Method Article

모듈형 골든 게이트 복제를 사용하여 다중 유전자 구조물의 신속한 조립

DOI:

10.3791/61993

⸱

February 5th, 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University at Buffalo, State University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 목표는 골든 게이트 복제를 기반으로 모듈형 복제 시스템을 사용하여 다중 유전자 구조를 조립하기위한 상세한 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. 또한 우리의 경험을 바탕으로 최적의 어셈블리를 보장하기 위한 중요한 단계에 대한 권장 사항을 제공합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

골든 게이트 복제 방법은 사용자 정의 배열에서 여러 유전자의 신속한 조립을 가능하게합니다. 그것은 그들의 인식 사이트 외부 잘라 하 고 짧은 오버행을 만드는 유형 IIS 제한 효소를 활용. 이 모듈식 복제(MoClo) 시스템은 프로모터, 코딩 서열(CDS) 및 종착기와 같은 다른 DNA 부품이 먼저 엔트리 벡터로 복제되는 계층적 워크플로우를 사용합니다. 그런 다음 여러 항목 벡터가 전사 단위로 어셈블합니다. 몇몇 전사 단위는 그 때 다중 유전자 플라스미드로 연결합니다. 골든 게이트 복제 전략은 한 냄비 반응에서 흉터가없고 방향성 및 모듈식 조립을 허용하기 때문에 엄청난 이점입니다. 계층적 워크플로우를 통해 전형적으로 엔트리 벡터를 넘어 시퀀싱할 필요 없이 다양한 다중 유전자 구조의 촉진 복제를 가능하게 합니다. 형광 단백질 중퇴를 사용하면 쉽게 시각적 으로 선별 할 수 있습니다. 이 작업은 효모 모듈식 복제(MoClo) 키트를 사용하여 다중 유전자 플라스미드를 조립하기 위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 우리는 다중 유전자 플라스미드 조립의 최적 및 최적 결과를 보여주고 식민지에 대한 검열을위한 가이드를 제공합니다. 이 복제 전략은 효모 대사 공학 및 다중 유전자 플라스미드 복제가 필요한 다른 상황에 매우 적용 가능합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

합성 생물학은 제약, 농업 및 화학 산업에 유용한 새로운 기능으로 생물학적 시스템을 설계하는 것을 목표로합니다. 높은 처리량 방식으로 많은 수의 DNA 단편을 조립하는 것은 합성 생물학의 기초 기술입니다. 이러한 복잡한 과정은 복잡성이 감소하여 여러 단계로 분해 될 수 있으며, 기본 공학과학1,2에서빌린 개념. 합성 생물학에서 DNA 단편은 일반적으로 기능에 기초하여 계층적으로 조립됩니다: (i) 부품 수준: "부품"은 프로모터, 코딩 서열, 터미네이터, 복제의 기원과 같은 특정 기능을 가진 DNA 단편을 지칭한다. (ii) 전사 단위 (TU) 수준: TU는 프로모터, 코딩 서열 및 단일 유전자를 전사할 수 있는 종점으로 구성된다. (iii) 다중 유전자 수준: 다중 유전자 플라스미드는 전체 대사 경로로 자주 구성된 다중 투구를 함유하고 있습니다. BioBrick 커뮤니티가 개척한 이 계층적 조립은 합성 생물학3에서대형 DN 세트의 조립을 위한 기본 개념입니다.

지난 10년 동안4,5,6,7,골든 게이트 복제 기술은 계층적 DNA 어셈블리2를현저히 촉진했다. 깁슨 복제8,결찰-독립 복제(SLIC)9,우라실 절제 기반 복제(USER)10,리구아 사이클링 반응(LCR)11,생체 내 재조합(DNA 어셈블러)12,13등 다른 다중 부품 복제 방법도 지금까지 개발되었다. 그러나 골든 게이트 복제는 유전자 특정 서열과 독립적이기 때문에 이상적인 DNA 조립 방법이므로 흉터가 없고 방향성 및 모듈식 조립을 한 냄비 반응에서 허용합니다. 골든 게이트 복제는 비 palindromic 서열을 인식하는 유형 IIS 제한 효소를 활용하여 인식 부위2외부에서 비틀거리는 오버행을 만듭니다. 그런 다음 리거제는 어닐링된 DNA 단편에 합류하여 다중 부분 조립을 얻습니다. 모듈형 복제(MoClo) 시스템에 이 복제 전략을 적용하면 올바르게 조립된 구조4를포함하는 90% 이상의 변압제를 통해 최대 10개의 DNA 단편을 조립할 수 있게 되었다.

