이 프로토콜은 강력한 3D 이미징 기술인 직렬 블록-페이스 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)를 사용하는 일상적인 방법을 간략하게 설명합니다. SBF-SEM의 성공적인 적용은 적절한 고정 및 조직 염색 기술뿐만 아니라 이미징 설정을 신중하게 고려합니다. 이 프로토콜에는 이 프로세스 전체에 대한 실용적인 고려 사항이 포함되어 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)는 수백~수천 개의 연속 등록 초구조 이미지를 수집하여 조직 미세 해부학의 전례 없는 3차원 뷰를 제공합니다. SBF-SEM은 최근 몇 년 동안 사용이 기하급수적으로 증가하는 반면, 적절한 조직 준비 및 이미징 매개 변수와 같은 기술적 측면은 이 이미징 양식의 성공을 위해 가장 중요합니다. 이 이미징 시스템은 장치의 자동화된 특성의 이점을 통해 이미징 프로세스 중에 현미경을 방치하고 하루에 수백 개의 이미지를 자동화하여 수집할 수 있습니다. 그러나, 적절 한 조직 준비 없이 세포 울트라 구조 잘못 되 거나 오해의 소지가 결론 그려질 수 있습니다 같은 방식으로 변경할 수 있습니다. 또한 수지 임베디드 생물학적 샘플의 블록 페이스를 스캔하여 이미지가 생성되며, 이는 종종 해결해야 할 과제와 고려 사항을 제시합니다. "조직 충전"으로 알려진 이미징 중 블록 내의 전자가 축적되면 대비가 상실되고 세포 구조를 감상할 수 없습니다. 더욱이, 전자 빔 강도/전압을 증가하거나 빔 스캐닝 속도가 감소하면 이미지 해상도를 높일 수 있지만, 이는 또한 수지 블록을 손상시키고 이미징 시리즈에서 후속 이미지를 왜곡하는 불행한 부작용을 가질 수 있다. 여기서 우리는 세포 초구조를 보존하고 조직 충전을 감소시키는 생물학적 조직 샘플의 준비를 위한 일상적인 프로토콜을 제시합니다. 또한 티슈 블록에 최소한의 손상을 입히면서 고품질 의 시리얼 이미지를 빠르게 획득하기 위한 이미징 고려 사항을 제공합니다.
서론
직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 (SBF-SEM)는 1981 년 레이튼에 의해 처음 설명되었으며 수지에 내장 된 조직의 얇은 섹션을 절단하고 이미지 할 수있는 내장 된 마이크로 토메로 보강 된 스캐닝 전자 현미경을 만들었습니다. 불행하게도, 기술적 제한은 생물학적 조직과 같은 비전도성 샘플이 허용 할 수없는 수준의 충전 (조직 샘플 내의 전자 축적)을 축적함에 따라 전도성 샘플에 의한 사용을제한하였다. 증발된 탄소 감소 조직 충전으로 컷 사이에 블록 페이스를 코팅하는 동안, 이 크게 증가된 이미징 수집 시간과 이미지 저장은 당시 컴퓨터 기술이 장치에 의해 생성된 큰 파일 크기를 관리하기에 충분하지 못했기 때문에 문제가 남아 있었다. 이 방법론은 2004년 덴크와 호르스트만이 가변 압력 챔버2를장착한 SBF-SEM을 사용하여 재검토되었다. 이를 통해 시료 내의 충전을 줄이는 이미징 챔버에 수증기를 도입하여 이미지 해상도의 손실에도 불구하고 비전도성 시료의 이미징을 실현할 수 있었습니다. 조직 제제 및 이미징 방법의 추가 개선은 이제 높은 진공을 사용하여 이미징을 허용하고, SBF-SEM 이미징은 더 이상 충전3,
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프로토콜
모든 동물은 비전과 안과 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 성명서와 휴스턴 대학 의 안과 동물 취급 지침에 따라 연구 협회에 설명 된 지침에 따라 처리되었습니다. 모든 동물 절차는 처리된 기관에 의해 승인되었습니다: 마우스, 쥐, 토끼, 기니 피그 및 비인간 영장류 절차는 휴스턴 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인되었습니다, 제브라피시 절차는 DePauw 대학 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되고, 돼지 절차는 의학 동물 관리 및 사용위원회의 베일러 대학에 의해 승인되었습니다. 모든 인간 조직은 인간 조직에 대한 연구에 관한 헬싱키 선언에 따라 처리되었으며 적절한 제도적 검토 보드 승인을 획득하였다.
1. 조직 처리
- ddH2O.에 나트륨 코코디레이트 분말을 혼합하여 0.4M 나트륨 코코디레이트 버퍼의 스톡 용액을 준비하였으며, pH는 용액을 7.3으로 조절한다. 이 버퍼는 고정(1.3단계에서 아래에 설명된 조성), 세척 완충제, 오스뮴 및 페로시아니드 용액을 만드는 데 사용됩니다.
참고: 관류 고정은 종종 SBF-SEM 연구에 대 한 고정의 가장 좋은 방법, 고정 신속 하 게 발생 하 고 몸 전체에. 학습 설계 내에서 관류 고정이 불가능한 경우 1.3단계로 건너뜁니다. ....
