. 미세 유체 시스템은 전반적인 실험 설정을 단순화하고 시약 및 시료 소비를 단순화하는 데 유용합니다. 이 논문은 장기 세포 분화 연구에 사용 된 미세 유체 세포 배양 시스템의 개발을 설명합니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MOE 칩의 설계 및 제조

  1. 개별 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 레이어 및 적절한 소프트웨어를 사용하여 양면 테이프에 대한 패턴을그립니다(그림 1A,재료의 표). CO2 레이저 기계 스크라이브(도1B)로PMMA 시트와 양면 테이프를 모두 잘라냅니다.
    1. CO2 레이저 스크라이브를 켜고 개인용 컴퓨터에 연결합니다. 소프트웨어를 사용하여 설계된 패턴 파일을 엽니다.
    2. PMMA 시트(275mm x 400mm) 또는 양면 테이프(210mm x 297mm)를 레이저 스크라이브(그림2A)의플랫폼에 놓습니다. 자동 초점 도구를 사용하여 PMMA 시트 또는 양면 테이프의 표면에 레이저를 집중합니다.
    3. 레이저 스크라이브를 프린터로 선택한 다음 레이저 스크라이브를 사용하여 패턴을 "인쇄"하여 PMMA 시트 또는 양면 테이프에서 직접 절제를 시작하고 PMMA 시트 또는테이프(도 2B)에서개별 패턴을 얻습니다.
  2. PMMA 시트에서 보호 필름을 제거하고 질소 가스를 사용하여 표면을 청소하십시오.
    참고: PMMA 패턴의 도면 및 PMMA 시트의 직접 가공은 이전 보고서17에따라 수행되었다.
  3. PMMA 시트의 여러 층을 결합하기 위해, 1mm PMMA 시트의 3 개 조각 (레이어 1, 2 및 3)을 쌓고 110 °C에서 30 분 동안 열 본더에서 5kg / cm2의 압력하에서 결합하여 유동 / 전기 자극 채널 어셈블리(그림 2C)를형성합니다.
    참고: 상업적으로 획득한 PMMA 시트의 상이한 배치는 약간 다른 유리 전이 온도(Tg)를 가지는 데. 최적의 접합 온도는 Tg에 가까운 5°C 증분에서 테스트해야 합니다.
  4. 빠르게 작용하는 시아노아크라일트 접착제로 MOE 칩 어셈블리의 레이어 1의 개별 개구부에 12개의 어댑터를 부착합니다.
    참고: 어댑터는 사출 성형에 의해 PMMA로 만들어집니다. 하단의 평평한 표면은 MOE 칩에 연결하기 위한 것입니다. 1/4W-28 의 여성 나사 스레드가 있는 어댑터는 흰색 손가락이 단단한 플러그, 평평한 바닥 커넥터 또는 Luer 어댑터를 연결하기 위한 것입니다. 빠르게 작용하는 시아노아크라일트 접착제를 사용할 때는 주의하십시오. 눈에 튀는 것을 피하십시오.
  5. 칩 조립 전에 30분 동안 자외선(UV) 조사를 이용하여 1mm PMMA 기판(Layer 1-3), 양면 테이프(Layer 4), 및 3mm 광학 등급PMMA(Layer 5)를 소독한다.
  6. PMMA 어셈블리(도 1-5)를 완료하기 위해 양면 테이프(Layer 4)와 함께 3mm 광학 등급 PMMA(Layer 5)에 1mmPMMA 기판(Layer 1-3)을 부착한다.
  7. 칩의 조립을 위해 깨끗한 커버 유리를 준비합니다.
    1. 스테인링 항아리에 세제의 10배 희석제를 채우고(재료의 표참조) 초음파 클리너를 사용하여 이 세제의 커버 글래스를 15분 간 청소합니다.
    2. 흐르는 수돗물 아래에 염색 항아리를 철저히 헹구어 세제의 모든 흔적을 제거합니다.
    3. 증류수로 헹구어 수돗물의 모든 흔적을 제거하고 1.7.2단계를 두 번 반복합니다.
    4. 질소 가스로 불어 청소 된 커버 유리를 건조.
  8. PMMA 어셈블리(레이어 1-5), 양면 테이프(Layer 6), 및 칩 조립 전에 30분 동안 생물안전 캐비닛 내부의 UV 조사를 사용하여 커버글래스(Layer7)를 소독한다.
  9. 양면 테이프(도 6)로 청소된 커버 글래스(레이어7)를PMMA 어셈블리(레이어 1-5레이어)에 부착한다.
  10. 하룻밤 진공 챔버에서 MOE 칩을 배양; 후속 절차에 대한 MOE 칩 어셈블리를사용합니다(그림 3).

