여기에서는 이전에 합성 된 스피로 사이클릭 옥심을 테스트하기 위해 3- (4', 5'- 디메틸 티아 졸 -2'- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 사용하는 생물학적 분석에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
스피로 사이 클릭 헤테로 사이클은 최근 암 치료를위한 잠재적 인 약물로 문헌에서보고되었습니다. 이러한 새로운 직교 고리 시스템의 합성은 어렵습니다. 이들 화합물을 합성하기 위한 효율적인 방법론이 최근에 발표되었는데, 이는 이전에 보고된 5단계가 아닌 4단계로 고체상 합성을 기술하였다. 이 짧은 합성의 장점은 독성 시약의 사용을 제거하는 것입니다. 저로딩 재생 마이클(REM) 링커 기반 수지는 고로딩 버전이 부피가 큰 페닐 및 방향족 측쇄를 포함하는 시약의 첨가를 방지하므로 합성에 중요한 것으로 밝혀졌습니다. 비색 3- (4 ', 5'- 디메틸 티아 졸 -2'- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석을 사용하여 시험관 내에서 이러한 새로운 스피로 사이 클릭 분자의 마이크로 몰 농도의 세포 독성을 조사했습니다. MTT는 상업적으로 쉽게 구할 수 있으며 비교적 빠르고 신뢰할 수 있는 결과를 생성하므로 이 분석은 이러한 스피로사이클릭 헤테로사이클에 이상적입니다. 직교 고리 구조 뿐만 아니라 푸르푸릴아민(유사한 5-원 고리 모티프를 함유하는 합성 방법의 전구체)을 시험하였다.
서론
소분자 E3 유비퀴틴-리가아제 마우스의 이중 분2 동족체(MDM2)와 p53의 상호작용의 억제는 종양 세포 사멸 1,2,3의 p53 매개 유도를 회복시키는 것으로 알려져 있다. MDM2는 p53 경로의 음성 조절자이며 종종 암세포 4,5,6,7,8,9에서 과발현됩니다. 최근의 결정학적 및 생화학적 연구에 따르면 스피로사이클릭 프레임워크를 포함하는 소분자가 MDM2-p53 상호작용을 효과적으로 억제할 수 있음이 밝혀졌습니다10. 스피로사이클릭 프레임워크(그림 1, 파란색으로 음영 처리됨)는 이 단단한 직교 고리 시스템의 유도체화가 새로운 치료 약물의 발견으로 이어짐에 따라 특권적인 모....
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프로토콜
알림: 이 프로토콜에 사용되는 여러 화학 물질 및 생물학적 시약은 독성이 있고 발암성입니다. 사용하기 전에 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 실험을 시작하기 전에 적절한 개인 보호 장비(산업안전보건청에서 승인한 안전 고글, 적절한 장갑, 실험실 코트, 전신 바지 및 발가락이 막힌 신발)를 사용하십시오. 또한 합성을 수행하고 독성 화학 물질 및 시약(흄 후드)을 취급할 때 적절한 안전 관행을 채택하십시오.
1. 스피로 사이 클릭 헤테로 사이클 6 및 7의 고체상 합성
참고 : 합성은 이전에 출판 된 작업11,12를 기반으로했습니다. 업데이트 된 프로토콜은 삼환 헤테로 사이클의 테트라 부틸 암모늄 플루오 라이드 촉매 개환이 필요하지 않았 음을 보여 주므로 제거는 합성 절차를 단축시킵니다.
- 마이클은 REM 링커에 푸르푸릴아민을 첨가합니다(지속시간: 설정 25분 + 반응 시간 24시간).
- 1 g (1 당량])의 REM 수지, 20 mL (20 당량)의 디메틸포름아미드 (DMF), 및 2.4 mL의 푸르푸릴아민을 25 mL 고체상 반응 용기에 첨가....
