방법 논문

신생아 마우스에서 기본 백색및 갈색 프레드포스세포의 격리 및 분화

DOI:

10.3791/62005

⸱

2021년 1월 25일

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA, 2Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health, Madison, WI, USA

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 보고서는 신생아 마우스에서 1 차적인 갈색 및 백색 프레드포스세포의 동시 적인 격리를 위한 프로토콜을 기술합니다. 분리된 세포는 배양에서 재배되고 완전히 성숙한 백색과 갈색 지방세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 이 방법은 배양시 1차 지방세포의 유전적, 분자 및 기능적 특성화를 가능하게 한다.

초록

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삼각 세포 분화 및 기능의 근본적인 기계장치의 이해는 불멸의 백색 프레드포스세포 세포의 사용에서 크게 유익했습니다. 그러나 이러한 배양 된 세포주에는 한계가 있습니다. 그들은 지금 백색 지방 창고 안에 존재하는 것으로 알려져 있는 이질 성 지방 세포의 다양한 기능 스펙트럼을 완전히 포착하지 않습니다. 백색 지방 조직의 복잡성을 연구하기 위하여 보다 생리적으로 관련있는 모형을 제공하기 위하여는, 프로토콜은 신생아 마우스에서 1 차적인 백색과 갈색 선조의 동시 격리, 문화의 급속한 확장 및 시험관내의 분화를 성숙하고 완벽하게 기능성 있는 지방세포로 가능하게 하기 위하여 개발되고 최적화되었습니다. 신생아에서 1 차 세포를 분리의 주요 장점은, 오히려 성인 마우스보다, 지방 창고가 적극적으로 개발하고, 따라서, 확산 preadipocytes의 풍부한 소스입니다. 이 프로토콜을 사용하여 분리된 1차 전도체는 합류시 빠르게 분화되고 신생아 마우스에서 개발된 지방 패드의 외관을 정확하게 반영하는 시간적 창인 4-5일 후에 완전히 성숙해진다. 이 전략을 사용하여 준비된 1차 배양은 높은 재현성으로 확장및 연구될 수 있으며, 유전적 및 표현성 스크린에 적합하게 만들고 유전 마우스 모델의 세포 자율 적 인 세포 세포 표현형의 연구를 가능하게합니다. 이 프로토콜은 시험관 내 지방 조직의 복잡성을 연구하기 위해 간단하고 빠르며 저렴한 접근 방식을 제공합니다.

서론

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비만은 에너지 섭취와 에너지 지출 사이 만성 불균형에서 유래합니다. 비만이 발전함에 따라, 백색 지방세포는 마이크로 환경, 세포 사멸, 염증 및 인슐린 저항성 1에서저산소증을 초래하는 세포 크기에서 대규모 확장을 겪습니다. 기능 장애, 비대 증분 세포제대로 과잉 지질을 저장할 수 없습니다., 그들은 인슐린 행동을 약화 하는 다른 조직에 대신 축적2,3. 조직 간의 정상적인 지질 분할을 개선하고 복원하는 제제는 제2형 당뇨병과 같은 인슐린 저항성을 특징으로 하는 비만 관련 조건의 치료에 도움이 될 것으로 예상된다. 3T3-L1, F442A 및 10T 1/2와 같은 불멸의 세포주를 이용한 포피세포내의 표형 스크린은 아디포발생을 조절하고 항당뇨병특성4,5,6,7로프로 아디포겐 성 분자를 분리하는 유전적 요인을 식별하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 그러나 이러한 세포주들은 백색, 갈색, 베이지 및 독특한 특성을 가진 다른 지방 창고에 존재하는 세포 유형의 이질성을 완전히 반영하지 않으며, 모두 전신 항상성에 기여8,9,10. 또한, 배양된 세포주들은 종종 외부 자극에 대한 반응감소를 보여준다.

