스테셀레이트 비계에 단계별 세포 파종하여 발아 혈관을 연구합니다.

요약

엔지니어링 된 조직은 중요한 영양소와 가스를 제공하고 신진 대사 폐기물을 제거하기 위해 적절한 혈관 네트워크에 크게 의존합니다. 이 작업에서는 내피 세포 및 지지 세포의 단계별 파종 프로토콜이 제어된 3D 환경에서 혈관 거동을 연구하기 위한 고도로 조직된 혈관 네트워크를 생성합니다.

초록

심장 혈관 시스템은 인간의 생리학의 핵심 선수, 본문에 대부분의 조직에 영양을 제공; 혈관은 각 특정 perfused 조직에 따라 다른 크기, 구조, 표현형 및 성능에 존재합니다. 손상되거나 누락된 신체 조직을 수리하거나 대체하는 것을 목표로 하는 조직 공학 분야는 통제된 혈관신생에 의존하여 엔지니어링된 조직 내에서 적절한 혈관화를 만듭니다. 혈관 시스템이 없으면 두꺼운 엔지니어링 구조가 충분히 영양을 공급할 수 없으므로 세포 사멸, 이식 불량 및 궁극적으로 실패가 발생할 수 있습니다. 따라서, 엔지니어링 된 혈관의 행동을 이해하고 제어하는 것은 분야에서 뛰어난 도전이다. 이 작업은 3D 스캐폴드 환경에서 선박 동작을 연구하기 위한 조직적이고 반복 가능한 선박 네트워크를 생성할 수 있는 높은 처리량 시스템을 제공합니다. 이 2단계 파종 프로토콜은 시스템 내의 선박이 스캐폴드 지형에 반응한다는 것을 보여 주며, 선박이 거주하는 구획 형상에 따라 독특한 발아 동작을 제시합니다. 이러한 높은 처리량 시스템에서 얻은 결과와 이해는 더 나은 3D 생체 인쇄 스캐폴드 구조 설계를 알리기 위해 적용될 수 있으며, 이를 통해 3D 프린팅을 세포화된 생물학적 환경의 기초로 사용할 때 다양한 3D 형상의 제조를 신속하게 평가할 수 없다. 더욱이, 이러한 높은 처리량 시스템에서의 이해는 급속한 약물 스크리닝의 개선, 공동 배양 모델의 급속한 발전, 혈관 시스템의 지식을 심화시키기 위해 혈관 형성에 대한 기계적 자극의 조사를 위해 활용될 수 있다.

서론

조직 공학 분야는 누락되거나 손상된 장기 및 조직^1을대체하기 위해 엔지니어링 된 구조의 제조로 빠르게 진행되고 있습니다. 그러나 조직 영양을 위한 작동 혈관 네트워크를 생성하는 것은 여전히 뛰어난 과제로 남아 있기 때문에 완전한 기능 구조는 아직 달성되지 못했습니다. 적절한 혈관화없이, 엔지니어링 된 조직은 산소와 영양소의 수동 확산 수송에 제한, 확산 한계에 최대 실행 가능한 조직 두께를 제한, 약 200 μm^2. 이러한 두께는 기능성 혈관 네트워크의 존재를 기능적 및 이식형 조직에 대한 필수 특성으로 만드는 대형 조직 결함을 복구하거나 전체 장기 제조에 적합하지 않습니다^3.

혈관 계통은 다양한 혈관으로 구성되어 있으며, 다양한 크기, 표현형 및 조직으로 숙주 조직과 밀접한 관련이 있습니다. 개발 및 발아 선박에 의해 수행 된 행동, 응답 및 마이그레이션 결정을 이해하면 엔지니어링 조직에 통합을 지시 할 수 있습니다^4. 현재, 체외 혈관 네트워크를 만들기위한 가장 일반적인 접근 방식은 내피 세포 (EC)와 지원 세포 (SC, 벽화 세포로 분화 할 수있는 능력)를 결합하는 것입니다. 이 환경은 세포가 혈관 네트워크^2,5,6,7,8에부착, 증식 및 자가 조립할 수 있도록 화학적^및물리적 신호를 제공한다. 공동 배양시, SC는 세포 외 매트릭스 (ECM) 단백질을 분비하면서 관 구조를 형성하는 IC에 기계적 지원을 제공합니다. 더욱이, 두 세포 유형 간의 상호 작용은 관형성, 혈관 발아 및 이주를 촉진하며, SC 성숙 및 분화 이외에 α-부드러운 근육 액틴 발현(αSMA) 벽화 세포^4로의기양양하게 된다. 선박 네트워크 개발은 하이드로겔, 다공성 폴리머 스캐폴드 또는 이들의 조합을 사용하여 생성된 3D 환경에서 가장 일반적으로 연구된다. 후자의 옵션은 셀 친화적 인 환경과 세포와 ECM⁹모두에 필요한 기계적 지원을 동일하게 제공합니다.