MoClo 시스템은 합성 생물학의 설계 구축 테스트 주기를 가속화한 엄청난 이점을 제공합니다. 첫째, 교환 가능한 부품은 결합 복제를 가능하게 하여 큰 파라미터 공간을 빠르게 테스트할 수 있습니다. 예를 들면, 신진 대사 통로를 최적화하는 것은 일반적으로 통로 플럭스의 균형을 맞추기 위하여 각 유전자를 위한 많은 프로모터를 통해 순환을 요구합니다. MoClo 시스템은 이러한 까다로운 복제 작업을 쉽게 처리할 수 있습니다. 둘째, 하나는 부품 플라스미드를 서열화할 필요가 있지만 전형적으로TU 또는 다중 유전자 플라스미드가 아닙니다. 대부분의 경우, 콜로니 PCR 또는 제한 소화에 의한 스크리닝은 TU 및 다중 유전자 플라스미드 수준에서 검증하기에 충분하다. 이는 플라스미드 부분을 복제하는 것이 돌연변이를 자주 도입하는 PCR을 필요로 하는 유일한 단계이기 때문입니다. 셋째, MoClo 시스템은 다중 유전자 복합 대사 경로를 구축하는 데 이상적입니다. 마지막으로, 보편적 인 오버행으로 인해 부품 플라스미드를 재사용하고 전체 생물 공학 커뮤니티와 공유 할 수 있습니다. 현재, MoClo 키트는 식물14,15,5,16,17,곰팡이6,18,19,20,21,22,박테리아7,23,24,25,26,27및 동물28,29에사용할 수 있습니다. 멀티 킹덤 MoClo 플랫폼도 최근에 도입되었습니다30.

Saccharomyces cerevisiae를위해, Lee외. 6효모 합성 생물학 커뮤니티를 위한 우수한 자원인 다재다능한 MoClo 툴킷을 개발했습니다. 이 키트는 편리한 96웰 형식으로 제공되며 다양한 유형의 상호 교환 가능한 DNA 부품을 잘 특징적인 프로모터, 형광 단백질, 터미네이터, 펩타이드 태그, 선택 마커, 복제 원산지 및 게놈 편집 도구를 정의합니다. 이 툴킷은 최대 5개의 전사 단위를 다중 유전자 플라스미드로 조립할 수 있게 한다. 이러한 특징은 부분 또는 전체 경로가 표적 화학 물질을 생산하기 위해 과도하게 표현되는 효모 신진 대사 공학에 유용합니다. 이 키트를 사용하여 연구자들은 제라니올, 리날로올31,페니실린32,무코닉산33,인디고34,베타레인35 의 효모 의 생산을 최적화했다.

여기서 우리는 상피 또는 게놈 발현을 위한 다중 유전자 통로를 생성하기 위하여 MoClo 툴킷의 사용을 안내하는 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 키트의 광범위한 사용을 통해, 우리는 DNA 농도의 정확한 측정이 골든 게이트 반응에서 각 부분의 동등성 분포를 보장하는 열쇠임을 발견했다. 우리는 또한 T7 DNA 리개세 위에 T4 DNA 리구아제추천36의 더큰 숫자와 더 잘 작동하기 때문에. 마지막으로, BsmBI 및 BsaI의 내부 인식 사이트는 조립 전에 제거하거나 길들여야 합니다. 또는 여러 내부 사이트를 제거하고 동시 코돈 최적화를 달성하기 위해 부품을 합성하는 것을 고려할 수 있습니다. 우리는 S. cerevisiae에 있는 β 카로틴 및 리코펜 생산을 위한 5 유전자 통로를 표현하여 이 공구키트를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한이 키트에서 게놈 편집 도구를 사용하여 ADE2 궤적을 노크하는 방법을 보여줍니다. 이러한 색상 기반 실험은 쉽게 시각화할 수 있는 선택되었습니다. 우리는 또한 융합 단백질을 생성하고 골든 게이트 복제를 사용하여 아미노산 돌연변이를 만드는 방법을 보여줍니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고: 이 도구 키트에서 제공되는 계층 복제 프로토콜은 세 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다: 1. 부품 플라스미드 복제; 2. 복제 전사 단위 (투스); 3. 복제 다중 유전자 플라스미드(그림 1). 이 프로토콜은 프라이머 설계에서 시작하여 복제된 다중 유전자 플라스미드의 응용으로 끝납니다.