대조적으로, 1 차 적인 지방 세포의 문화는 생체 내 분포 발생의 복잡성을 보다 정확하게 재구성하고, 1 차 적인 지방세포는 강력한 기능적 반응을 보여줍니다. 1차 전도세포는 일반적으로 성인마우스11,12,13,14의지방 창고의 기질 혈관 분획으로부터 분리된다. 그러나, 성인 동물의 지방 창고는 주로 매우 느린 회전율15,16,17을갖는 완전히 성숙한 지방세포로 구성되어 있기 때문에, 이 접근법은 낮은 증식율로 제한된 양의 지방세포를 산출한다. 따라서, 신생아 마우스로부터 의 혈구세포의 분리는 체외에서 분화될 수 있는 급속하게 성장하는 세포의 대량을 얻는 것이 바람직하다. 여기서, 프로토콜은 칸 외18의 1차 갈색 지방세포와 함께 초기 작업에서 영감을 받아 시험관에서 완전히 기능적인 1차 성구로 확장및 분화될 수 있는 백색및 갈색 지방세포(그림1A)를효율적으로 분리한다. 신생아에서 1차 세포를 분리하는 장점은 성인 마우스와 는 달리, 지방 창고가 급속히 성장하고 있으며, 따라서 적극적으로 확산되는 preadipocytes17의풍부한 공급원이라는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하여 격리된 세포는 높은 증식 능력을 가지고 있어 배양의 급속한 확장을 가능하게 합니다. 또한 신생아 새끼의 프레드포스세포는 성인 전조자보다 더 높은 분화 잠재력을 나타내며, 이는 분화의 정도에서 잘 변이성을 감소시키고 따라서 재현성을 증가시킵니다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 스크립스 연구소와 위스콘신 대학의 모든 IACUC 지침을 따릅니다 - 의학 및 공중 보건의 매디슨 학교.

1. 지방 창고의 수집 및 소화 (1 일)

  1. 각 새끼에 대해 두 개의 1.5 mL 튜브를 준비 : 갈색 지방 조직 (BAT)에 대한 하나와 흰색 지방 조직 (WAT)에 대한 하나. 인산염 완충식식염(PBS) + 2x 절연 버퍼의 200 μL(123m NaCl) 250 μL 추가, 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl2,5 mM 포도당, 100 mM 4-(2-하이드록스테틸)-1-파이프라진-연쇄상 구균산(HEPES), 페니실린-스트렙토마이신, 4% 지방산 프리 소 세럼 제모) 각 튜브에. 솔루션을 멸균하고 얼음위에 보관하십시오.
  2. 새끼를 작은 챔버 (예 : 6 웰 플레이트의 우물)에 넣고 저체온이 될 때까지 얼음 위에 놓습니다. 새끼와 얼음 사이에 직접 접촉이 없는지 확인하십시오. 의식 상실을 보장하기 위해 팁으로 발을 찌르고 날카로운 가위를 사용하여 참수하여 새끼를 안락사시십시오.
    참고: 다른 유전자형으로 작업하는 경우 유전형에 대한 꼬리 생검(3mm 컷)을 수집하기 위해 추가 튜브를 준비합니다. 지장 현상이 즉시 수행되는 경우, 해부때까지 안락사 된 새끼를 얼음 위에 두어 지방 창고를 수집하십시오.
  3. 모든 창고를 소화하는 데 필요한 콜라게나아제의 양을 계산하고 계량합니다. 각 튜브에 2배 격리 버퍼에 15 mg/mL 콜라게나아제 타입 I의 50 μL을 추가합니다. 모든 조직이 수집될 때까지 격리 버퍼에서 콜라게나아제를 다시 중단하지 마십시오.
  4. 피하 와트를 수집하려면 강아지의 복부 주위의 피부를 자르고 (복막 파열을 방지) 부드럽게 다리 아래 피부를 당깁니다. 피부를 복용하지 않고, 조심스럽게 명확한 (P1 이하) 또는 흰색 (P2 이상), 사두근의 내부 또는 상단에 부착 된 얇고 긴 조직으로 나타납니다 지방 창고를 수집(도 1B). PBS의 지방 창고를 헹구고 PBS 250 μL + 2x 격리 버퍼의 200 μL을 포함하는 튜브 중 하나에 놓습니다. 얼음을 유지합니다.
    참고 : P0 과 P1 마우스는 최고의 수율을 제공합니다. P0-1 새끼에서 피하 WAT 창고는 거의 투명합니다. P2 마우스 이상에서, 창고는 이미 흰색으로 변하기 때문에 식별하기 쉽고, 완전히 성숙하고 지질이 가득한 흰색 지방 세포의 존재를 나타냅니다.
  5. 중간 형 BAT를 수집하려면 어깨 블레이드에서 머리를 통해 피부를 당깁니다. BAT를 들어 올려 - 견갑골 사이의 깊은 붉은 조직 - 조심스럽게 몸에서 분리하기 위해 주위에 절개를(그림 1B). 일관성과 색상을 확인합니다. PBS로 헹구십시오. PBS의 250 μL + 2x 절연 버퍼의 200 μL을 포함하는 다른 튜브에 배치; 얼음을 유지합니다.
    참고: P2 마우스에서 BAT를 수확할 때, BAT를 둘러싼 백색 지방 조직을 주의 깊게 제거하십시오. 그것은 어깨 블레이드 사이에 깊은 피부와 BAT 사이에 위치한 구도 세포의 얇고 부드러운, 흰색 시트로 구성되어 있습니다.
  6. 모든 창고를 채취하면 튜브 내부의 작은 가위를 사용하여 각 창고 (4-6 배)를 부드럽게 다진다.
  7. 콜라게나아제 타입 I를 2x 격리 버퍼의 적절한 부피로 재연하여 15 mg/mL에서 10배 스톡 용액을 얻습니다. 각 튜브에 10x 콜라게나아제의 50μL을 추가하여 모든 튜브에 콜라게나아제가 추가될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관합니다.
  8. 튜브를 빠르게 반전하여 혼합하고 온도 조절 믹서로 옮깁니다. 셰이커에 37°C에서 30분 동안 시료를 배양한다(효과적인 시료 혼합을 위한 1,400rpm 주파수).