^{하이드로겔(10),}하이드로겔스-스캐폴드 조합^11,12,2D 플랫폼, 미세유체^{장치(13)에}세포를 공동 배양하는 등 혈관 발달을 연구하기 위해 많은 양의 작업이 수행되었다. 그러나, 하이드로겔은 세포가 가해지는^힘(14)에의해 용이하게 변형될 수 있고, 2D 및 미세유체시스템은 보다 추정가능한^{반응(15,16)을}얻기 위해 자연에 가까운 환경을 재현하지 못한다. 형성 선박이 주변 환경에 어떻게 반응하는지 이해하면 선박 개발을 예측 가능한 방식으로 안내할 수 있는 엔지니어링 환경을 제작할 수 있는 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 혈관 형성 현상을 이해하는 것은 스테레오리소그래피, 디지털 프로젝션 리소그래피, 연속 액체 인터페이스 생산, 3D 용융 전자 제트 라이팅, 솔루션 기반 3D 일렉트로젯 쓰기, 그리고 신흥 바이오 프린팅기술^{17,18,19,20, 20,21과}같은 서브미칸 -미크로닌 스케일 제조 기술의 급속한 출현과 보조를 맞추기 위해 특히 중요합니다. 혈관 생물학의 심화된 이해와 이러한 미세 제조 기술의 제어를 조정하는 것은 표적 조직에 적합한 엔지니어링 혈관의 생성에 핵심입니다.

여기서, 우리는 주변 비계 기하학에 새로운 형성 및 발아 선박의 반응을 연구하는 3D 시스템을 제시, 그들의 새싹 기원과 후속 마이그레이션^(22)를관찰. 테셀레이트 구획 지오메트리와 2단계 파종 기술이 있는 3D 스캐폴드를 활용하여 명확하고 쉽게 분석할 수 있는 고도로 조직화된 혈관 네트워크를 만드는 데 성공했습니다. 테셀레이션 된 형상은 로컬 환경에 반응하는 선박을 포함하는 개별 유닛을 갖춘 높은 처리량 시스템을 제공합니다. 다색 EC를 사용하여, 우리는 구획 형상 및 SC^{위치(22)와}상관관계가 있는 새싹 형성 기원 및 후속 마이그레이션 패턴을 추적하였다.

제안된 프로토콜은 혈관화 동작에 대한 기하학적 단서의 영향을 분석할 준비가 되어 있지만, 이 방법은 다양한 새로운 응용 분야에 확장및 적용할 수 있습니다. 테셀레이션 스캐폴드와 쉽게 이미지할 수 있는 네트워크는 다양한 IC 및 SCs 상호 작용, 특정 장기 세포의 추가 및 혈관 네트워크와의 상호 작용, 혈관 네트워크에 대한 약물 효과 등을 간단하게 분석할 수 있게 해주었습니다. 우리의 제안 된 시스템은 매우 다양하고 간단한 제작 및 처리의 결과.

프로토콜

1. 테셀레이션 스캐폴드 제작

참고: 포토리스소그래피는 일반적으로 나노 제조 시설/실험실 내에 보관되는 특수 장비를 필요로 하는 광범위한 기술입니다. 이 프로토콜에 명시된 방법은 청중을 위해 가능한 한 일반화되었습니다. 그러나 독자가 사용할 수 있는 장비에 따라 절차에 약간의 변경이 필요할 수 있습니다. 최고 공정 품질을 보장하기 위해 나노 제조 시설의 클린 룸에서 이러한 절차를 수행하는 것이 좋습니다. 시작하기 전에 마스크 정렬기 (또는 일부 UV 노출 설정), 스핀 코터, 핫 플레이트, 용매 세척 소, 포토 마스크 및 플라즈마 클리너에 액세스 하십시오. 절차에 사용되는 용매와 화학 물질은 위험하므로 화학 물질 노출을 피하기 위해 최대한주의하십시오. 포토마스크를 디자인할 때 스핀 코터 및 마스크 정렬기와 호환되는 크기의 실리콘 웨이퍼와 포토마스크를 식별합니다. 또한 실리콘 웨이퍼의 가장자리를 향해 위치한 포토레지스트는 일반적으로 처리에서 변형됩니다. 따라서 웨이퍼의 중심 영역으로 디자인을 만듭니다.

