우리는 H 2O2로망막 색소 상피 세포를 치료하여 세포 형태, 생존가능성, 밀도, 글루타티온 및 UCP-2 수준의 개발 및 사용을 위한 프로토콜을 제시합니다. 신경망 변성을 치료하기 위해 트랜스포슨-감염된 세포에 의해 분비되는 단백질의 항산화 효과를 조사하는 데 유용한 모델이다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
산화 스트레스는 전 세계적으로 3천만 명의 환자에게 영향을 미치는 병리학인 노화 관련 황반 변성(AMD)을 포함한 여러 퇴행성 질환에서 중요한 역할을 합니다. 망막 색소 상피(RPE)-합성 신경보호인자, 예를 들어, 안료 상피 유래 인자(PEDF) 및 과립세포-대식세포 콜로니-자극인자(GM-CSF)의 감소로 이어지며, 결국 광수용체 및 망막 갱셀(RGC)의 손실로 이어진다. 우리는 PEDF와 GM-CSF를 과발현하는 과발뇌형 RPE 세포의 감속 이식에 의한 신경보호 및 신경성 망막 환경의 재구성이 산화 스트레스의 효과를 완화하고 염증을 억제하며 세포 생존을 지원함으로써 망막 변성을 예방할 수 있는 잠재력을 가지고 있다고 가설합니다. 수면미트랜스포손 시스템(SB100X)을이용하여 인간 RPE 세포는 PEDF 및 GM-CSF 유전자에 감염되어 qPCR, 서부 블롯, ELISA 및 면역불률을 이용한 안정적인 유전자 통합, 장기 유전자 발현 및 단백질 분비를 보였다. 전감염된 RPE 세포에 의해 분비된 PEDF 및 GM-CSF의 기능성 및 효능을 확인하기 위해, 배양시 RPE 세포에 대한H2O2-유도산화 스트레스의 감소를 정량화하기 위한 시험관 내 분석서를 개발하였다. 세포 보호는 세포 형태학, 밀도, 글루타티온의 세포 내 수준, UCP2 유전자 발현 및 세포 생존가능성을 분석하여 평가하였다. 둘 다, PEDF 및/또는 GM-CSF 및 세포를 과도하게 발현하는 전감염된 RPE 세포는 비감염되었지만 PEDF 및/또는 GM-CSF(소판 또는 전감염된 세포로부터 정수)로 전처리된 비처리 대조군과 비교하여 상당한 항산화 세포 보호를 보였다. 본H2O2-모델은AMD 또는 이와 유사한 신경퇴행성 질환을 치료하는 데 효과적일 수 있는 요인의 항산화 효과를 평가하는 간단하고 효과적인 접근법이다.
서론
여기에 설명된 모델은 세포의 산화 스트레스를 줄이기 위한 바이오 의약품 제제의 효율성을 평가하는 유용한 접근법을 제공합니다. 우리는 H2O2-매개산화 용 안료 상피 세포에 대한 PEDF 및 GM-CSF의 보호 효과를 조사하기 위해 모델을 사용했으며, 이는 높은 수준의 O2에노출되며, 가시광선, 광수용체 외부 세그먼트 멤브레인의 phagocytosis를 통해 반응성 산소 종(ROS)1, 1, 1, 1 2. 그(것)들은 혈관 나이 관련 황반 변성의 병인에 중요한 기여자로 간주됩니다 (aAMD)3,4,5,6,7,8. 게다가, RPE 합성 신경 보호 인자, 특히 안료 상피 유래 인자 (PEDF), 인슐린 과같은 성장 인자 (IGFs), 및 과립구 대식세포 -콜로니 자극 인자 (GM-CS....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
인간의 눈의 수집 및 사용에 대한 절차는 연구를위한 주 윤리위원회에 의해 승인되었다 (아니. 2016-01726).