2. 도금 지방세포 (1일차)

  1. 조직을 소화한 후 튜브를 얼음 위에 다시 놓습니다.
    참고: 이 단계에서부터 모든 작업은 생물 안전 캐비닛의 멸균 조건에서 수행됩니다.
  2. 100 μm 세포 여과기를 통해 소화된 조직을 새로운 50mL 튜브로 변형시십시오. WT 마우스로만 작업하거나 유전자형이 알려진 경우 관련, 해리된 BAT를 함께 풀; WAT에 대해 이 것을 반복합니다. 세포 수율을 최대화하기 위해 각 튜브를 1mL의 격리 매체(DMEM) + 20% 태아 소 혈청(FBS), 10mM HEPES, 1% 페니실린-스트렙토마이신)으로 헹구고 세포 스트레이너를 통해 필터링합니다. 알 수 없는 유전자형으로 작업하는 경우 2.4단계로 이동하십시오.
    참고: FBS는 지방 세포 증식과 분화 모두의 필수 결정요인입니다. 높은 성능과 로비 사이의 일관성을 보장하기 위해 FBS의 다른 많은 엄격하게 테스트합니다.
  3. 각 BAT 샘플에 대해 6웰 플레이트의 플레이트 2-3웰과 각 WAT 샘플에 대해 6웰 플레이트의 4-6웰을 플레이트에 희석하십시오. 예를 들어, 6개의 BAT와 6개의 WAT를 함께 풀로 묶은 경우 BAT 셀 서스펜션을 최대 24-36mL및 WAT 셀 서스펜션을 최대 48-72mL까지 희석시 희석시. 플레이트 2 mL의 셀 현탁액은 잘 한다.
  4. 알 수없는 유전자형을 가진 견본을 위해, 각 견본을 별도로 두십시오; 6웰 플레이트의 각 웰 위에 100 μm 셀 스트레이너를 놓고 우물당 하나의 샘플을 필터링합니다. 1.5mL의 절연 매체로 튜브를 헹굴하고 스트레이너를 통과하여 최종 볼륨을 잘 2mL로 구성합니다. 셀 스트레이너를 버리고 뚜껑을 접시에 놓고 접시를 인큐베이터로 옮습니다.
    참고: 우물의 배지는 부유혈액세포, 세포 파편 및 리시드 세포에서 지질때문에 탁탁을 해야 합니다.
  5. 도금 후 1-1.5 h, 흡인 매체 및 혈청없이 DMEM의 2 mL로 세척. 부드럽게 우물의 바닥에서 혈액 세포를 분리하기 위해 접시를 동요. 3 세세싱 후, 신선한 절연 배지의 2mL을 추가하고, 인큐베이터 (37 °C, 5 % CO2)에세포를 전송합니다.
    참고: 현미경으로 세포를 확인합니다. 부동 물질 (혈액 세포, 세포 파편)은 최소화해야합니다. 갈색 프레드포스세포는 작은 비반투명 세포로 나타나지만, 백색 프레드포스세포는 더 긴 형태를 나타내게 된다. 갈색과 흰색 프레드포스세포는 모두 접시에 단단히 부착되어야 합니다.