1. 부품 플라스미드 (pYTK001)를 복제하기위한 프라이머 디자인 :

  1. 5'엔드에서 측면 뉴클레오티드 TTT를 포함하는 전방 및 역입 입문서를 설계하고, BsmBI 인식 부위를 추가 뉴클레오티드(CGTCTCN),4-뉴클레오티드(nt) 오버행(TCGG)을 입력 벡터의 상보적, 추가 뉴클레오티드(GGTCTCN)를 가진 BsaI 인식 부위및 4nt 부분별 오버행, 템플릿 특이적 서열(도2A)에추가된다. GoldenBraid 4.037 및 GoldenMutagenesis38 골든 게이트 특정 프라이머 디자인에 사용할 수 있는 온라인 소프트웨어 의 일부입니다.
  2. BsaI 또는 BsmBI 인식 사이트가 어느 부분에든 존재하는 경우, 골든 게이트어셈블리(39)이전에 이러한 사이트를 돌연변이하기 위해 길들이기 단계를 사용합니다. 통합 플라스미드(4단계 참조)의 경우 모든 NotI 인식 사이트를 길들이세요. 하나의 바람직하지 않은 인식 사이트로 부품을 길들이려면, 바람직하지 않은 사이트 근처의 두 개의 하위 부분으로 부품을 분할(그림 2A):
    1. 첫 번째 서브파트의 전방 프라이머를 1.1단계와 동일한 방식으로 설계합니다. 그러나 BsmBI 사이트와 4nt 유전자 특이오버행만으로 역프라이머를 설계한다.
    2. BsmBI 사이트와 4nt 유전자 특이 오버행을 제1 서브 파트의 역프라이머와 겹치는 것만으로 제2 서브 파트 포워드 프라이머를 설계한다. 제1.1단계와 동일한 방식으로 두 번째 서브 파트의 역프라이머를 설계한다.
    3. 프라이머의 유전자 특이적 영역에서 역(단계 1.2.1) 또는 전방 프라이머(step 1.2.2)에서 원하는 돌연변이를 소개한다.
      참고: BsmBI 및 BsaI가 없고 코돈에 최적화된 부품을 상업적으로 합성할 수 있습니다. 코딩 서열(CDS)의 경우, 대명사 돌연변이는 아미노산 코돈의 제3 뉴클레오티드에 쉽게 통합될 수 있다. 그러나 프로모터 및 종기의 경우 리포터 분석기를 사용하여 돌연변이된 프로모터 또는 종료기 활성을 확인하는 것이좋습니다(39). 시퀀스의 끝을 향해 바람직하지 않은 제한 사이트가 있는 경우 더 긴 역프라이머를 사용하여 변질될 수 있다. 여러 바람직하지 않은 사이트가 있는 경우 여러 사이트를 돌연변이할 수 있는 사이트 지향 돌연변이 발생은40을수행할 수 있다.
  3. 때때로, 두 단백질을 단일 부분으로 결합하는 것이 바람직하다(도2A). 링커는 두 개의 개별단백질(41)의구조적 무결성을 보장하는 데 도움이 된다.
    1. 첫 번째 유전자에 대한 전방 프라이머는 1.1 단계와 동일합니다. 역계 프라이머에서, BsmBI 부위, 4nt 유전자 특이오버행 및 링커 서열을 포함한다. 4nt 오버행은 링커 또는 두 번째 유전자의 처음 몇 가지 뉴클레오티드일 수 있다.
    2. 제2 유전자의 경우, BsmBI 인식 부위와 제1 유전자의 역프라이머에 대한 보완적 4nt 오버행을 갖는다는 것을 같은 전방 프라이머를 설계한다. 제1.1단계에서와 같이 제2 유전자의 역프라이머를 설계한다.
  4. 중합효소 연쇄 반응(PCR)(42)에의해 부품을 증폭시키기 위해, 게놈 DNA, cDNA 또는 플라스미드로부터 부품을 증폭시키기 위해 고충실도 DNA 폴리머라아제를 사용한다. PCR 제품을 1% 아가로즈 젤로 체크하고 젤 정화를 확인하십시오. 정제 된 DNA를 사용하는 것이 강력하고, 젤 정제가 힘들면 PCR 제품을 정화하기 위해 적어도 스핀 컬럼을 사용하는 것이 좋습니다.

2. 부품 플라스미드를 만들기 위해 부품 플라스미드(그림2B)를생성하기 위해 부품을 엔트리 벡터(pYTK001)로 복제합니다.

