Method Article

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

DOI:

10.3791/62068

⸱

July 1st, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology, 2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Shenzhen; Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.

Abstract

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면 볼웜헬 리코파 아미게라는 세계에서 가장 파괴적인 해충 중 하나입니다. 분자 유전학의 조합, 생리학, 기능적 유전체학, 행동 연구는 H. armigera 레피드 옵테라 녹투이대에서 모델 종했다. 다른 유전자 간의 생체 내 기능 및 상호 작용을 연구하기 위해 정기적으로 간격이 짧은 palindromic 반복 (CRISPR)/ 관련 단백질 9 (Cas9) 게놈 편집 기술은 기능적 게놈 연구를 수행하는 데 사용되는 편리하고 효과적인 방법입니다. 이 연구에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 H. armigera 에서 유전자 녹아웃을 완료하는 단계별 체계적인 방법을 제공합니다. 가이드 RNA(gRNA)의 설계 및 합성은 자세히 설명되어 있다. 이어서, 가이드 RNA(gRNA) 생성, 배아 수집, 미세주입, 곤충 사육 및 돌연변이 검출을 위한 유전자 특이적 프라이머 설계로 구성된 후속 단계를 요약한다. 마지막으로, 유전자 편집의 효율성을 개선하기 위해 문제 해결 조언과 메모가 제공됩니다. 우리의 방법은 H. 아미게라 뿐만 아니라 다른 Lepidopteran 나방에 CRISPR / Cas9 게놈 편집의 적용을위한 참조 역할을 할 것입니다.

Introduction

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게놈 편집 기술의 응용 프로그램은 다양한 종에서 표적 유전자 돌연변이를 달성하기 위한 효율적인 도구를 제공합니다. 클러스터된 단락형 짧은 palindromic 반복(CRISPR)/관련 단백질 9(Cas9) 시스템의 출현은 게놈1을 조작하는 새로운 방법을 제공한다. CRISPR/Cas9 시스템은 가이드 RNA(gRNA)와 Cas9 endonuclease2,3로 구성되며, gRNA는 두 부분으로 더 나눌 수 있으며, 표적 보완 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스 활성화 crRNA(tracrRNA)로 나뉩니다. gRNA는 Cas9 엔도누클레스와 통합하고 리보뉴클레오단백질(RNP)을 형성한다. gRNA를 사용하면 Cas9 엔도누벨리스는 기본 보완을 통해 게놈의 특정 부위로 향할 수 있습니다. Cas9의 RuvC 및 HNH 도메인은 프로토스페서 인접 모티프(PAM) 서열 전에 게놈 3기의 표적 부위를 크리브하고 이중 가닥 브레이크(DSB)를 생성한다. DNA 분열은 다음 두 가지 메커니즘을 통해 복구 할 수 있습니다, 비 동종 종조 (NHEJ) 또는 homology 지향 수리 (HDR)4. DSB의 복구는....

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Protocol

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1. 유전자 특정 프라이머의 설계 및 sgRNA 의 준비

  1. PCR 증폭 및 시퀀싱 분석을 통해 관심 유전자에서 보존된 게놈 영역을 확인합니다. 표적 유전자를 H. 아미게라 의 게놈 DNA로부터 증폭시키고 엑손과 인트론을 구별한다.
    참고: 오프 타겟 유전자 편집을 피하기 위해 가이드 사이트의 서열 특이성이 필요합니다. 엑슨에 있는 가능한 가이드 사이트를 검색하는 것은 유전자의 5' UTR에 가깝습니다. 그런 다음 유전자가 완전히 작동하지 않는지 확인하는 것이 중요합니다. sgRNA의 준비를 위한 유동 경로에 대한 요약은 도 1에 도시된다.
  2. sgRNA 표적을 선택합니다. CRISPR 온라인 웹 사이트 CRISPOR (버전 4.97)를 사용하여 (버전 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py)를 사용하여 유전자의 5'UTR에 가까운 exons에서 가능한 가이드 사이트를 검색하십시오. 엑슨 서열을 텍스트 상자에 입력하고 목표 게놈을 헬리코파 아미게라 (Harm_1.0)로 선택한다. "20 bp-NGG"의 PROtospacer 인접 모티브 (PAM) 옵션을 선택하고 웹 사이트의 사용자 매뉴얼에 따라 기본 매개 변수에 다른 설정을 ....

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Results

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이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 H. armigera 의 유전자 녹아웃 라인을 얻기 위한 상세한 단계를 제공합니다. 이 프로토콜에 의해 얻은 대표적인 결과는 gDNA 선택, 배아 수집 및 주입, 곤충 사육 및 돌연변이 검출을 위해 요약됩니다.

이 연구에서는, 관심있는 우리의 유전자의 표적 사이트는 두 번째 exon에 위치했다 (그림 2A). 본 사이트는 매우 보존되었고, 합성 된 sgRNA의 표적 대역 단편은 아가로즈 젤 전기 포진 (도 2B, C, D)을 사용하여 확인되었다.

남성과 .......

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Discussion

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CRISPR/Cas9 시스템의 적용은 다양한 유전자 간의 유전자 기능 및 상호 작용의 분석을 위한 강력한 기술 지원을 제공하고 있습니다. 우리가 여기에서 제시하는 상세한 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 통해 H. armigera 에 있는 homozygote 돌연변이의 생성을 보여줍니다. 이 믿을 수 있는 절차는 H. armigera에 있는 지시한 유전자 돌연변이 발생을 위한 간단한 쪽을 제공합니다.

CRISPR 대상 사이트의 선택은 돌연변이 발생 효율37에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 온라인 웹 사이트 CRISPOR의 여러 결과를 비교하고 분석하여 적절한 대상 사이트를 얻었습니다. 실리코에서 gRNA 예측은 몇 가지 장점을 제시합니다. 첫째, 그들은 오프 타겟 효과를 최소화하기 위해 sgRNA를 설계 할 때 H. armigera 의 전체 게놈을 분석합니다. 위에.......

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Disclosures

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저자는 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31725023, GW에 31861133019, CY에 31171912)에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2kb DNA ladderTransGen BiotechBM101
Capillary GlassWorld Precision Instrucments504949
Eppendorf FemtoJet 4i MicroinjectorEppendorf CorporateE5252000021
프로토콜에서 "모세관 유리"라고 합니다.Eppendorf InjectMan 4 micromanipulatorEppendorfCorporate 5192000051
Eppendorf Microloader 피펫 팁Eppendorf CorporateG2835241
GeneArt Precision gRNA Synthesis KitThermo Fisher ScientificA29377
현미경 슬라이드세일 브랜드7105
Olympus현미경 Olympus CorporationSZX16
돌연변이 검출에 사용되는Takara Biomedical TechnologyR040
Sutter Micropipette PullerSutter Instrument CompanyP-1000
TIANamp 게놈 DNA 키트TIANGEN CorporateDP304-03
TrueCut Cas9 Protein v2Thermo Fisher ScientificA36499
양면 테이프 Minnesota Mining and Manufacturing Corporation 665

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).

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CRISPR Cas9 EditingEmbryo MicroinjectionHelicoverpa ArmigeraKnockout Mutant IdentificationGuide RNA DesignGenome EditingMutant DetectionGene Function AnalysisAgarose Gel ElectrophoresisGenomic DNA Extraction

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