3. 지방낭문화의 확대(2일차부터 5일까지)

  1. 다음 날, 배지를 흡인시키고, 혈청 없이 DMEM2m로 세포를 세척하고, 격리 배지의 2mL를 다시 추가한다.
  2. 세포가 80-90%에 도달할 때까지 2일마다 3.1단계를 반복합니다.
    참고: 1차 갈색 지방세포의 경우 80-90%의 합류에 도달하는 데 4-5일이 걸릴 수 있습니다. 기본 백색 지방세포의 경우 일반적으로 2-3 일이 걸립니다. 일단 지방세포가 60%의 합류에 도달하면, 그들은 녹다운 또는 과발현 실험을 위해 바이러스 입자에 효율적으로 감염될 수 있습니다. 최대 8 시간 동안 적절한 바이러스 부하로 지방 세포를 감염시십시오. 감염 효율을 높이기 위해 양이온 폴리머를 사용하는 것은 종종 독성이 있고 감염된 지방 세포의 교포성 전위가 현저히 감소하기 때문에 권장되지 않습니다.
  3. 세포를 분할하려면 0.1% w/v 젤라틴의 멸균 용액을 사용하여 새로운 대상 플레이트를 코팅합니다(증류수에 용해되고 열을 사용하지 마십시오). 웰/접시의 바닥을 덮기 위해 충분한 볼륨을 사용합니다. 세포가 시드될 때까지 37°C에서 플레이트를 배양합니다(최소 10분).
    참고: 이 단계는 선택 사항입니다. 세포 배양 판의 코팅은 수율 또는 분화 잠재력에 영향을 미치지 않지만 분화 분화 세포의 유지 보수 및 처리를 실질적으로 단순화합니다.
  4. 세포가 하위 컨물수 밀도(85-95%)에 도달하면 배지를 흡인하고 PBS로 세척하고 트립신을 3분 동안 첨가하여 세포를 분리합니다. 격리 매체의 2.5배 트립신 볼륨을 추가하여 트립신 활동을 차단합니다. 세포 현탁액을 위아래로 피펫하여 세포 회복을 극대화하고 새로운 튜브로 이송합니다. 1mL의 절연 매체로 우물을 씻고 첫 번째 컬렉션에 추가합니다.
  5. 800-1200 × g에서5분 동안 세포를 원심분리하고, 수퍼나탄을 흡인시키고, 격리 배지의 3-5mL로 세포를 재연한다. 셀을 계산하고 원하는 최종 밀도로 희석합니다.
    참고: 예를 들어, 50,000-80,000 셀/mL(각각 6,12및 24웰 플레이트용 2.5, 1 및 0.5mL)은 72-96h 내에 완전히 팽창하는 우물을 초래합니다.
  6. 코팅 용액을 3.3 단계에서 흡인시키고 PBS로 과도한 젤라틴을 씻어냅니다. 세포를 시드하고 플레이트를 완전히 수축할 때까지 인큐베이터로 되돌려 보냅니다.