2. 세포 배양 영역의 기판에 폴리 L-리신(PLL)을 코팅

  1. 폴리테트라플루오로틸렌 튜브, 플랫 바텀 커넥터, 콘 커넥터, 콘-루어 어댑터, 화이트 핑거 타이트 플러그(스토퍼라고도 함), 루어 어댑터, 루어 잠금 주사기 및 검은 고무붕(그림 4A,재료 표)을 준비한다. 위의 모든 부품을 121°C에서 30분 동안 자동 복제로 살균합니다.
  2. 흰색 손가락 꽉 플러그와 함께 천 교량 어댑터(그림 1A)의개구부를 밀봉합니다. 중간 입구 및 콘센트 어댑터(도4B)를통해 평평한 하단 커넥터를 MOE 칩 어셈블리에 연결합니다. 콘 루어 어댑터를 3방향 스톱콕에 연결합니다.
  3. 중간 입구의 3방향 스톱콕에 연결되는 3mL 주사기를 사용하여 0.01% PLL 용액2mL을 추가합니다(도4B figure-protocol-1 -).
  4. 중간 콘센트의 3 방향 스톱콕에 빈 3 mL 주사기를 연결(도 4B figure-protocol-2 -).
  5. PLL 용액으로 세포 배양 영역을 채웁니다. 코팅 용액을 천천히 앞뒤로 펌핑합니다. 문화 영역 내부의 솔루션을 밀봉하기 위해 두 개의 3 방향 스톱콕을 닫습니다.
  6. 5% CO2 대기로 채워진 인큐베이터에서 하룻밤 동안 37°C에서 MOE 칩을 배양합니다.

3. 소금 교량 네트워크 준비

  1. 다음 단계 2.6, 두 개의 3 방향 스톱콕을 열고 수동으로 두 주사기를 사용하여 채널에서 코팅 용액을 앞뒤로 펌핑하여 채널의 거품을 플러시.
  2. 완벽한 매체(덜벡코의 수정된 이글의 매체/햄의 영양소 혼합물 F-12(DMEM/F12)로 구성된 줄기세포 유지보수 배지, 2% B-27 보충제, 20 ng/mL EGF, 및 20 ng/mL bFGF) 3 mL 주사기로 배지 입구의 3방향 스톱콕에연결(도 4B- figure-protocol-3 및 도 4B figure-protocol-4 -).
  3. 세포 배양 영역에서 코팅 용액을 대체하기 위해 완전한 배지 3mL를 추가합니다. 중간 콘센트의 3 방향 스톱콕에 빈 5 mL 주사기를 연결(도 4B figure-protocol-5 -).
  4. 소금 교량네트워크(그림 5)를준비합니다.
    1. 검은 고무 덩어리를 잘라 틈새를 생성하고, 검은 고무 붕을 통해 및 루어 잠금 주사기(도 4A)에은 (Ag)/실버 염화물 (AgCl) 전극을 삽입합니다.
    2. 흰색 손가락 밀폐 플러그를 Luer 어댑터로 교체하고 3% 뜨거운 아가로즈를 주입하여 Luer 어댑터를 채웁니다.
      참고: 뜨거운 아가로즈를 준비하기 위해, 100mL의 인산염 완충식식염수(PBS)에 아가로즈 분말 3g을 용해하고 121°C에서 30분 동안 오토클레이브로 살균한다.
    3. Luer 잠금 주사기를 Luer 어댑터에 연결합니다. 검은 고무 붕을 통해 3 % 뜨거운 아가로즈를 주입하여 주사기를 바늘로 사용하여 Luer 잠금 주사기를 채웁니다. 아가로즈가 식히고 굳어지도록 10-20분 간 허용합니다.
      참고: 아가로즈의 부피 용량을 늘리기 위해 Luer 잠금 주사기가 Luer 어댑터(그림4 및 도 5)에장착됩니다. 그런 다음 대형 전극을 Luer 잠금 주사기에 삽입합니다. 전극은 장기 실험을 위해 안정적인 전기 자극을 제공할 수 있습니다.