1. 세포 격리 및 배양 조건
- 인간 ARPE-19 세포주
- 문화 5 x 105 ARPE-19 세포, 인간 RPE 세포주, 덜벡코의 수정 된 독수리의 중간 / 영양 혼합물 F-12 햄 (DMEM / 햄의 F-12)은 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 80 U / mL 페니실린, 80 U / mL 페니실린으로 보충 80 μg/mL 연쇄상 구균, 및 2.5 μg/mL 암포테리신 B(전체 매체)에서 37°C에서 T75 플라스크에서 5% CO2 및 95%의 공기가 가습된 대기시(다른 세포 밀도는 표 1참조).
- 일주일에 세 번 매체를 변경합니다.
- 일단 세포가 약 90%의 합류(질적으로 평가됨)로 성장하면, 배지를 흡기하고 멸균 1x PBS로 세포를 세척한다.
- 37°C에서 7-10분 동안 5% 트립신-2% EDTA 용액으로 세포를 배양한다(볼륨의 경우 표 1참조). 분리를 시각적으로 모니터링합니다.
- 10% FBS를 포함하는 완전한 매체를 추가하여 트립시닝을 중지합....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스유도
ARPE-19 및 1차 hRPE 세포는 24시간 동안H2 O2의다양한 농도로 처리되었고 항산화 글루타티온의 세포내 수준을 정량화하였다(도2A,B). H2O2 앳 50 μM 및 100 μM은 글루타티온 생산에 영향을 미치지 않았지만 350 μM에서는 ARPE-19 및 1차 hRPE 세포에서 글루타티온이 현저히 감소했습니다. 세포독성 분석 결과 350μM은 세포 생존율이 현저한감소(도 2C)를유발하는H2 O2의가장 낮은 농도를 보였다. 형태학적으로,H2 O2로처리된 ARPE-19 세포는H2
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에 제시된 프로토콜은 어떤 putative 유익한 유전자로 전염되는 세포에 적용될 수 있는 전감염된 세포에 의해 생성된 PEDF 및 GM-CSF의 산화 및 보호 기능을 분석하는 접근법을 제안합니다. 유전자 변형 세포를 이식하여 조직에 단백질을 전달하는 것을 목표로 하는 유전자 치료 전략에서, 단백질 발현의 수준, 발현의 장수 및 질병의 모델에서 발현 된 단백질의 효과에 대한 정보를 얻는 것이 중요하다. 우리의 실험실에서, 여기에서 제시된 프로토콜은 aAMD6의병기발생에 있는 중요한 요소로 가설된 산화 스트레스에 대한 PEDF 및 GM-CSF의 효과를 정의하는 데 유용했습니다6,7. 구체적으로, 우리는 SB100X-매개 PEDF /GM-CSF-전동 1 차 hRPE 세포의 산화 효과를 정의하는 프로토콜을 사용했다. 몇몇 조사자들은H2O2가 산화 스트레스의 중요한 증상을 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 훌륭한 기술 지원에 대한 그레그 실리와 알레인 콘티와 베를린의 맥스 델브뤼크 센터에서 교수 Zsuzsanna 이즈바크에게 감사하고 싶습니다 pSB100X 및 pT2-CAGGS-비너스 플라스미드를 친절하게 제공합니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단과 유럽 위원회가 제7 프레임 워크 프로그램의 맥락에서 지원되었습니다. Z.I는 유럽 연구 위원회, ERC 고급 [ERC-2011-ADG 294742]에 의해 투자되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 24웰 플레이트 | Corning | 353047 | |
| 6웰 플레이트 | Greiner | 7657160 | |
| 96웰 배양 플레이트는 흰색이며 바닥이 투명하고 평평합니다. | Costar | 3610 | 발광 (GSH-Glo Assay)을 측정하기 전에 세포를 확인할 수 있습니다. |
| 96-웰 플레이트 | Corning | ||
| 아크릴아미드 40% | Biorad | 161-0144 | |
| 암포테리신 B | AMIMED | 4-05F00-H | |
| 항체 항-GMCSF | ThermoFisher Scientific | PA5-24184 | |
| 항체 항-마우스 IgG/IgA/IgM | Agilent | P0260 | |
| 항체 항-PEDF | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-390172 | |
| 항체 항펜타-그의 | Qiagen | 34660 | |
| 항체 anti-phospho-Akt | 세포 신호 기술 | 9271 | |
| 항체 anti-rabbit IgG H& L-HRP | Abcam | ab6721 | |
| 항체 당나귀 안티-토끼 Alexa Fluor 594 | 써모피셔 사이언티픽 | A11034 | |
| 항체 염소 안티-마우스 Alexa 488 | ThermoFisher Scientific | A-11029 | |
| ARPE-19 세포주 | ATCC | CRL-2302 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418-500G | |
| 챔버 배양 유리 슬라이드 | Corning | 354118 | |
| CytoTox-Glo 세포 독성 분석 | Promega | G9291 | |
| DAPI | 시그마-알드리치 | D9542-5MG | |