  1. 골든 게이트 반응 믹스를 설정하려면 각 PCR 제품 및 엔트리 벡터(pYTK001), 1μL 1μL 10X T4 리구아제 버퍼, Esp3I의 0.5 μL(BsmBI의 고효율 이조머), T4 ligase의 0.5 μL을 추가합니다. ddH2O를 추가하여 총 부피를 10 μL로 가져옵니다.
  2. 복제 반응을 설정하려면, 열순환기에서 다음 프로그램을 실행: 25-35 사이클 37°C5 분 (소화) 및 16 °C 5 분 (리그화), 10 분 동안 50 °C에서 최종 소화 및 효소 비활성화 에 대한 10 분 10 분.
    참고: 소화/결찰의 35주기는 여러 DNA 조각을 동시에 엔트리 벡터로 복제할 때 권장되며, 예를 들어 융합 유전자의 복제 중이거나 유전자를 길들이는 것이 좋습니다.
  3. 전체 반응 믹스를 열 충격에 의해 DH5α 균주 또는 상응하는 대장균화학적으로 유능한 세포로 변환합니다. 전체 10 μL 복제 제품을 35 μL 화학적으로 유능한 대장균 세포(2 X 105 cfu/mL로 변환하면, cfu는 5 ng pYTK001을 유능한 세포의 100 μL로 변환하는 것으로 계산됩니다)를 권장합니다. 리소게니 브로스 (LB) 플레이트에 35 μg /mL 클로람페니콜 (Cm)을 퍼놓습니다. 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.
  4. 16-18h 후, 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내서 약 5시간 동안 4°C에서 플레이트를 유지하여 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP)이 보다 강렬한 녹색 색을 개발하도록 한다.
  5. 쉽게 스크리닝을 위해 플레이트를 자외선(UV) 또는 청색 광 트랜일루미노이터에 놓습니다. 식민지를 포함하는 sfGFP는 UV 빛 의 밑에 형광할 것입니다.
  6. 녹색 식민지는 절단되지 않은 pYTK001을 포함하기 때문에 부정적입니다. 흰색 식민지는 긍정적 일 가능성이 높습니다. 복제는 일반적으로 ~ 30-100 % 흰색 식민지가있는 경우 성공합니다. 식민지 PCR 또는 제한 소화에 의해 몇 가지 흰색 식민지의 추가 검사를 수행 (제안 된 효소: BsaI-HFv2).
  7. 잠재적으로 올바른 식민지 중 몇 가지에서 플라스미드를 정화하고 Sanger 시퀀싱에 의해 시퀀스를 확인합니다.

3. 부품 플라스미드를 "카세트" 플라스미드로 조립

참고: 카세트 플라스미드에는 프로모터, CDS 및 종단자로 구성된 사용자 정의 전사 단위(TU)가 포함되어 있습니다. 카세트 플라스미드는 단일 유전자의 발현을 허용한다. 카세트 플라스미드가 다중 유전자 플라스미드로 조립될 경우, 첫 번째 단계는 다중 유전자 플라스미드에서 TUS의 수와 순서를 결정하는 것이다. 이들은 커넥터가 다중 유전자 플라스미드에서 TUs를 연결하기 때문에 카세트 플라스미드에서 사용할 커넥터를 결정합니다. 첫 번째 TU의 왼쪽 커넥터는 ConLS여야 하며 마지막 TU의 오른쪽 커넥터는 ConRE여야 합니다. 그들은 ConLS와 ConRE의 다중 유전자 플라스미드와 겹칩니다. 나머지 커넥터는 숫자 순서가 증가해야 합니다. 예를 들어, 다중 유전자 플라스미드에 4개의 투우가 포함되어 있는 경우, 커넥터 조합은 ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3및 ConL3-TU4-ConRE(그림 1)이다.