4. mNPC 준비

  1. mNNP1을 5%CO2 대기로 채워진 인큐베이터에서 37°C에서 37°C에서 25T 세포 배양 플라스크에서 완전한 배지로 배양한다. 세포를 3-4일마다 배양하고, 원래 소스로부터 3-8개의 구절을 거친 세포를 가진 모든 실험을 수행한다.
  2. 세포 현탁액을 15mL 원문 튜브로 옮기고, 신경구를 100 × g에서 5분 동안 스핀다운한다. 슈퍼나탈을 흡인시키고, 1x 덜벡코의 PBS(DPBS)로 신경구를 씻는다. 신경구를 100 × g에서 5분 동안 스핀다운합니다.
  3. 1x DPBS를 흡인한 다음 전체 배지에서 신경구를 다시 분리합니다. 철저하고 부드럽게 섞습니다.
  4. 콘센트의 3방향 스톱콕에 연결되는 1mL 주사기를 사용하여 신경권 서스펜션 1mL를 추가한다(도4B figure-protocol-6 -).

5. DC 펄스 자극을위한 미세 유체 시스템의 설정(그림 6)

  1. 프로그래밍 가능한 X-Y-Z 전동 스테이지에 고정된 투명 ITO 히터에 셀 시드 MOE 칩을 설치합니다.
    참고: ITO 표면 온도는 비례 일체형 유도체 제어기에 의해 제어되고 37°C에서 유지됩니다. K형 열전대는 칩 내의 세포 배양 영역의 온도를 모니터링하기 위해 칩과 ITO 히터 사이에 고정된다. MOE 칩은 프로그래밍 가능한 X-Y-Z 전동 단계에 설치되며 개별 채널 섹션에서 자동 타임랩스 이미지 획득에 적합합니다. ITO 히터의 제조 및 세포 배양 가열 시스템의 설정은 이전에18,19로기술되었다.
  2. 중간 콘센트를 통해 MOE 칩에 수동 펌핑하여 mNPC를 주입합니다. 세포 시드 MOE 칩을 37°C ITO 히터에 4시간 동안 배양한다.
  3. 4시간 후, 주사기 펌프를 사용하여 20 μL/h의 유량으로 매체 입구를 통해 MOE 칩을 통해 전체 배지를 펌핑한다.
    참고: mNNC는 EF 자극 전에 추가로 24시간 동안 칩에서 재배되고 유지되어 세포 부착 및 성장을 허용합니다. 폐액은 도 6A에서"폐기물"로 표시된 콘센트의 3방향 스톱콕에 연결된 빈 5mL 주사기로 수거된다. MOE 미세 유체 시스템 구성은 도 6에도시되어 있다. 이 미세 유체 시스템은 세포에 영양의 지속적인 공급을 제공합니다. 완전한 신선한 매체는 일정한 pH 값을 유지하기 위해 MOE 칩으로 지속적으로 펌핑됩니다. 따라서, 세포는 CO2 인큐베이터 외부에서 배양될 수 있다.
  4. 전기 전선을 사용하여 칩의 Ag/AgCl 전극을 통해 EF 멀티플렉서를 MOE 칩에 연결합니다. EF 멀티플렉서와 기능 발생기를 증폭기에 연결하여 50% 듀티 사이클(50% 시간 켜기 및 50% 시간 간격)에서 100Hz의 주파수에서 300mV/mm의 크기로 출력제곱파 DC 펄스를 출력합니다(50% 시간 온 및 50% 시간 끄기)(그림6B).
    1. 전선을 EF 멀티플렉서에 연결합니다. Ag/AgCl 전극을 통해 전기 와이어를 MOE 칩에 연결합니다.
    2. EF 멀티플렉서를 전선을 사용하여 증폭기에 연결합니다. 기능 생성기를 앰프 및 디지털 오실로스코프에 연결합니다.