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결과
마우스 각막
이 프로토콜은 마우스 각막에 광범위하게 적용되었습니다. SBF-SEM 이미징을 사용하여 엘라스틴이 없는 마이크로피브릴 번들(EFMBs)의 네트워크를 사용하여 성인용 마우스 각막 내에 존재하는 것으로 나타났다. 이전에는 이 네트워크가 배아와 조기 산후 발달 중에만 존재한다고 믿었습니다. SBF-SEM은 각막 전체에 걸쳐 광범위한 EFMB 네트워크를 공개했으며, 개별 섬유는 단면에서 측정할 때 직경이 100-200 nm인 것으로 나타났습니다. 또한 이 EFMB 네트워크는 각질 세포와 밀접하게 연관된 섬유와 함께 각질 세포표면(그림 5)의얕은 질 내로 구성된 것으로 나타났습니다. 성인 각막에서 EFMB 섬유의 발견은 면역금 표지 전송 전자 현미경 검사법 (TEM), 형광 및 공초점 연구를 주도하여 이네트워크(23)의특성을 더욱 이해하였다.
이.......
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토론
이 방법 논문의 목적은 우리의 실험실이 안정적으로 고해상도 직렬 전자 현미경 이미지를 캡처 할 수 있도록 조직 준비 및 이미징 방법론을 강조하고, SBF-SEM 이미징을 수행 할 때 발생할 수있는 잠재적 인 함정뿐만 아니라이 결과로 이어지는 중요한 단계를 지적하는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하여 성공하려면 조직의 적절한 고정, 시료에 중금속의 함침, 충전을 줄이기 위한 포함 수지수정, 이미지를 수집하는 데 사용되는 현미경 및 이미징 설정에 대한 이해가 필요합니다. 격언, "품질, 품질 아웃"SBF-SEM 이미징에 적합한 공리입니다. SBF-SEM의 목표는 종종 초구조적 세부 사항의 감사 또는 정량화이기 때문에 조직 왜곡이 발생하지 않도록 고정 전략에 추가주의를 기울여야 합니다. 조직이 시료 준비의 어느 시점에서왜곡되는 경우 (즉, 팽창, 수축, 또는 세포 형태의 중단을 겪는다), 다음 조직 재구성 및 양자화는 정확한 데이터를 산출하지 않습니다. 또한 잘못된 이미징 설정을 사용하면 SBF-SEM 이미징이 파괴적인 과정이기 때문에.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
샘 핸런 박사, 에블린 브라운, 마가렛 곤도 박사의 뛰어난 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (NIH) R01 EY-018239 및 P30 EY007551 (국립 안과 연구소)에 의해 부분적으로 지원되었으며, 부분적으로 NIH 1R15 HD084262-01 (국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소)에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1/16 x 3/8 알루미늄 리벳 | 산업용 리벳 및 패스너 (주) | 6N37RFLAP/1100 | 시편 핀으로 사용됩니다. |
| 2.5mm 일자 드라이버 | Wiha 품질 도구 | 27225 | |
| 아세톤 | 전자 현미경 과학 | RT 10000 | 은 페인트를 희석하는 데 사용됩니다. |
| 아스파르트산 | Sigma-Aldrich | A8949 | |
| 염화칼슘 | FisherScientific | C79-500 | |
| 전도성 은 페인트 | Ted Pella | 16062 | |
| Denton Desk-II 진공 스퍼터링 장치 표준 금박 대상이 장착된 | Denton Vacuum | N/A | 이것은 저자가 사용하는 금 스퍼터링 장치이며 대안이 허용됩니다. |
| 양날 면도기 | Fisher Scientific | 50-949-411 | |
| Embed 812 | 전자 현미경 과학 | 14120 | |
| Gatan 3View2 Tescan Mira3 전계 방출 SEM | Gatan & 테스캔 | N/A | 저자가 사용하는 SBF-SEM 장치이며, 대체 장치도 사용할 수 있습니다. |
| 유리 껍질 바이알, 0.5 DRAM (1.8 ml) | 전자 현미경 과학 | 72630-05 | |
| 글루테알데히드 | 전자 현미경 과학 | 16320 | |
| 고릴라 슈퍼 글루 - 영향 터프 | NA | NA 텍스트에서 시아노아크릴레이트 접착제로 언급됨. | |
| Ketjen Black | HM Royal | EC-600JD | 텍스트에서 카본 블랙으로 언급됩니다. |
| KOH | FisherScientific | 18-605-593 | |
| 납 질산 | Fisher Scientific | L62-100 | |
| 마이크로파 | Pelco | BioWave Pro | 이것은 저자가 사용하는 마이크로파이며, 대체품은 허용됩니다. |
| 오스뮴 테트록사이드 | Sigma-Aldrich | 201030 | |
| 칼륨 페로시아나이드 | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| 실리콘 임베딩 몰드 | Ted Pella | 10504 | |
| 소듐 카코딜레이트 트리하이드레이트 | 전자 현미경 과학 | 12300 | |
| Samco Transfer Pipette | ThermoFisher Scientific | 202 | 표본 핀을 만드는 데 사용됩니다. 저장 튜브. |
| 스위스 패턴 바늘 파일 | 전자 현미경 과학 | 62115 | |
| 티오 카르 히드 라지드 | 시그마 - 알드리치 | 223220 | |
| 우라닐 아세테이 | Polysciences, Inc. | 21447-25 | |
| Reconstruction Software | |||
| Amira Software | Thermo Scientific | N/A | 그림 5-7 및 9에 있는 재구성을 만드는 데 사용됩니다. |
| 피지(피지는 Just ImageJ) | ImageJ.net | N/A | TrakEM2를 피지에 추가하여 수동 세분화를 지원할 수 있습니다. |
| Microscopy Image Browser (MIB) | University of Helsinki, Institute of Biotechnology | N/A | |
| Reconstuct Software | Neural Systems Lab | 해당 없음 | |
| SuRVoS 워크벤치 | Diamond Light Source & 노팅엄 대학교 | N/A | |
| SyGlass | IstoVisio, Inc. | N/A | 가상 현실 및 히스토그램 기반 재구성 방법에서 재구성을 허용합니다. |
참고문헌
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscop....
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재인쇄 및 허가