1. 선택한 관심 기하학을 사용하여 포토리소그래피 기술을 사용하여 스캐폴드를 준비합니다.
   1. 스핀 코팅 전에 실리콘 웨이퍼를 청소하십시오. 이것은 플라즈마 세척 또는 용매 기반 기술로 수행 할 수 있습니다. 플라즈마 세척의 경우 기기의 표준 작동 절차를 따라 작동 세부 사항을 확인하십시오. 압축 질소 가스로 분무하고 웨이퍼를 검사하여 스핀 코팅 전에 이물질이 없도록 합니다. 이 웨이퍼는 스캐폴드가 생성되는 기판역할을 합니다.
      참고: 최상의 결과를 얻으려면 새로운 웨이퍼로 시작하십시오. 웨이퍼는 재사용할 수 있지만 오래된 포토레지스트, 표면 결함 및 파편이 없어야 합니다. 취급을 위해 웨이퍼 핀셋을 사용하는 것이 좋습니다.
   2. 가이드를 사용하여 실리콘 웨이퍼를 스핀 코터 척에 중앙에 넣습니다. 웨이퍼를 짧게 회전하여 척을 적절히 중심으로 되었는지 확인하고, 적절히 중심이 될 때까지 필요에 따라 조정합니다. 웨이퍼가 스핀 코트에 배치 될 때마다 수행해야합니다. 웨이퍼에 리프트 오프 시약의 1-4 mL을 분배합니다 (이것은 웨이퍼의 크기에 따라 달라집니다). 리프트 오프 시약의 약 2 mL4 인치 웨이퍼에 적합합니다.
      1. 스핀 코터 스프레드 속도를 5초 동안 500rpm으로 설정하고 스핀 스피드를 30초 동안 1000rpm으로 설정한 다음 리프트 오프 시약을 회전합니다. 웨이퍼를 검사하여 웨이퍼 전체에 균일한 코팅이 있는지 확인합니다. 웨이퍼에 남아있는 파편은이 시점에서 매우 분명 할 것입니다. 파편이 있는 지역의 비계는 사용할 수 없을 것입니다. 스핀 코팅 후, 핫 플레이트로 옮기고 200 °C에서 1 분 동안 구워줍니다.
   3. 이전 단계를 총 3개의 코팅에 대해 두 번 더 반복합니다.
   4. 리프트 오프 시약 코팅 실리콘 웨이퍼를 SU-8 2050 포토레지스트로 스핀 코트하여 약 100 μm의 두께를 얻습니다.
      1. 기판 직경 25mm당 1mL의 저항을 분배합니다.
         참고 : 저항을 붓는 동안 거품을 피하기 위해주의하십시오. SU-8 2050의 경우, 약 2인치 직경원을 붓는 경우 4인치 실리콘 웨이퍼를 사용하면 잘 작동합니다.
      2. SU-8 2050스핀 코트. 5초 동안 500rpm의 속도로 확산된 다음 1700rpm에서 1800rpm 사이의 스핀 속도를 발휘하여 약 100μm 두께를 달성합니다.
      3. 선택 사항: 회전 후, 스핀 코팅 웨이퍼를 프리 베이킹 전에 빛으로부터 보호된 수평 표면에 밤새 디가스로 둡니다. 이것은 어떤 거품의 저항을 제거하고 결함을 평준화하는 것을 허용하는 것을 도울 수 있습니다.
         참고: 레지스트및 결과스캐폴드의 실제 두께는 사용자 오류 및 장비 매개 변수에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 스캐폴드의 두께는 1.6단계에서 나중에 확인되어야 한다. 원하는 두께를 달성하기 위해 그에 따라 스핀 코팅 절차를 수정합니다.
   5. 노출 전에 웨이퍼를 65°C에서 10분 동안 미리 구운 다음 95°C를 40-50분 동안 미리 굽습니다. 노출되기 전에 핀셋 한 쌍으로 가장자리를 눌러 저항의 표면을 테스트하여 더 이상 끈적거리지 않도록 합니다. 그것은 뜨거운 접시에서 웨이퍼를 당겨 서 0.5-1 분 동안 식힐 수 있도록 하는 것이 도움이 됩니다.
      참고: 느린 온도 램프 시간(가열 및 냉각)은 비계의 뒤틀림을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
2. 85 -110 μm의 저항 두께에^대한 215-240 mJ / cm 2의 노출 에너지와 포토 마스크를 통해 자외선 (350-400 nm)에 포토 레지스트를 노출합니다. 권장 노출 에너지 두께 상관 관계에 대한 포토레지스트 제조업체 지침을 참조하십시오.
   1. 에너지가 검증되도록 노출이 적절하게 보정되었는지 확인합니다. 원하는 노출 에너지를 달성하기 위해 필요에 따라 노출 시간을 조정합니다. 또한 마스크 정렬기는 진공 접촉, 하드 접촉, 소프트 접촉 및 근접 접촉(특정 용어가 다를 수 있음)과 같은 다양한 노출 모드를 허용할 수 있습니다. 일반적으로 이러한 해상도 및 기능 정렬에 영향을 미칩니다. 저자는 일반적으로 "하드 접촉" 모드를 사용 했습니다.
   2. 정렬이 중요한 작은 피처 나 여러 레이어의 경우 노출 모드와 마스크 정렬기 절차를 보다 신중하게 고려하십시오. 두께 값을 조정할 때 저항의 높이를 고려해야 합니다. 작동 세부 사항에 대 한 마스크 정렬기의 표준 작동 절차를 참조 하십시오.
      참고: 포토마스크의 설계는 배치당 얻은 스캐폴드 크기, 구획 형상 및 스캐폴드 수를 결정합니다. 하드 유리 또는 석영 포토 마스크의 사용은 가장 높은 해상도를 산출한다; 그러나, 연약한 폴리머 투명 필름 포토마스크는 일반적으로 이러한 대형 피처 크기(>10 μm)에 사용될 수 있다. 필름 포토마스크를 사용하면 스캐폴드 모공의 z축을 따라 지형 기능이 부족하여 장편 해상도가 저하될 수 있습니다. 이것은 잠재적으로 세포 행동에 영향을 미칠 수 있습니다. 원하는 해상도를 확인하려면 포토마스크를 생산하는 사람과 상담하여 원하는 해상도를 확인하십시오.
3. UV 노출 직후 에 65°C에서 2-5분 간 구우고 95°C에서 8-10분간 굽습니다.
4. 미개발 저항을 제거하기 위해 비계를 개발한다.
   1. 개발되지 않은 저항을 용해하기 위해 7-10 분 동안 SU-8 개발자 솔루션의 낮은 볼륨을 사용하여 스캐폴드를 침수하십시오.
   2. 이소프로필 알코올 (IPA)으로 헹구세요.
   3. 압축 질소와 건조 웨이퍼.
      참고: 1.4단계에서 스캐폴드의 조기 방출을 일으키지 않도록 주의하십시오. 이를 위해서는 적은 양의 개발자와 부드러운 취급이 필요합니다.
5. 개발 후 웨이퍼를 150°C에서 15분 동안 하드 베이킹합니다.
   참고 : 하드 베이킹 후, 웨이퍼가 매우 느리게 냉각 할 수 있도록 핫 플레이트를 끄면 최종 스캐폴드의 뒤틀기 / 컬링을 방지하는 데 유리할 수 있습니다.
6. 선택 사항: 하드 베이킹에 따라 리프트 오프 전에 스캐폴드 두께를 평가합니다. 이 절차에 대 한, 접촉 능숙 잘 작동; 그러나 적절한 방법을 사용할 수 있습니다.
7. 웨이퍼에서 비계를 들어 올립니다.
   1. SU-8 개발자의 비계를 잠수하여 웨이퍼를 즉시 들어 올릴 수 있습니다. 스캐폴드가 들어올리지 않으면 웨이퍼 핀셋으로 스캐폴드를 부드럽게 밀어 넣습니다.
   2. 초과 개발자를 제거합니다.
   3. 비계를 새 용기에 옮기고 이소프로필 알코올에 담가 넣습니다. IPA에서 최소 6회 헹신후 모든 개발자가 제거되었는지 확인합니다.
8. 공기는 사용하기 전에 최소 일주일 동안 비계를 건조.