  1. 전사 단위를 조립하기 전에, 다음 여섯 부분으로 중간 벡터를 조립하는 것이 좋습니다: 왼쪽 커넥터, sfGFP 드롭아웃 (pYTK047), 오른쪽 커넥터, 효모 선택 마커, 복제의 효모 기원 및 mRFP1, 대장균 원점 및 앰프실린 내성 유전자 (pY3)를 가진 부분 플라스미드(pY3).
    1. 위의 여섯 플라스미드를 정화합니다. UV-Vis 분광광계 또는 형광계 분석기를 사용하여 농도를 기록하고 1 μL이 DNA 20 fmol을 가지고 있도록 ddH2O로 각 플라스미드를 희석시합니다. 온라인 계산기를 사용하여 DNA 어금니 농도를 계산합니다.
      참고: DNA 농도를 정확하게 측정하고 어셈블리가 작동하도록 정확하게 파이프하는 것이 매우 중요하며, 특히 5~7개의 부품 플라스미드가 있는 어셈블리의 경우 매우 중요합니다. 각 플라스미드의 DNA 농도에 작은 오류는 복제 효율의 상당한 감소를 일으킬 수 있습니다.
    2. 각 플라스미드 1μL, 10X T4 리구아제 버퍼 1μL, BsaI-HFv2의 0.5 μL(BsaI의 매우 효율적인 버전), T4 리구아제0.5 μL을 추가합니다. ddH2O를 추가하여 부피를 10 μL로 구성합니다.
    3. 복제 반응을 설정하려면, 열순환기에서 다음 프로그램을 실행: 25-35 사이클 37°C의 5분 (소화) 및 16°C 5 분 (결찰). BsaI 부위가 중간벡터(도 3)에유지되어야 하므로 최종 소화 및 열 불활성화 단계를 생략한다.
    4. 전체 반응 믹스를 DH5α 균주 또는 다른 대장균 유능한 세포로 변환합니다. 50 μg/mL 카베니실린(Cb) 또는 암피실린으로 LB 플레이트에 퍼짐. 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.
      참고 : 카베니실린은 암피실린의 안정적인 아날로그입니다.
    5. 16-18 h 후, 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내. 플레이트에는 옅은 빨간색과 옅은 녹색식민지(그림 6C 및 6D)가모두 포함됩니다. mRFP1 및 sfGFP가 성숙하게 하기 위해 약 5 시간 동안 4 °C에서 플레이트를 유지하십시오. UV 또는 청색광 트랜실루미네이터를 사용하여 잠재적으로 올바른 중간 벡터를 포함하는 녹색 식민지를 식별합니다.
    6. LB + Cb 플레이트에 녹색 식민지를 줄이며 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오. 다음 날, LB + Cm 플레이트에 다시 밖으로 행진하고 하룻밤 37 ° C에서 배양. LB + Cm 플레이트에서 자라는 콜로니는 Cm 내성 부품 벡터가 유지되기 때문에 잘못 조립된 플라스미드를 함유하고 있습니다.
    7. LB + Cm 플레이트에서 자라지 않는 콜로니를 선택하고 제한 소화 (제안 된 효소 : BsaI-HFv2, Esp3I)를 수행하여 올바르게 조립 된 플라스미드를 확인하십시오. 또는, 스크리닝을 위해 콜로니 PCR을 사용하십시오.
  2. 중간 벡터가 성공적으로 조립되면 다음 단계는 전사 단위를 조립하는 것입니다. 중간 벡터, 프로모터, CDS 및 종단기와 같은 4피스 어셈블리입니다.
    1. 네 부분 플라스미드를 정화합니다. 그들의 농도를 기록하고 1 μLDNA의 20 fmol이 있도록 플라스미드의 각을 희석.
    2. 반응 믹스를 설정하려면 3.1.2 단계를 따르십시오.
    3. 복제 반응을 설정하려면 2.2 단계를 따르십시오.
    4. 전체 복제 반응 믹스를 DH5α 또는 동등한 대장균 유능한 세포및 LB + Cb. 인큐베이터에서 하룻밤 사이에 37°C로 변환한다.
    5. 16-18 h 후, 인큐베이터에서 접시를 꺼내. 흰색과 옅은 녹색 식민지가 나타납니다(그림 6E 및 6F). sfGFP가 성숙하게 하기 위해 약 5 시간 동안 4 °C에서 플레이트를 유지하십시오. UV 또는 청색광 트랜실루미네이터를 사용하여 비형광 백색 식민지를 식별합니다. 이들은 잠재적으로 정확한 전사 단위를 포함합니다.
    6. 밖으로 줄무늬와 8-10 흰색 식민지를 성장하고 식민지 PCR을 수행합니다. 식민지 PCR에서 양성 반응을 시험하는 식민지에서 플라스미드를 정화합니다. 조립을 더 확인하기 위해 제한 소화(제안된 효소: Esp3I)를 수행한다.
      참고: 복제에는 소화 및 결찰제한만 수반되므로 시퀀싱 전사 단위는 일반적으로 필요하지 않습니다. 관심의 모든 순서는 부품 플라스미드 수준에서 확인되었습니다.