4. 흰색과 갈색 지방 세포의 분화 (일 7 - 12)

  1. preadipocytes가 컨실루물이 되면, 배지를 흡습하고, DMEM에서 10% FBS로 구성된 분화 매체로 대체하여 170nM 인슐린, 1 μM 덱사메타손, 및 0.5 mMM 3-이소부틸-1-메틸산틴을 함유한다. BAT 프레드포사이클을 분화하면 1nM 트리오도티로닌(T3)을 추가합니다. 분화의 0일째로 성포성 분화가 유도되는 날을 표시한다.
    참고: 흰색과 갈색 지방세포는 모두 합류시 자발적으로 구별할 수 있습니다. 그러나, 지방 세포 분화를 극대화하기 위해, 위에서 설명 한 전통적인 프로 아디포겐 칵테일 (BAT 프레드 포 사이클에 대한 T3 플러스)를 사용해야합니다.
  2. 48h(분화 2일째) 후, DMEM에서 10% FBS와 170nM 인슐린(BAT용 1nM T3)으로 구성된 유지보수 매체로 배지를 새로 고칩니다.
    참고: 2일째에 현미경아래 세포에 축적되는 작은 지질 방울은 표준 밝은 필드를 사용하여 관찰될 수 있다.
  3. 세포가 실험에 사용될 때까지 2일마다 한 번씩 4.2단계를 반복합니다.
    참고: 4일 또는 5일째에 대부분의 세포가 지질이 가득 한 것처럼 보입니다. 말기 분화 형구는 배양에 더 오래 보관하거나 실험을 위해이 단계에서 사용할 수 있습니다.

5. 바이오 에너지 실험을 위한 재도금

참고: 96웰 형식의 성숙한 지방세포에서 생체 에너지 연구를 수행하려는 의도가 있다면 다음 단계를 수행해야 합니다. 이상적으로, 방금 완전히 분화 된 세포 (4 일 또는 5 일)를 사용해야합니다. 아래에 설명된 절차는 6웰 플레이트의 1웰에서 시작됩니다.

  1. 트립신 소화 전에 96웰 플레이트코팅을 준비하십시오. 각 웰에 0.1% 젤라틴의 50 μL을 추가합니다. 세포가 씨앗을 먹을 준비가 될 때까지 조직 배양 인큐베이터에 접시를 둡니다.
  2. 4일 또는 5일째에, 매체를 흡인하고, PBS 1mL로 세척하고, 0.25% 트립신-에틸렌디아민 테트라아세산(6웰 플레이트 1웰)의 300 μL을 추가한다. 트립신이 우물바닥을 완전히 덮도록 접시를 부드럽게 기울입니다. 실온에서 2분 동안 배양하십시오. 700 μL의 유지 보수 매체로 트립신의 작용을 차단하고, 파이펫을 위아래로 사용하여 세포 회복을 극대화하고, 세포 현탁액을 새로운 1.5 mL 튜브로 이송한다.
  3. 1200 × g에서 세포를 원심분리하여 5분 동안 분리합니다. 상체를 제거하고, 유지 보수 매체의 1 mL에서 펠릿을 재일시 중단하고, 세포를 계산한다.
    참고: 6웰 플레이트 의 우물 중 하나는 약 1.5-180 만 개의 세포를 산출해야합니다.
  4. 갈색 반포세포에 대한 60,000 ~ 80,000 세포/mL의 최종 농도를 가지도록 세포를 희석시키고 백색 선포세포를 위한 100,000 ~120,000세포/mL를 희석시. 젤라틴 코팅 96웰 플레이트에서 잘 당 셀 서스펜션의 플레이트 100 μL.
    참고: 6웰 플레이트 중 한 웰은 최대 2개의 96웰 플레이트에 충분한 셀을 제공합니다. 생체 에너지 실험의 경우, 저밀도 도금(30-40% 합류)이 산소 소비의 정확한 측정을 가능하게 하고 분석 중에 우물에서 산소 고갈을 피할 수 있도록 필요하다.
  5. 세포가 적어도 48 h의 플레이트 바닥에 부착되도록 합니다. 세포가 48시간 이상 플레이트에 보관되면 2일 후에 배지를 새로 고칩니다.
  6. 분석 의 날에, 매체를 흡인하고, 분석 매체로 대체합니다. 비CO2-제어인큐베이터에서 37°C에서 1h의 배양하고 제조업체의 지침에 따라 분석작업을 수행한다.