2. 스캐폴드 섬유네틴 코팅

1. 소독의 경우 비계를 70% 에탄올(v/v)으로 최소 15분 간 잠수하고, 사용하기 전에 인산완충식염(PBS)에서 2회 세척한다.
   주의: SU-8 비계는 연약하며 쉽게 깨질 수 있습니다. 무딘 및 곡선 형 집게를 사용하여 취급하는 것이 좋습니다, 그들은 최대주의처리되어야한다. 스캐폴드와 표면 간의 정전기 상호 작용을 피하기 위해 비계를 액체에 잠급으로써 더 쉽게 취급할 수 있습니다.
2. PBS에서 인간 섬유네틴의 50 μg/mL희석을 준비하고 단백질 흡착에 의한 비계를 덮습니다.
   1. 각 스캐폴드당 PBS의 28.5 μL과 1.5 μL의 fibronectin 스톡 용액(1 mg/mL)을 혼합하여 시드를 드실 수 있습니다. 바람직하게는, 파이펫팅 오류를 피하기 위해 모든 스캐폴드에 사용되는 하나의 fibronectin 희석만 을 준비한다.
      1. 10개의 비계의 경우, PBS의 285 μL에 15μL의 스톡 섬유네틴 용액을 섞어 총 300 μg/mL 섬유네틴 희석에 해당합니다.
   2. 스캐폴드를 소수성 표면(즉, 비조직 배양(nonTC) 10cm 접시 위에 희소하게 놓고 각 스캐폴드를 2.2.1 단계에서 제조된 섬유넥틴 희석의 30μL로 덮는다.
      주의: 비계 구획에 거품이 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 거품이 있는 경우 액적 또는 가벼운 파이펫팅 내의 비계를 부드럽게 흔들어 제거할 수 있습니다.
   3. 플레이트뚜껑을 교체하고 섬유네틴으로 덮인 비계를 37°C와 100% 습도로 인큐베이터에 최소 한 시간 동안 배치합니다.
   4. 잠복 후 PBS에서 비계를 가볍게 헹구어 섬유네틴 잔재를 제거합니다. 스캐폴드는 사용하기 전에 최대 1주일 동안 PBS에서 4°C로 보관할 수 있습니다.

3. 내피 세포 파종

1. 제조 업체에 의해 표시된 바와 같이, 항생제 용액 (펜 / 스트렙), 태아 소 혈청 (FBS), 내피 세포 성장 보충제를 포함하여 그것의 특파원 매체 키트 구성 요소와 기저 배지를 혼합하여 EC 매체를 준비.
2. 4 x 10⁶ 세포/mL의 농도를 가진 EC 배지에서 인간 지방 미세 혈관 내피 세포(HAMEC) 현탁액을 만듭니다.
   참고: 사용된 내피 세포가 이전에 형광 단백질을 발현하기 위해 전염되거나 비독성 세포질 막 염료(추가로 표지된 IC라고 도함)를 사용하여 미리 염색된 경우 실시간 이미징을 수행할 수 있습니다.
3. 집게를 사용하여, 비TC 24 웰 플레이트에 잘 당 하나의 fibronectin 코팅 비계를 배치합니다.
4. 각 스캐폴드를 HAMEC 서스펜션의 25 μL 액적으로 덮습니다. 현탁액이 세포 접착을 방해할 수 있기 때문에 스캐폴드에서 멀리 흐르지 않도록 주의하십시오.
5. 뚜껑을 접시에 놓고 37°C, 5% CO₂ 및 100% 습도에서 인큐베이터에 넣습니다. 최소 60분, 최대 90분 동안 배양해하십시오.
   참고: 인큐베이션 중에 플레이트를 인큐베이터 내의 궤도 셰이커에 놓아 비계 벽에 세포 부착이 향상됩니다. 궤도 셰이커는 5rpm 이하로 설정해야 합니다.
6. 인큐베이션 후 파이펫을 사용하여 EC 배지의 700 μL로 각 우물을 채웁니다.
   참고: 일부 세포가 비계에 부착하지 않고 비계의 공극을 통해 떨어지지 않기 때문에 우물 의 하단에 있는 IC를 볼 것으로 예상됩니다.
7. EC 결합이 비계 벽 (라벨이 붙은 IC를 사용하는 경우) 또는 3 일 동안 (라벨이 없는 IC를 사용하는 경우) 또는 EC 결합을 달성하기에 충분한 시간을 제공하는 형광 현미경 검사를 사용하여 관찰 될 때까지 내피비폴드를 배양합니다. 격일로 매체를 변경합니다.