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결과
스피로사이클릭 옥심 6 및 7은 변형된 프로토콜을 사용하여 합성되었습니다(그림 1). 마이클-푸르푸릴아민을 REM 링커 1b에 첨가하여 중합체-결합된 수지 2를 수득하였다. 반응의 진행은 1722 cm-1에서 α,β- 불포화 에스테르의 소실을 검출함으로써 적외선 (IR) 분광법에 의해 모니터링되었다 (그림 3). 스피로사이클릭 결합 수지 4는 일시적인 중간체 3을 통해 2로부터 형성되었다. 4의 메탄올 가수 분해는 3-[(3E)-(2S, 4R) -2- 페닐 -3- 히드 록시 이미노 4- 히드 록시 메틸 - 피 롤리 딘 -1- 일] - 프로피온산 메틸 에스테르 7을 생성하고, 알킬화 후 β- 제거 (3E) - (2S, 4R) -4- 히드 록시 메틸 -1- 메틸 -2- 페닐 -3- 피 롤리 딘 옥심 6. 스피로 사이 클릭 옥심의.......
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토론
스피로 클릭 화합물의 합성은이 실험실에서 수행 한 이전 연구를 기반으로했지만 일부 수정되었습니다 (그림 1)11,12. 각 반응 단계의 진행을 IR 분광법으로 모니터링하였다. 마이클푸르푸릴아민과 함께 REM 링커 1의 첨가는 중합체 결합 2(IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1)를 제공하였다. 이전 보고로부터, ISOC 2는 TMS 기의 검출에 의해 확인된 바와 같이 삼환 헤테로시클릭 화합물 3을 생성하였다(IR 1214 cm-1). 이것은 ISOC가 제품의 필요한 위치 및 입체 선택성을 제공했기 때문에 합성의 중요한 단계입니다........
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 교수 연구위원회에서 K.S.H. (연구 및 보조금 사무소, Azusa Pacific University-USA)에 대한 보조금으로 지원되었습니다. ANG와 JFM은 학술 학부 연구 경험 (SURE) 펠로우십의 수혜자입니다. SKM과 BMR은 STEM Research Fellowship Grants (미국 Azusa Pacific University-Science 연구 센터)의 수혜자입니다. 생물학적 분석에 대한 지침을 주신 Matthew Berezuk 박사와 Philip Cox 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| CELLS | |||
| COS-7 세포 (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | 알킬-할라이드 |
| 벤질브로마이드 | 시그마-알드리치 | B17905 | 알킬-할라이드 |
| 시스플라틴 | 케이맨 화학 | 13119 | 세포독성 제어 |
| 디클로로메탄(DCM) | 시그마-알드리치 | 270997 | 용매 |
| 디메틸포름아미드(DMF) | 시그마-알드리치 | 227056 | 용매 |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | 시그마-알드리치 | 276855 | 용매 |
| DMEM, 고포도당, L-글루타민 | 포함 Genesee Scientific | 25-500 | 세포 배양 매체 |
| FBS (태아 소 혈청) | Sigma-Aldrich | F4135 | 세포 배양 매체 |
| Furfurylamine | Acros 유기물 | 119800050 | 시약 |
| 요오도메탄 | 시그마-알드리치 | 289566 | 알킬-할라이드 |
| 메탄올 | 시그마-알드리치 | 34860 | 용매 |
| MTT((3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) | EMD 밀리포어 | Calbiochem 475989-1GM | 시약 |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | 세포 배양 배지 |
| REM 수지 | Nova Biochem | 8551010005 | 폴리머 지지체; 0.500 mmol/g 로딩 |
| 트랜스-β-니트로스티렌 | Sigma-Aldrich | N26806 | 니트로-올레핀 시약 |
| 톨루엔 | Sigma-Aldrich | 244511 | 용매 |
| 트리에틸아민(TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | 베타 제거 |
| 트리메틸실릴 클로라이드(TMSCl) | 용 시약시그마-알드리치 | 386529 | 시약; 주의 - 변동성이 높음; HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL 고체상 반응 용기 | 생성 Chemglass | CG-1861-02 | 필터가 있는 유리 제품 |
| 96 웰 플레이트 리더 | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | 기기 |
| AVANCE III NMR 분광계 | Bruker | N/A | 기기;300MHz를 생성합니다. 용매: CDCl3 및 CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | 기기 |
| 손목 액션 쉐이커 | Burrell Scientific | 757950819 | 기기 |
참고문헌
- Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
- Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S.
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재인쇄 및 허가
