이 프로토콜은 태아 수집, 주사, 곤충 사육 및 식별뿐만 아니라 관심있는 돌연변이의 선택 : 모래 파리에 CRISPR / Cas9 표적 돌연변이 발생의 단계를 자세히 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
모래 파리는 리슈마니아 종, 원생 동물 기생충에 대 한 자연 벡터 피부 병 변에서 내장 병 리 에 이르기까지 증상의 광범위 한 스펙트럼을 생산. 벡터/기생충 상호 작용의 본질을 해독하는 것은 그들의 호스트에 Leishmania 전송의 더 나은 이해를 위한 1차적인 중요성입니다. 모래 플라이 벡터 역량(즉, 병원체를 운반하고 전송하는 능력)을 제어하는 파라미터 중에서도 이러한 곤충에 내재된 파라미터가 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 곤충 면역 반응은 예를 들어, 리슈마니아에모래 플라이 벡터 능력에 영향을 미친다. 이러한 매개 변수의 연구는 이러한 비모델 유기체에서 사용하기 위해 적응된 유전자 발현 변형 방법의 부족에 의해 제한되었다. 작은 간섭 RNA에 의한 유전자 다운 조절은 가능하지만 기술적으로 도전적일 뿐만 아니라 침묵은 세대에서 세대로 전염될 수 없는 기능의 부분적인 손실로 이어집니다. CRISPR/Cas9 기술에 의한 표적 돌연변이 발생은 최근에 Phlebotomus 파파타시 모래 파리에 적응되었습니다. 이 기술은 관심있는 유전자를 공부할 수 있도록, 특별히 선택된 궤적에 있는 전송 가능한 돌연변이의 생성으로 이끌어 냅니다. CRISPR/Cas9 시스템은 대상 이중 가닥 DNA 휴식의 유도에 의존하며, 나중에 비동호모로우스 엔드 인게이션(NHEJ) 또는 호모로지 구동 수리(HDR)에 의해 수리됩니다. NHEJ는 휴식의 간단한 폐쇄로 구성되어 있으며 종종 작은 삽입 / 삭제 이벤트로 이어집니다. 대조적으로, HDR은 기증자 DNA 분자가 표적 DNA와 상동성을 수리가 위한 템플릿으로 사용하는 것을 이용합니다. 여기서, 현재까지 모래파리 벡터에 적응된 유일한 게놈 변형 기술인 NHEJ를 사용하여 CRISPR/Cas9에 의한 표적 돌연변이 발생을 위한 모래플라이 배아 미세주입 방법을 제시한다.
서론
벡터 매개 질병은 지속적인 진화의 주요 공중 보건 위협입니다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 수백 종의 벡터 종들이 매우 뚜렷한 물리학 상가(예: 모기, 진드기, 벼룩)의 엄청난 수의 미생물 병원체 의 전염에 책임이 있으며, 이로 인해 연간 70만 명 이상의 인명 사망이 발생한다고 합니다. 벡터 곤충 중, 플레보토민 모래 파리 (Diptera, Psychodidae)는 다른 지리적 지역에서 발견 된 뚜렷한 현상 특성과 벡터 용량을 나타내는 80 입증 된 벡터 종과 함께 광대 한 그룹을 구성합니다. 그(것)들은 사이 20,000그리고 30,000죽음 사이 Leishmanias의 약 130만의 새로운 케이스를 일으키는 원인이 되는 속 Leishmania의원생동물 기생충을 위한 벡터입니다. Leishmaniases 임상 결과는 다양합니다, 치료의 부재에서 치명적인 내장 보급에 자기 제한 적인 경골 병변에서 구역 수색에 이르기까지 현상으로.
모래 파리는 엄격하게 지상파 곤충입니다. 그들의 수명 주기, 다른 Diptera에 비해 상대적으로 긴, 온도 등 다른 매개 변수에 따라 최대 3 개월 지속, 습도, 그리고 영양. 그것은 1개의 배아 단계 (6 11 일), 4개의 애벌레 단계 (총 23 에서 25 일 지속) 및 1개의 pupal ....
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프로토콜
모래 파리 먹이 공급에 대 한 혈액의 소스로 마우스의 사용은 건강의 국가 학회 (NIH)의 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 가이드에 있는 권고에 따라 엄격한 수행 되었다. 이 프로토콜은 NIAID, NIH (프로토콜 번호 LPD 68E)의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다. 무척추 동물은 NIH 지침에 따라 적용되지 않습니다.
1. 바늘 준비(그림 1)
- Meuti와 해럴19에설명된 대로 바늘과 벨을 당깁니다. 간단히 말해서, 보로실리케이트 유리 모세혈관을 사용하여 이중 단계 유리 마이크로 피펫 풀러에 바늘을 당깁니다.
- 여분의 미세 한 돌을 사용하여 마이크로 피펫 베벨러에 젖은 베브링하여 바늘을 날카롭게.