4. 세포 종자 및 공동 배양 지원

1. 치과 펄프 줄기 세포(DPSC) 배지(DPSCm)를 저혈당 덜벡코의 변형이글 배지(저혈당 DMEM), 57.5mL의 FBS를 혼합하여, 비필수 아미노산의 5.75 mL (NEAA), 글루타맥스의 5.75 mL, 페니실린 연쇄 절제술-니스타틴 용액의 5.75 mL.
2. 내피비폴드를 새로운 비TC 24웰 플레이트로 전송하여 집게를 사용하여 우물 바닥에 부착된 IC를 폐기합니다.
   1. 1mL 파이펫 또는 진공 흡입을 사용하여 현재 플레이트에서 모든 미디어를 폐기하십시오. 비계에 진공을 똑바로 바르지 않도록 주의하십시오.
   2. 표면 장력 효과로 인해 벽을 향해 액체를 달리는 것을 피하기 위해 웰의 중앙에 비계 1 개를 놓습니다. 가벼운 진공으로 비계 주변의 부위를 건조하지만 스캐폴드의 완전한 건조를 피하십시오.
3. 피브린 프리 젤 용액에서 DPSC 서스펜션을 준비합니다.
   1. 각각 5 U/mL 및 15 mg/mL의 최종 농도를 얻을 때까지 PBS와 함께 혈전 및 피브리노겐 스톡 솔루션을 희석시하십시오.
   2. 5 U/mL 트롬빈 희석에서 8 x 10⁶ DPSC/mL 서스펜션을 준비하고 종자할 스캐폴드당 해당 현탁액의 개별 eppendorfs 12.5 μL에 분배한다.
   3. 5-50 μL 파이펫(또는 이와 유사한)을 12.5 μL로 설정하고 15 mg/mL 피브리노겐 용액으로 채웁니다.
   4. 팁을 제거하지 않고 파이펫을 25 μL로 설정합니다. 팁의 재질은 상승하여 팁 개구부쪽으로 빈 볼륨을 남겨두어야 합니다.
   5. 액체가 팁 개구부에 도달할 때까지 플런저 버튼을 천천히 누르지만 누출되지 않습니다. 플런저를 이 위치에 놓고 팁을 혈전 현탁액에 있는 세포를 포함하는 마이크로센트심분리기 튜브 중 하나에 넣어 팁이 액체와 접촉하고 있는지 확인합니다.
      주의: 혈소및 피브리노겐이 접촉한 직후 피브린 크로스링크가 시작됩니다. 다음 단계는 신속하게 수행해야 합니다.
   6. 플런저 버튼을 부드럽게 풀어 서 셀 서스펜션을 팁에 그립니다. 두 재료를 철저히 혼합하여 거품 형성을 피하십시오.
4. 내피비폴드 위에 혼합 재료를 신속하게 분배합니다. 각 스캐폴드에 대한 이전 단계를 반복하여 팁 내에서 예기치 않은 피브린 젤 형성을 피하기 위해 사용 간에 항상 팁을 변경해야 합니다.
5. 플레이트 뚜껑을 교체하고 37°C, 5% CO₂ 및 100% 습도에서 30분 동안 비계를 배양합니다.
6. 인큐베이션 후, 각각 1mL의 1:1 DPSC 및 EC 배지로 채우세요.
   1. 1 주일 동안 문화, 격일로 매체를 변경합니다.
   2. 배양 하는 동안, 혈관 발달 또는 관심의 다른 매개 변수를 연구 하기 위해 상이한 시점에서 공초점 현미경을 사용 하 여 우물에서 배지를 제거하고 이미지를.
      참고: 이 단계는 레이블이 지정된 IC를 사용하여 실험을 수행하는 경우에만 수행할 수 있습니다. 추가 설명을 위해 6단계 - 참고를 참조하십시오.

5. 특징적인 혈관 마커를 위한 면역 형광 염색

참고: 구문이 배양된 동일한 우물에서 다음 단계를 수행할 수 있습니다. 솔루션이 스캐폴드를 완전히 커버하는지 항상 확인하는 것이 중요합니다. 또한 가능하면 궤도 셰이커에서 단계를 수행하는 것이 권장되지만 필수는 아닙니다.