      참고: EF 멀티플렉서는 회로내 배양 챔버의 임피던스를 포함하고 병렬 전자 네트워크의 모든 개별 챔버를 연결하는 회로입니다. 3개의 배양 챔버는 각각 멀티플렉스에서 가변 저항기(Vr) 및 심미터(도 6A에서μA로 도시됨)에 연재되어 전기적으로 연결된다. 각 배양챔버를 통한 전류는 Vr을 제어하여 다양하며, 전류는 해당 심미터상에 도시된다. 각 세포 배양 영역의 전기장 강도는 옴의 법칙, I=θEA에 의해 계산되었으며, 여기서 나는 전류, σ(DMEM/F1220에대한 1.38S·m-1로 설정)은 배양 배지의 전기 전도도이며, E는 전기장이며, A는 전기챔버의 단면 영역이다. 도 1에도시된 세포 배양 영역 치수의 경우, 전류는 DC 및 DC 펄스에 대해 각각 50% 듀티 사이클에서 ~87mA 및 ~44mA이다.
  5. mNPC를 48h의 100Hz 주파수에서 300mV/mm의 크기로 DC 펄스를 제곱하도록 합니다. 세포에 적절한 영양을 공급하고 매체에서 일정한 pH 값을 유지하기 위해 10 μL/h의 속도로 전체 배지를 지속적으로 펌핑합니다.

6. 펄스 DC 자극 후 mNpC의 면역 불광 분석

참고: 이 단계에서는 모든 시약이 주사기 펌프를 사용하여 중간 입구를 통해 펌핑됩니다.

  1. 1번 시드 후 3, 7일 또는 14일 동안체외(DIV)를 배양한 후, 20분 동안 25 μL/min의 유속도로 1x PBS로 세포를 세척한다.
  2. 4% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 수정합니다. 1x PBS를 대체하기 위해 25 μL/min의 유속으로 칩에 4% PFA를 펌프합니다. 4% PFA를 대체하려면 20분 동안 25 μL/min의 유속도로 1x PBS로 셀을 세척하십시오.
  3. 0.1% 트리톤 X-100을 50 μL/분의 유속으로 칩에 넣고 6분 동안 투과하여 세포를 침투한다. 유량을 50 μL/h로 줄여 30분 동안 세포와 반응합니다. 0.1% 트리톤 X-100을 대체하려면 6분 동안 50 μL/min의 유속도로 셀을 1x PBS로 세척합니다.
  4. 비특이적 항체 결합을 감소시키기 위해 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 PBS를 사용하여 세포를 차단한다. 1% BSA를 칩에 50 μL/min의 유속으로 6분 동안 펌핑합니다. 유량을 100 μL/h로 줄이고 1시간 동안 펌프합니다.
  5. 6분 동안 50 μL/min의 유속으로 칩내내면역스테인링을 위한 항체를 펌핑하고, 칩을 4°C에서 18시간 동안 배양한다. 15 분 동안 50 μL /min의 유속도로 1 x PBS로 셀을 씻으셔.
  6. 알렉사 플루오르-컨쥬게이드 이차 항체를 6분 동안 50 μL/min의 유속으로 칩에 펌핑한다. 유량을 50 μL/h로 줄이고 어두운 실온에서 항체를 1시간 동안 펌핑합니다. 15 분 동안 50 μL /min의 유속도로 1 x PBS로 셀을 씻으셔.
  7. 핵 염색의 경우, 호흐트스트 33342를 20 μL/분의 유속으로 칩에 넣고 어둠 속에서 실온에서 10분 동안 펌핑합니다. 15 분 동안 50 μL /min의 유속도로 1 x PBS로 셀을 씻으셔.
  8. 면역 염색 후, 공초점 형광 현미경을 사용하여 세포를 관찰한다.