4. 카세트 플라스미드를 "다중 유전자" 플라스미드로 조립:

참고: 다중 유전자 플라스미드는 하나 이상의 유전자의 발현을 허용합니다. 다운스트림 응용 프로그램에 따라 다중 유전자 플라스미드는 복제 또는 통합될 수 있습니다. 복제 플라스미드는 복제의 효모 기원을 가지고; 따라서 효모 세포가 분할될 때 안정적으로 유지할 수 있습니다. 통합 플라스미드는 복제의 효모 기원이 없습니다. 대신, 그(것)들은 동종 재조합을 통해 게놈의 특정 loci로 다중 유전자의 통합을 허용하는 5' 및 3' homology 무기가 있습니다.

  1. 다중 유전자 플라스미드의 경우 중간 벡터를 먼저 조립합니다.
    1. 복제 중간벡터(그림 4A)를조립하기 위해 왼쪽 커넥터(ConLS-pYTK008), sfGFP 드롭아웃(pYTK047), 오른쪽 커넥터(ConRE'-pYTK072), 효모 선택 마커, 복제의 효모 기원, 및 mRFP1을 가진 부품 플라스미드, 복제의 대장균 기원, 및 가나마이신 내성 유전자(pYTK084).
      1. 어셈블리의 경우 3.1.1에서 3.1.3으로 단계를 따르십시오.
      2. 전체 복제 반응 믹스를 DH5α 또는 동등한 대장균 유능한 세포로 변환하고, LB 플러스 50 μg/mL 카나마이신(Km)에 플레이트를 변환합니다. 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.
      3. 빨간색/녹색 색상 기반 스크리닝의 경우 3.1.5 단계를 따르십시오.
      4. 잘못된 조립을 선별하기 위해, 연승과 LB + Km 플레이트에 녹색 식민지를 성장. 그런 다음 3.1.6 단계를 따릅니다.
    2. 통합다중 다유전자 벡터(도4B)의경우 먼저 관심있는 게놈 궤적을 결정한 다음, 해당 궤적에 통합하기 위해 약 5개의 5' 및 3'상동성 팔을 설계합니다.
      1. 효모 게놈 DNA로부터 5' 및 3' 상동성 팔을 항목 벡터-pYTK001로 복제한다. 1단계와 2단계를 따릅니다.
      2. 왼쪽 커넥터(ConLS'-pYTK008), sfGFP 드롭아웃(pYTK047), 오른쪽 커넥터(ConRE'-pYTK072), 효모 선택 마커, 3' homology 팔, mRFP1, 복제의 대장균 기원, 및 가나마이신 내성 유전자(pYTK090) 및 5'homology arm을 가진 부품 플라스미드.
      3. 조립 및 스크리닝의 경우 4.1.1 단계를 따르십시오.
  2. 다중 유전자 플라스미드의 조립
    1. 단계 4.1 및 3단계에서 카세트 플라스미드에서 얻은 중간 벡터의 플라스미드를 정화한다. UV-Vis 분광광계 또는 형광 기반 분석기로 농도를 기록합니다. 1 μL에 20 fmol DNA가 있도록 ddH2O로 각각 희석하십시오.
    2. 중간 벡터 1μL, 각 전사 단위의 1 μL, 1μL 1μL 10x T4 리구효소 버퍼, Esp3I의 0.5 μL, T4 리가제 0.5 μL을 추가합니다. ddH2O를 사용하여 10 μL로 볼륨을 가져옵니다.
    3. 복제 반응을 설정하려면 2.2 단계를 따르십시오.
    4. 전체 복제 반응 믹스를 DH5α 또는 동등한 대장균 유능한 세포로 변환하고, LB + Km. 플레이트에서 하룻밤 사이에 37°C에서 배양한다.
    5. 단계 3.2.5에서와 같이 녹색 /흰색 스크리닝을 수행하십시오.
    6. 몇 개의 흰색 식민지에서 플라스미드를 정화하고 제한 소화를 수행합니다. 노티-HF 효소를 사용하는 것은 대장균 원점 과 Km 선택 마커 부분에 각각 2개의 NotI 부위가 있기 때문에 권장된다(도4B). 조립된 플라스미드가 매우 큰 경우 추가 확인을 위해 다른 제한 사이트를 선택할 수 있습니다. 또는, 소화를 제한하기 전에 식민지 PCR로 화면.