1. 7일째에는 우물에서 미디어를 버리고 우물에 PBS를 추가하고 진공을 사용하여 제거하여 비계를 헹구십시오.
2. 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드를 추가하여 비계를 수정합니다. PBS에서 3회, 세척당 5분간 세척합니다.
3. PBS(v/v)에서 0.3% 트리톤-X를 사용하여 고정 된 세포를 15 분 동안 과음시. PBS에서 3회, 세척당 5분간 세척합니다.
4. PBS(w/v) 블로킹 용액에서 5% 소 세럼 알부민(BSA)을 준비하고 스캐폴드를 덮습니다. 실온에서 1시간 동안 그대로 둡니다.
   참고: 필요한 모든 솔루션 금액은 염색할 스캐폴드 수에 따라 달라집니다. 명시된 농도를 유지하는 데 필요한 솔루션을 준비합니다.
5. 1차 항체 염색 용액을 준비하고 적용한다.
   1. 희석 토끼 안티 폰 윌브랜드 인자 (vWF) 항체 1:150 및 마우스 안티 SMA 항체 1:50 신선한 차단 용액에.
      참고: CD31 또는 VE-Cadherin과 같은 다른 내피 세포 마커를 사용할 수 있습니다.
   2. 1 차적인 항체 용액으로 비계를 덮고 하룻밤 사이에 4 °C에서 유지하십시오. PBS에서 세 번, 세척 당 5 분 세척합니다.
6. 이차 항체 염색 용액을 준비하고 적용합니다.
   1. 희석 염소 항 마우스 Cy3 항체 1:150 및 염소 안티 토끼 알렉사 플루어 488 1:400 PBS에서.
   2. 이차 항체 용액으로 스캐폴드를 덮고 실온에서 최소 3시간 또는 하룻밤 사이에 4°C로 배양한다. PBS에서 3회, 세척당 5분간 세척합니다. 얼룩진 스캐폴드를 PBS(v/v)에서 0.3% PFA로 최대 한 달 동안 보관하십시오.

6. 스캐폴드 공초점 이미징 및 선박 개발 분석

참고: 다음 단계는 선택한 최종 시점또는 형광 세포가 사용되는 경우 실험을 종료할 필요 없이 세포 배양 기간 동안 고정 및 염색 된 스캐폴드에서 수행 될 수 있습니다. 후자의 경우 특정 시간 점을 설정하는 것이 좋습니다. 이 작품은 0일(SC 시드 전) 및 SC 시드 후 1일, 3일, 5일, 7일(그림3A)을보여줍니다.