7. 이미지 분석 및 데이터 처리

  1. 내장 된 측정 도구가있는 소프트웨어를 사용하여 형광 이미지를 분석합니다 (재료 표참조).
  2. 대조군 및 치료군에서 Hoechst-counterstained 핵(총 세포 수)을 비교하고 각 표현성 마커를 발현하는 세포의 백분율을 계산합니다.

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결과

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MOE 칩의 상세한 구성은 도 1에도시된다. 미세 유체 칩은 실험 설정 크기, 샘플 볼륨 및 시약 볼륨을 줄이는 데 유익한 접근 방식을 제공합니다. MOE 칩은 단일 연구에서 3개의 독립적인 EF 자극 실험 및 여러 면역 염색 조건을 동시에 수행하도록설계되었습니다(그림 3). 또한 광학 적 투명성이 높은 MOE 칩은 공초점 현미경 검사에 적합합니다. MOE 칩은 또한 단일 실험에서 다른 세포 배양 조건(예를 들어, 다중 EF 자극, 여러 약물, 상이한 코팅 기판, 다중 일련의 세포의 효과)의 효과를 동시에 조사하도록 설계되었습니다.

mNPC는 제곱파 DC 펄스(100Hz 의 주파수에서 크기 300mV/mm)에 노출되었습니다. DC 펄스 자극은 48h를 위해 ...

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토론

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MOE 칩을 제작하는 동안 어댑터는 빠르게 작용하는 시아노아크라일트 접착제를 사용하여 MOE 칩의 레이어 1에 부착됩니다. 접착제는 어댑터의 4 모서리에 적용된 다음 어댑터 위에 압력이 균등하게 적용됩니다. 접착제의 완전한 중합을 보장하기 위해 과도한 양의 접착제를 피해야합니다. 또한 완성된 MOE 칩 어셈블리는 진공 챔버에서 배양됩니다. 이 단계는 PMMA 층, 양면 테이프 및 커버 글래스 사이의 거품을 제거하는 데 도움이됩니다.