5. 염색체 또는 플라스미드 계 유전자 발현을 위한 다중 유전자 플라스미드를 적용

  1. 염색체 유전자 발현을 위한 효모 게놈에 다유전자 플라스미드를 통합(도 5)
    1. 원하는 궤적에 대한 가이드 RNA(gRNA)를 설계한다. 벤치링, CRISPRdirect43및 CHOPCHOP44와같은 여러 온라인 리소스를 사용하여 대상의 최대 특이성을 결정하는 것이 좋습니다.
    2. 합성된 20nt gRNA를 깁슨 복제에 의한 pCAS 플라스미드45로 클론한다. HDV 리보지메의 3'와 tracrRNA의 5'에 결합하는 반전 된 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의한 pCAS 플라스미드를 선형화(도 5). 대안적으로, gRNA 드롭아웃 플라스미드(pYTK050)로 gRNA를 복제하고, 드롭아웃 플라스미드를 링커가 있는 카세트 플라스미드로 조립한다. 그런 다음 Cas9 부품 플라스미드(pYTK036)로 Cas9 TU를 조립합니다. 마지막으로, Cas9 TU와 sgRNA TU를 복제 다중 유전자 플라스미드로 조립한다.
    3. 하룻밤 동안 NotI-HF 효소의 1 μL로 통합다중 다유전자 플라스미드의 5-15 μg를 선형화한다. pCAS-gRNA의 1 μg및 선형화된 통합 된 다중 유전자 플라스미드를 S. cerevisiae로변환합니다. 2007년46일게이츠와 쉬텔의 프로토콜을 따르거나 시판되는 효모 변환 키트를 사용하여 유능한 세포를 준비한다.
      참고: NotI 소화 후 선형화된 다중 유전자 플라스미드를 정화할 필요가 없습니다.
    4. 회복 후 세포를 펠렛, 상류제를 버리고, 동일한 양의 물로 씻어 내십시오. 전체 합성 배지(CSM) 드롭아웃 플레이트 또는 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 배지(YPD) 플레이트에 플레이트 효모 세포는 효모 선택적 마커에 따라 항생제를 투여한다. 식민지가 형성될 수 있도록 2일 동안 37°C에서 배양합니다. 식민지가 관찰되지 않는 경우, 30 °C에서 1 ~ 2 일 동안 추가로 배양하십시오.
    5. 콜로니 PCR47에의한 통합을 위한 스크린 효모 콜로니.
    6. pCAS를 치료하기 위해, 비 선택적 YPD 플레이트에 올바른 통합으로 식민지를 줄입니다. 하룻밤 사이에 30 °C에서 성장하십시오. YPD 플레이트에서 신선한 YPD 접시에 하나의 식민지를 줄입니다. 다시, 하룻밤 30 °C에서 성장. 제2 YPD 플레이트에서 YPD플러스 100 μg/mL nourseothricin, pCAS의 선택 마커로 식민지를 행진합니다. 성공적인 경화는 효모 세포가 선택적 플레이트에서 성장하지 못할 때 발생합니다.
      참고: pCAS 플라스미드가 비선택적 YPD의 두 라운드에서 경화되지 않으면, 또 다른 1-2 라운드에 대한 신선한 YPD에 다시 행진.
  2. 플라스미드 계 유전자 발현을 위한 복제 다중 유전자 플라스미드 변형
    1. 100 ng-1 μg 순수 다중 유전자 플라스미드를 S. 세레비시아에 유능한 세포로 변환합니다.
    2. 플레이트 효모 세포는 CSM 중퇴 플레이트 또는 YPD 플러스 항생제 판으로 전환한 직후, 사용되는 효모 선택 마커에 따라 한다. 식민지가 형성될 수 있도록 2-3일 동안 30°C에서 배양합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 β 카로틴(yellow) 및 리코펜(red) 생산을 위한 4개의 복제다유전자 플라스미드의 결과. ADE2 궤적을 방해하기위한 하나의 통합 다중 유전자 플라스미드가 건설되었으며, 그 중 식민지는 빨간색입니다.

CDS를 엔트리 벡터로 복제(pYTK001)
ERG20은 설명된 바와 같이 효모 게놈 및 3개의 카로티노이드 유전자 crtE, crtYB, crtIB로부터증폭되었다. 효모 프로모터 pENO2, pTIP1, pPYK1 및 pPDC1 및 종기 tTDH2, tHSP26, tADH2, tACS2는 부품 플라스미드로 복제되었다. 포인트 돌연변이는 리코펜을...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lee et al.에 의해 개발된 MoClo 기반 복제 키트는 효모 게놈내로의 복제 또는 통합을 위해 1~5개의 전사 단위를 다중 유전자 플라스미드로 빠르게 조립할 수 있는 우수한 자원을 제공한다. 이 키트의 사용은 효모에서 여러 유전자를 표현하기 위해 자주 존재하는 시간이 많이 소요되는 복제 병목 현상을 제거합니다.