| DMEM/햄의 F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| 듀오 세트 ELISA 키트 | R& D 시스템 | DY215-05 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 78440 | |
| ELISAquant kit | BioProducts MD | PED613-10-Human | |
| Eyes (human) | Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN) | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| 플루오로마운트 수성 마운팅 미디엄 | 시그마-알드리치 | F4680-25ML | |
| 플루오스타 오메가 플레이트 리더 | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism 소프트웨어(버전 8.0) | GraphPad Software, Inc. | ||
| GSH-Glo 글루타티온 분석 | Promega | V6912 | |
| 과산화수소 (H2O2) | Merck | 107209 | |
| ImageJ 소프트웨어 (이미지 처리 프로그램) | W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997– 2014 | ||
| 이미다졸 | Axonlab | A1378.0010 | |
| Leica DMI4000B 현미경 | 라이카 마이크로시스템 | ||
| LightCycler 480 기기 II | Roche Molecular Systems | ||
| LightCycler 480 SW1.5.1 소프트웨어 | Roche Molecular Systems | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376-1000 | |
| NaH2PO4 | Axonlab | 3468.1000 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System 10 &마이크로; L Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neubauer 챔버 | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Ni-NTA 슈퍼플로우 | Qiagen | 30410 | |
| 니트로셀룰로오스 | VWR | 732-3197 | |
| Omega Lum G Gel 이미징 시스템 | Aplegen Life Science | ||
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quantabio | 95072-012 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-100G | |
| Pierce BCA 단백질 분석 키트 | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| 프라이머 | 인비트로젠 | 보충 자료 | |
| pSB100X(250 ng/µ L) | Má té S 외, 2009. Zsuzsanna Izsvak | ||
| pT2-CMV-GMCSF 교수 제공-His 플라스미드 DNA(250 ng/µ L) | 문헌[Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796]에 보고된 기존 pT2-CMV-PEDF-EGFP 플라스미드를 사용하여 구축하였다. | ||
| pT2-CMV-PEDF-His 플라스미드 DNA(250ng/&마이크로; L) | 문헌[Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796]에 보고된 기존 pT2-CMV-PEDF-EGFP 플라스미드를 사용하여 구축하였다. | ||
| QIAamp DNA 미니 키트 | QIAGEN | 51304 | |
| 재조합 hGM-CSF | Peprotech | 100-11 | |
| 재조합 hPEDF | BioProductsMD | 004-096 | |
| ReliaPrep RNA 세포 미니프렙 시스템 | Promega | Z6011 | |
| RIPA 버퍼 | ThermoFisher Scientific | 89901 | |
| RNase-free DNase 세트 | QIAGEN | 79254 | |
| RNeasy 미니 키트 | QIAGEN | 74204 | |
| SDS | Applichem | A2572 | |
| 반건조 전사 WB를 위한 시스템 | Bio-Rad | ||
| SuperMix qScript | Quantabio | 95048-025 | |
| 트리스 완충 식염수(TBS) | ThermoFisher Scientific | 15504020 | |
| Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Tween | AppliChem | A1390 | |
| Urea | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| WesternBright ECL HRP 기판 | Advansta | K-12045-D50 | |
| Whatman 니트로셀룰로오스 멤브레인 | Chemie Brunschwig | MNSC04530301 |
참고문헌
- Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
- Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