1. 5X 렌즈와 0.5의 줌과 스캐폴드의 전체 z 범위로 공초점 현미경을 사용하여 스캐폴드를 이미지합니다. 이렇게 하면 제곱 및 원형 형상을 위한 9개의 개별 구획 또는 육각형 형상을 위한 8개의 전체 구획을 캡처할 수 있습니다. 형광 신호 및 전송된 빛을 이미지하여 선박 네트워크 구조와 구획형상(도 3A)을모두 얻습니다.
2. ImageJ(또는 다른 이미지 처리 소프트웨어)를 사용하여 각 개별 구획을 자르십시오. 이 프로세스의 경우 혈관 네트워크 마커만 관련이 있습니다. 구획 영역 내에 없는 선박을 제거합니다. 최대 강도 투영을 만들고 각 개별 자른 구획을 TIFF 이미지로 저장합니다.
   1. ImageJ에서 파일을 > 열고 여러 구획이 포함된 원하는 TIFF 이미지를 선택합니다. 이미지에는 적어도 두 개의 채널, 형광 용기 네트워크 및 전송된 광 이미지가 있어야 합니다.
   2. 도구 모음에서 다각형 선택 도구를 선택합니다. 전송된 라이트 채널을 선택합니다. 구획 영역과 스캐폴드 벽 사이의 인터페이스에서 육각형 구획의 모서리 중 하나를 클릭하면 마스크 정의가 시작됩니다. 초기 모서리를 선택할 때까지 순차순서로 다음 모서리를 계속 클릭하여 마스크를 닫습니다.
      참고: 이 설명은 육각형 구획에 적용됩니다. 구획이 제곱또는 원형인 경우 사각형 또는 타원형 도구를 각각 사용하여 적절한 마스크를 만듭니다. 모양에 관계없이 항상 마스크를 착용하여 스캐폴드의 내부 벽을 따라가십시오.
   3. ROI 관리자> > 도구 분석> 클릭하십시오. ROI 관리자(ROI, 관심 영역)에서 추가 버튼을 클릭하여 생성된 마스크를 저장합니다. 왼쪽 면 목록에 새 마스크가 표시됩니다. 이 단계를 사용하면 서로 다른 이미지 간에 분석을 일관되게 수행할 수 있습니다.
      참고: ROI 관리자에서는 더 많은 > 저장을클릭하여 생성된 모든 마스크가 있는 파일을 저장할 수 있습니다. 선택 저장 창에서 이름과 위치를 선택하고 .roi 파일을 저장합니다. 마스크를 검색하려면 ROI 관리자에서 더 많은 > 열기를 클릭하고 원하는 .roi 파일을 선택합니다.
   4. 형광 용기 네트워크 이미지를 선택하고 편집 > 외부 지우기클릭합니다. 마스크에 포함된 이미지만 유지되고 나머지는 제거됩니다.
   5. 지워진 네트워크 이미지가 열려 있는 경우 이미지 > 중복을 클릭합니다. 중복 팝업 창에서 이미지 이름을 씁니다. 중복 하이퍼스택을 선택하면 선택 해제하고 확인을 클릭합니다. 크롭 형광선 네트워크만 포함된 새 이미지가 생성됩니다.
   6. > Tiff로 저장 파일 >클릭하여 자른 이미지를 저장합니다. 이름과 디렉토리를 선택하고 확인을 클릭합니다.
3. 자른 이미지의 혈관 발달을 분석합니다.
   1. 다양한 혈관 매개 변수를 정량화하는 정량적 도구를 제공하는 분석 무료 소프트웨어 AngioTool을 다운로드하여 설치합니다. 소프트웨어는 https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home 다음 주소에서 얻을 수 있습니다.
   2. 이미지의 배율 값을 설정하여 결과를 밀리미터 단위로 가져오고 이미지를 로드합니다.
      1. 설정 탭을 클릭하고 촬영한 이미지의 대표 값으로 픽셀 및 거리의 거리를 mm단위로 채웁니다. 위에서 언급한 이미징 매개 변수를 사용하여 채울 값은 1mm당 400픽셀입니다.
      2. 열기 이미지 버튼을 누르고 관심 있는 이미지를 찾아보세요.
   3. 분석 탭에서 선박 개발을 정량화하려면 분석 매개 변수를 선택합니다.
      1. 선박 직경 및 강도 필드 하에서, 상단 범위 선택기에서 현재 마커를 선택 해제하고 숫자 3을 나타내는 마커를 활성화합니다.
      2. 선박 직경 및 강도 필드 하에서, 바닥 범위 선택기에서, 낮은 범위 마커를 60으로 이동하고, 높은 레인저 메이커를 255로 둡니다.
      3. 작은 파티클 제거 상자를 활성화하고 마커를 100으로 설정합니다.
      4. 환경 설정 저장필드 에서 결과가 저장되는 스프레드 시트 파일의 이름과 위치를 선택하고 실행 분석 버튼을 누릅니다. 결과 저장 이미지 상자를 선택하면 Angiotool은 선박 네트워크 정량화 매개 변수를 보여주는 새 jpeg 이미지를 생성하고 저장합니다.
         참고: 스프레드 시트 파일 이름을 변경하지 않고 수행된 각 분석에 대해 새로 획득한 결과와 함께 파일 하단에 새 행이 추가됩니다.
4. 데이터를 구성하고 통계 분석을 실행합니다.
   1. 모든 처리된 이미지의 경우 스프레드 시트(예: 총 용기 길이 및 선박 영역)에서관심 있는 매개변수를 선택하고 통계 분석 소프트웨어에 입력하여 얻은 결과(도3C)를적절히 연구한다.

7. 발아 원산지 감지 및 마이그레이션 추적을 위한 시간 경과 이미징

1. 대안적으로, 4.6단계에서 설명된 바와 같이 인큐베이터에서 비계를 배양하기 위해, 공초점 현미경 배양 챔버를 37°C, 5% CO₂ 및 100% 습도로 설정한다.
   1. 공초점 현미경 챔버에 완전히 시드 된 비계를 포함하는 플레이트를 넣고 이미징 매개 변수를 원하는 값으로 설정합니다.
   2. 촬영 간격을 30분으로 설정하고 총 이미징 시간을 72시간으로 설정합니다. 이렇게 하면 중간 변경 없이 시간 경과를 완전히 실행할 수 있습니다.
      주의: 더 긴 경과 이미징이 필요한 경우, 중간 변화로 인해 공초점 인큐베이터에서 멸균 생물학적 후드로 플레이트를 제거해야 하기 때문에 원래 이미징 위치를 검색할 수 있도록 신중한 위치 교정을 수행해야 합니다.
      참고: 비계 벽과 관 구조 형성에서 분리된 IC는 SC 시드(4단계) 이후 첫 1시간 이내에 시작되며 완료하는 데 최대 50시간이 걸릴 수 있습니다. 초기 튜브 형성 후, 새로운 새싹은 주변 선박에서 구획으로 마이그레이션하기 시작합니다. 발아 및 후속 네트워크 리모델링은 선박 네트워크가^안정될때 10일까지 실험 내내 계속될 것이다. 이 정보를 사용하여 시간 경과 시작점 및 시간 단계를 그에 따라 선택합니다.
2. 전체 타임랩스 무비 파일을 TIFF 시퀀스로 저장합니다.
3. ImageJ를 열고 파일 > 가져오기 > 이미지 시퀀스를 클릭하고 파일을 선택합니다. 이렇게 하면 TIFF 시퀀스가 영화로 열립니다.
4. 수동 추적을 > 클릭 하여 수동 추적 플러그인을엽니 다. 이렇게 하면 추적 창이 열립니다.
5. 영화를 관찰하고 추적할 선박을 선택합니다. 그 기원과 마이그레이션에 주의를 기울이는 다.
6. 매개 변수 표시 상자를 활성화하고 시간 간격에 대해 30분을 입력합니다. x/y 교정은 이미징 중에 선택한 픽셀 양에 따라 달라집니다.
7. 스캐폴드 윤곽에서 발아 용기를 수동으로 추적합니다.
   1. 트랙 추가 버튼을 누릅니다. 영화의 첫 번째 프레임에서 추적할 선박의 위치를 누릅니다. 이 후 동영상이 자동으로 다음 프레임으로 변경됩니다.
   2. 용기가 있는 두 번째 프레임의 이미지를 클릭합니다. 다시 말하지만, 영화는 자동으로 다음 프레임으로 변경됩니다.
   3. 전체 마이그레이션 추적이 완료될 때까지 동일한 선박을 진행합니다.
   4. 추적 창에서 오버레이 도트 및 선을 클릭하여 동영상의 배 마이그레이션의 시각적 경로를 각인합니다. 이렇게 하면 트래커의 현재 위치를 나타내는 점과 이전 경로를 나타내는 선이 있는 동영상복사본이 열립니다.
   5. 끝 트랙 버튼을 클릭하여 현재 선박 이동 기록을 완료합니다.
   6. 트랙 추가 버튼을 다시 클릭하여 새 선박으로 다시 시작합니다. 이렇게 하면 선과 도트 마커가 새 용기의 색상을 자동으로 변경합니다. 원하는 모든 선박이 추적될 때까지 반복합니다.
      참고: x/y 위치, 선박 속도 및 이동 거리는 팝업 창 결과에서검색할 수 있습니다. 각 선박은 왼쪽 열의 트랙 번호로 식별됩니다. 이 데이터는 추가 분석을 수행하기 위해 스프레드 시트에 복사하여 붙여넣을 수 있습니다.