2. 배아 수집 및 미세 조작(그림 2)
- 주사일 5일 전에, 혈액 사료 모래는 식민지 유지 보수를 위해 일상적으로 수행된 암컷을 비행합니다. 모래 파리 식민지 사육 절차 및 필수 재료에 대한 자세한 내용은, 변호사 등을 참조하십시오.
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결과
모래 파리 돌연변이를 생성하기 위해 여기에 설명 된 CRISPR / Cas9 미세 주입 프로토콜은 이전 간행물4에설립되었다. 이 접근법은 540명의 개별 중 11개가 절차에서 살아남았기 때문에, 9는 돌연변이인 이기 때문에 고도로 효율적인 돌연변이 발생을 일으켰습니다. CRISPR/Cas9 돌연변이에 대한 가이드를 설계할 때 중요한 첫 번째 단계는 대상 영역 주변의 영역을 시퀀싱하는 것입니다. 시퀀싱을 위한 템플릿은 주입을 위한 태아의 근원으로 사용될 긴장에서 이어야 합니다. 설계 가이드에 게시된 게놈 서열에만 의존하는 것은 위험합니다. 게시된 게놈과 사전 가이드 설계 서열 간의 차이점이 있는 것은 드문 일이 아닙니다. 어떤 경우에는, 발표된 게놈 서열에서 디자인된 가이드는 표적 유전자 의 주위에 지역이 순서화될 때 존재하지 않습니다 (Harrell, 개인 관측). 또한, 서열에는 지노티핑 중에 실제 CRISPR 편집으로 착각할 수 있는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)이 포함될 수 .......
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토론
우리는 여기에 Phlebotomus 파파타시 모래 파리에서 CRISPR / Cas9에 의해 표적 돌연변이 발생을위한 최근에 개발 된 배아 미세 주입 방법을 제시한다. 곤충 유전자 변형을 위한 배아 미세주입은 1980년대 중반에 드로소필라에서 개발되었으며 현재 다양한 곤충에서 일상적으로 사용되고 있다. 유전자 변형 물질의 전달을 위한 다른 방법은 ReMOT20,21,22,23 및 전기기와 같은 곤충에 사용하기 위해 개발되었다. 그러나, 배아 미세분사액은 현재 이들 물질의 전달을 위한 가장 다재다능하고 효율적인 방법입니다. ReMOT는 전달 방법으로 매우 유망하며 배아 미세 주입에 비해 성.......
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감사의 글
저자들은 원고의 비판적 독서에 대한 바네사 멜데너 - 해럴에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 검은 색 여과지 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | 약 46 X 22mm 직사각형으로 자릅니다. 이들은 슬라이드와 커버슬립 사이에 위치하며 주입 중 배아를 위한 촉촉한 기층으로 작용합니다. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| 해부 현미경 | 모든 브랜드 | 배아 정렬용 | |
| 유리 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-A3 | 미세 주입 설정의 기본 레이어 그림 2A |
| 곤충 케이지 | 맞춤형 또는 여러 상용 옵션 | 변호사, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton 및 Petr Volf를 잡고 짝짓기하는 성인을 위한 폴리카보네이트 케이지. “ Phlebotomine 모래 파리 (Diptera, Psychodidae)의 실험실 식민지 및 대량 사육." 기생충 24. 2020년 8월 6일에 액세스함. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| 애벌레 사료 | 맞춤 제작 | . Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton 및 Petr Volf. " Phlebotomine 모래 파리 (Diptera, Psychodidae)의 실험실 식민지 및 대량 사육." 기생충 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | 마이크로 주입 바늘을 다시 채우는 데 사용 |
| 구강 흡입기 | John W. Hock Company | 모델 612 | HEPA 필터가 있는 구강 흡인기 |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | 미세 주입 현미경 | |
| Ovipots | Nalge 회사 | 산란관은 바닥에 2.5cm의 구멍을 뚫고 1cm의 파리의 석고로 채워진 125ml 또는 500ml의 얇은 플로리프로필렌 항아리로 만듭니다. 변호사, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton 및 Petr Volf. “ Phlebotomine 모래 파리 (Diptera, Psychodidae)의 실험실 식민지 및 대량 사육." 기생충 24. 2020년 8월 6일에 액세스함. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| 페인트 브러시 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | 배아 정렬에 사용 |
| 프로피온산 | 시그마-알드리치 | 402907 | 항진균제 |
| 표준 유리 모세 | World Precision Instruments | 1B100-3 | 미세 주입 바늘 |
| Trio-MPC100 컨트롤러 및 MP845 매니퓰레이터 | Sutter Instruments | 미세 주입 컨트롤러 및 마이크로 매니퓰레이터 |
참고문헌
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42(2017).
- Pelletier, I., et al.
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재인쇄 및 허가