우리는 T4 DNA 리구아제와 골든 게이트 복제의 소화 / 결찰 주기에 대한 다섯 가지 조건을 테스트했다. 37°C에서 5분 동안 37°C, 16°C에서 5분 동안 결단질한 후 50°C에서 최종 소화 단계가 10분 동안 50°C, 단백질 불활성화 단계는 80°C에서 10분 동안 80°C로 나타났으며, 4피스조립(보충 도면 S1)에서잠재적으로 정확한 99.5%의 콜로니를 초래한 것으로 나타났습니다. 16°C의 리구이는 최적의 리구아제 활동과 오버행 어닐링을 보장합니다. 50°C의 최종 소화는 소화된 제품이 재결합을 방지합니다. 이 주기는...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 뉴욕 주립 대학의 연구 재단 (상 #: 71272)과 버팔로 대학의 영향 상 (상 #: 000077)에 의해 지원되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mm 유리 구슬RPI 연구 제품9831효모 세포 용해 Bacto
AgarBD & 회사214010효모 완전 합성 배지 (CSM)의 구성 요소Bacto
PeptoneBD & 회사211677효모 추출물 펩톤 포도당 배지 (YPD)
BsaI-HFv2New England BiolabsR3733SBsaI 제한 효소의 고효율 버전
CarbenicillinFisher Bioreagents4800-94-6전사 단위 수준에서 스크리닝을위한 항생제
ChloramphenicolFisher Bioreagents56-75-7스크리닝을위한 항생제 엔트리 벡터 레벨
CSM-HisSunrise Sciences1006-010효모 완전 합성 배지(CSM)의 아미노산 보충제
DextroseFisher ChemicalD16-500효모 완전 합성 배지(CSM)의 탄소원
Difco 효모 질소 베이스 w/o 아미노산BD & 회사291940효모 완전 합성 배지 (CSM)
PCR Esp3INew England BiolabsR0734SBsmBI의 고효율 이소 정신 분열체
Frozen-EZ Yeast Trasformation II KitZymo ResearchT2001효모 형질전환
용 HexanesFisher ChemicalH302-1효모 세포에서 카로티노이드 추출의 경우
KanamycinFisher Bioreagents25389-94-0다유전자 플라스미드 수준 LB 한천 스크리닝을 위한 항생제
, <em>E. coli 배양용Fisher
용원 액체 배지 E. coli
라이코펜케이맨 화학 물질배양 NC1142173리코펜 정량화
MoClo YTKAddgene1000000061증착 연구소 : John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BiolabsT1010LE.coli< / em>
Nanodrop 분광 광도계Thermo ScientificND2000c정확한 DNA 농도 측정을 위해
NotI-HFNew England BiolabsR3189S통합 다중 유전자 플라스미드 선형화를 위한 제한 효소
Nourseothricin SulphateGoldbioN-500-100이 연구에 사용된 pCAS 플라스미드에 대한 항생제 선택 마커
Phusion HF 반응 Buffer (5X)New England BiolabsB0518SPhusion 중합효소를 사용한 PCR용 버퍼
Phusion High Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530S모든 PCR 반응에 대한 고충실도 중합효소
pLM494Addgene100539Plasmid 이 연구에 사용된 crtI, crtYB 및 crtE를 증폭하는 데 사용
Quartz CuvetteThermo Electron10050801카로티노이드 T4 리가제 정량화용
New England BiolabsM0202SLigase for Golden 게이트 클로닝
ThermocyclerBIO-RAD1851148모든 PCR 및 클로닝 반응 수행용
조직 균질화 BulletBlender모델: BBX24효모 세포 균질화용
UV-Vis 분광 광도계Thermo ScientificGenesys 150카로티노이드 정량화용
효모 추출물Fisher BioreagentsBP1422-500효모 추출물 펩톤 포도당 배지 (YPD)
β - 카로틴Alfa AesarAAH6010603β - 카로틴 정량화
dNTP 믹스의 질소 공급원 용 Promega U1515 dNTP Miller Bioreagents BP1426-2에서 플라스미드 정제 의 구성 요소

References

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