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결과

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프로토콜의 섹션 1은 표준 광 현미경의 밑에 보이는 세포의 이기종 정지를 산출할 것입니다. 세포 여과기 (섹션 2)와 소화 된 조직의 필터링소화 되지 않은 조직을 제거 합니다. 그러나 일부 세포 이물질, 혈액 세포 및 성숙한 지방세포가 통과합니다(그림1C). 부드러운 세차 1 도금 후 1 h 는 지방 세포가 우물의 바닥에 빠르게 부착됨에 따라 비 관련이없는 세포를 제거합니다(도 1C). 섹션 3에서, 세포 전구체는 실험 계획에 필요한 세포의 수를 얻기 위해 확장된다. 신생아 새끼로부터 분리된 백색과 갈색 프레드포세포는 모두 높은 증식 능력을 가지고 있지만, 백색 지방세포의 수율은 일반적으로 창고당 갈색 프레드포사이클의 2배이다(그림2A). 따라서 동기화된 배양을 원하는 경우 백색 프레드포사이클의 시작 밀도를 그에...

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토론

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지방 조직은 전신 인슐린 감도 및 포도당 항상성(20)에매우 중요합니다. 비만 연결 한 십분 장애는 타입-2 당뇨병의 개시와 단단히 연관됩니다. 따라서, 지방 조직의 기본 생물학 및 생리학의 더 큰 이해는 신진 대사 무질서를 위한 새로운 처리의 디자인을 가능하게 할 수 있습니다. 지방창고(21,22)로부터분리된 성숙한 지방세포의 직접 기능및 전사 분석에 대한 보완으로서, 배양된 1차 분포는 지방조직 병원생리학의 많은 측면을 재구성하는 것으로 나타났으며, 여기에는 아디포핀의 분비, 염증성 자극에 대한 반응으로 인슐린에 대한 저항,24. 이전 프로토콜은 성인 마우스(11)

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 스페인 마드리드의 센트로 나시오날 드 바이오테날로지아의 크리스티나 고디오, 스크립스 연구소의 마리 간트너, 라 호야, 그리고 존스 홉킨스 대학, 볼티모어의 아나스타샤 크랄리(Anastasia Kralli)에게 감사드리며, 칸 외18의초기 작업을 기반으로 이 프로토콜을 최적화하는 데 도움을 주었습니다. 이 작품은 NIH 보조금 DK114785 및 DK121196에 의해 E.S.에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Sigma-AldrichI7018
6-웰 플레이트Corning353046
AdipoRed (Nile Red)LonzaPT-7009
Antimycin ASigma-AldrichA8674
BenchMark 태아 소 혈청Gemini Bioproducts LLC100-106
CaCl2Sigma-AldrichC4901
세포 여과기Fisher Scientific22363549
콜라겐분해효소, 유형 1   Worthington Biochemical CorpLS004196
ddH2OSigma-Aldrich6442
DexamethasoneSigma-AldrichD4902
DMEMSigma-AldrichD5030생물 에너지 연구용
DMEM, 고포도당, GlutamaxGibco10569010
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘없음Gibco14190144
지방산 무함유 BSA시그마-알드리치A8806
FCCP시그마-알드리치C2920
젤라틴시그마-알드리치G1890
포도시그마-알드리치G7021
HEPES시그마-알드리치H3375
Hoechst 33342InvitrogenH1399
인슐린시그마-알드리치I6634
KCl시그마-알드리치P9333
NaCl시그마-알드리치S7653
노르에피네프린케이맨 화학16673
올리고마이신시그마-알드리치75351
펜/스트렙깁코15140122
RosiglitazoneSigma-AldrichR2408
RotenoneSigma-Aldrich557368
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent Technologies102416-100생물 에너지 연구를 위한
수술용 겸자ROBOZ 수술 기구 CORS-5158
수술용 가위ROBOZ 수술 기구 CORS-5880
ThermoMixerEppendorfT1317
트리요오드티로닌 (T3)Sigma-Aldrich642511
당

참고문헌

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