결과

제시 된 프로토콜, 스테레오 소그래피 기술을 사용하여, SU-8 포토 레지스트로 만든 테셀레이션 스캐폴드의 제조를 허용합니다. 뚜렷한 구획 형상(사각형, 육각형 및 원)을 가진 스캐폴드를 획득했으며 매우 정확하고 반복 가능한 특징이 얻어졌다(그림1).

그림 1: 테셀라테스 제곱, 원형 및 육각형 스캐폴드 기하학(스케일 바 = 500 μm)의 대표적인 스캐닝 전자 현미경 이미지.

토론

엔지니어링 된 조직에 내장 된 내에 풍부한 혈관에 대한 필요성은 생존과 적절한 기능^1을구성하는 데 중요합니다. 혈관 시스템을 엔지니어링하는 것은 방대한 양의 연구의 초점이었지만, 많은 사람들이^{조사하고 24를}이해하기 위해 남아 있습니다. 특히, 특정 조직을 재현할 때, 마이크로혈관은^12에따라 행동하고 구성해야 한다. 마이크로혈관 생성을 위한 가장 일반적인 접근법은 세포 부착, 증식 및 혈관^{형성(25)에}적합한 3D 환경 내에서 내피 및 지지 세포를 공동 파종하는 것이다. 이 방법론은 종종 크게 조직되지 않은 네트워크를 초래하여 미세 혈관 행동^(22)을연구하기가 어렵습니다. 여기서 제시된 프로토콜은 고도로 구성된 혈관 네트워크를 고처리량 시스템에서 생성하는 새로운 도구를 제공하며, 시간이 지남에 따라 쉽게 추적하고 모니터링...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Angiotool 프리웨어	NIH-CCR		https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
소 알부민 혈청 Probumin	Millipore	82-045-1
치과 치수 줄기 세포	Lonza	PT-5025
ECM 미디어 + 총알 키트	Sciencell	# 1001
에탄올 96 %	Gadot-Group	64-17-5
Evicel 피브린 실란트	Johnson& Johnson	EVB05IL	트롬빈과 피브리노겐(BAC2) 용액을 모두 제공합니다
GlutaMAX	Gibco 35050061
Goat anti-mouse Cy3 항체	Jackson	115-166-072
염소 anti-rabbit Alexa-Fluor 488	Thermo- Fisher Scientific	A11034
인간 지방 미세혈관 세포	Sciencell	#7200
Human fibronectin	Sigma	F0895-5MG	재고 농도: 1 mg/mL
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html 에서 무료 다운로드
이소프로필 알코올	Gadot-Group	67-63-0
Lift-off 시약	Kayaku Advanced Materials, Inc		G112850 상업적 이름 Omnicoat
저포도당 DMEM	Biological Industries	01-050-1A
마우스 항 SMA 항체	Dako	M0851
NEAA	Gibco	11140068
파라 포름 알데히드 용액 4 % PBS	ChemCruz	SC-281692
페니실린-스트렙토 마이신-니스타틴 용액	생물 산업	03-032-1B
인산염 완충 식염수 (PBS)	시그마	P5368-10PAK
토끼 안티 vWF 항체	Abcam	ab9378
실리콘 웨이퍼	실리콘 밸리 마이크로 일렉트로닉스 (SVM)		웨이퍼 4 ", 유형 N-1-10, 500-550 미크론 두께
의 SU-8 2050 포토 레지스트	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y11058
SU-8 개발자	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y020100
Tryton-X 100	BioLab Ltd	57836