전극 물질의 선택은 매체에 풍부하게 존재하는 염화물 이온이 세포 배양 영역을 통해 흐르는 전해질 제품이라는 사실에 근거한다. EF 자극 실험 동안 전극 주위의 pH는 일정하게 유지되었습니다. 전극 재료로서 백금(Pt)을 사용하는 간단한 구성은 물을 전해질 시키고수전전(H+) 및 수산화 이온(OH-)을 각각 양배 영역에서 pH 변화를 유도한다. Pt 전극의 사용을 피함으로써 EF 자극 실험 중 pH 변경 문제를 우...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 마우스 신경 줄기와 전구 세포 (mNPC)를 제공하는 그의 도움에 대한, 생물 의학 과학 연구소, 학계 Sinica 교수 탕 K. 탕 교수에게 감사드립니다. 저자는 또한 MNPC의 차별화에 대한 귀중한 토론을 위해 탕 K. 탕 교수와 이잉산 교수에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1mm PMMA 기판 (레이어 1-3)BHTK2R20폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA),
http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html 15 mL 플라스틱 튜브Protech Technology Enterprise Co., LtdCT-15-PL-TW캡이있는 원뿔형 바닥 튜브, 조립, 사전 살균
된 3 mL 주사기TERUMODVR-34133mL 구강 주사기, 바늘 없음
3mm 광학 등급 PMMA (레이어 5)CHI MEI CorporationACRYPOLY PMMA 시트광학 등급 PMMA
3방향 스톱콕NIPRONCN-3L멸균 일회용 3방향 스톱콕
5mL 주사기TERUMODVR-34105mL 구강 주사기, 바늘 없음
어댑터Dong Zhong Co., Ltd.맞춤형PMMA 어댑터
AgaroseSigma-AldrichA9414Agarose, 저겔화 온도
증폭기AA Lab Systems LtdA-304고전압 증폭기
AutoCAD 소프트웨어Autodesk교육용 버전제도
B-27 보충제Gibco12587-010B-27 보충제(50x), 비타민 A 제외
염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) PeprotechAF-100-18B는 재조합 인간 FGF-basic
검은색 고무 마개TERUMODVR-34133 mL 구강 주사기에서, 바늘 없는
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-AldrichB4287차단 시약 
원심분리기HSIANGTAICV2060원심분리기
CO2 레이저 스크라이버Laser Tools and Technics Corp. ILS-II는 http://www.lttcorp.com/index.htm 콘 커넥터에서 구입했습니다.
IDEX Health & 과학F-120X원피스 핑거타이트 10-32 콘, 1/16" OD 천연
콘 루어 어댑터IDEX 건강 & ScienceP-659Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK
컨포칼 형광 현미경Leica MicrosystemsTCS SP5Leica TCS SP5 사용자 설명서, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
디지털 카메라OLYMPUSE-330자동 타임랩스 이미지 획득
디지털 오실로스코프TektronixTDS2024전자 회로 또는 구성 요소에서 시간 경과에 따른 전압 또는 전류 신호를 측정하여 진폭과 주파수를 표시합니다.
양면 테이프3M PET 8018http://en.thd.com.tw/
Dulbecco'에서 구매 s 변형 된 독수리' s 매체 / 햄의 영양 혼합물 F-12 (DMEM / F12)Gibco12400024DMEM / F-12, 분말, HEPES
Dulbecco의 인산 완충 식염수 (DPBS)Gibco21600010DPBS, 분말, 칼슘 없음, 마그네슘 없음
EF 멀티플렉서Asiatic Sky Co., Ltd.개별채널에서 전류를 모니터링하고 제어하는
맞춤형 표피 성장 인자 (EGF)PeprotechAF-100-15또한 재조합 인간 EGF라고도 불리는
빠른 행동 시아노아크릴레이트 접착제3M 7004T힘 즉시 접착제 (액체)
편평한 바닥 연결관IDEX 건강 & ScienceP-206플랜지리스 남성 너트 Delrin, 1/4-28 플랫-바텀, 1/16" OD 블루
함수 발생기Agilent Technologies33120A고성능 15 MHz 합성  함수 발생기  내장 임의 파형 기능
염소 안티 마우스 IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150117염소 안티 마우스 IgG H & L (Alexa Fluor 488) 사전 흡착 염소
안티 토끼 IgG H & L (Alexa Fluor 555)Abcamab150086토끼 IgG에 대한 염소 다클론 2차 항체 - H& L (Alexa Fluor 555), 사전 흡착된
Hoechst 33342InvitrogenH3570핵 염색
ImageJ 소프트웨어National Institutes of Health1.48v형광 이미지를 분석하십시오 
인듐– 주석– ITO히터용Merck300739
유리OLYMPUSCKX41세포 형태 관찰용
K-타입 열전대TecpelTPK-02A온도  열전대
Luer 접합기IDEX 건강 & 과학P618-01루어 어댑터 암 루어 1/4-28 남성 폴리프로필렌
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파라포름알데히드(PFA)Sigma-AldrichP6148고정  agent
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참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).
  2. Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
  3. Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
  4. Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
  5. Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
  6. Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094(2019).
  7. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116(2012).
  8. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
  9. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
  10. Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
  11. Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
  12. Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
  13. Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
  14. Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
  15. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928(2011).
  16. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
  17. Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340(2015).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
  19. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105(2008).
  20. Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
  21. AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738(2011).
  22. Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).

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