이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

담즙 덕트 TNBS 주입을 통한 만성 췌장염을 위한 마우스 모델

3.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62080

⸱

2021년 2월 28일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Ralph H. Johnson Veterans Affairs Medical Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

만성 췌장염 (CP)은 췌장의 염증과 섬유증을 특징으로하는 질병이며 종종 난치성 복통과 관련이 있습니다. 이 문서는 2,4,6 -trinitrobenzene 설포닉 산 (TNBS)로 담관 주입을 통해 CP의 마우스 모델을 생성하는 기술을 정제에 초점을 맞추고 있습니다.

초록

만성 췌장염 (CP)은 췌장 염증 및 섬유증, 선 위축, 복통 및 기타 증상을 포함하는 복잡한 질병입니다. 몇몇 설치류 모형은 담즙 덕트 2,4,6 -trinitrobenzene 설포닉산 (TNBS) 주입 모형이 CP에서 보인 신경병성 고통의 특징을 복제하는 CP를 공부하기 위하여 개발되었습니다. 그러나, 마우스에 담관 약물 주입기술적으로 도전. 이 프로토콜은 CP 마우스 모델의 생성을 위한 담관 TNBS 주입의 절차를 보여줍니다. TNBS는 십이지장에서 바터의 암풀라를 통해 췌장에 주입되었다. 이 프로토콜은 수술 중 약물 볼륨, 수술 기술 및 약물 처리를 최적화했습니다. TNBS 처리된 마우스는 체중 감소, 통증 관련 행동의 변화 및 비정상적인 췌장 형태에 의해 반영된 CP의 특징을 보여주었습니다. 이러한 개선으로, TNBS 주입과 관련 된 사망률은 최소한의. 이 절차는 췌장 질병 모형을 생성에 있는 중요할 뿐 아니라 현지 췌장 약 납품에 또한 유용합니다.

서론

만성 췌장염(CP)은 췌장, 섬유증, 복통, 및 외신 및 내분비 기능 모두의 최종 상실을 특징으로 하는 만성 염증성질환이다. 현재 의학적 및 외과 적 치료는 치료되지 않지만 질병의 결과인 증상을 완화하기 위해 수행됩니다 : 내화복통증, 내분비 및 외신 기능 장애. 따라서 보다 효과적인 치료가 절실히 필요하며2. 동물 모델은 질병의 더 나은 이해를 개발하고 잠재적 인 치료 3을 조사하기위한 필수 도구를제공합니다. CP를 위한 여러 마우스 모델이 개발되었으며, 그 중 세룰린 및/또는 알코올 모델이 일반적으로 사용됩니다. 세룰린, 췌장 분비 자극 올리고펩타이드, 췌장 위축, 섬유증, 그 외4를특징으로 하는 CP 모델을 재보적으로 유도하는 것으로 나타났다. 또 다른 일반적인 모델은 L-아르기닌의 연쇄 주사를 사용 하 여, 인간 환자에서 관찰 하는 것과 유사한 외크리인 부족을 생산하는 5. CP는 또한 췌장 덕트 결찰뿐만 아니라 전체 또는 부분 췌장 덕트 결찰에 의해 유도될 수 있을 뿐만 아니라췌장덕트 고혈압6,7을유도할 수 있다. CP에 사용할 수있는 다양한 동물 모델에도 불구하고, 이러한 모델 중 어느 것도 CP 환자에 의해 경험된 복통을 효과적으로재현하지 않습니다 8.

이전 연구는 2,4,6 -trinitrobenzene 설포닉 산 (TNBS)의 국소 췌장 주사가 CP 환자에 의해 경험 지속적인 통증을 복제것으로나타났다9,10,11. TNBS 처리마우스는 복부 과민반응을 입증하고 통증 관련 행동뿐만 아니라 고통스러운 자극에 대한 "일반화 과민성"을 입증, CP 환자에서 관찰된현상(10). Cp 통증을 정확하게 모방하는 것 외에도, TNBS 모델은 섬유증, 단핵세포 침투, 지방조직10,12를가진 아시나르 세포의 교체와 같은 인간 상태의 다른 병리학적 특징을 복제한다. 그러나, 담관을 통한 TNBS 주입은 죽음을 일으킬 수 있는 마우스에 있는 기술적으로 도전적인 절차입니다. 우리의 지식에, 담관 주입이 수행되는 방법을 보여주는 시각적 프로토콜이 없습니다. 이 문서에서는 CP 마우스 모델을 생성하기 위해 TNBS의 담즙 유도 주입 절차를 시연합니다. 이 절차는 CP 및 기타 췌장 질환의 연구를 위한 귀중한 동물 모델을 생성하는 데 도움이 되며 다른 물질(예를 들어, 바이러스, 세포)을췌장(13)에주입하는 데 사용될 수 있다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 절차는 사우스 캐롤라이나 의과 대학과 랄프 H. 존슨 의료 센터에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인으로 실시되었다. C57BL/6J 남성 마우스 사이 8-10 나이의 주 이 연구에서 사용 되었다. 마우스는 음식과 물에 대한 광고 리비툼액세스를 통해 표준 12 빛 / 12 어두운 주기 아래에 보관되었다.

1. 주입을위한 TNBS 솔루션의 준비

  1. 0.9% 식염수에 10% 에탄올을 준비합니다. 10%의에탄올에 7.5 μL의 TNBS를 추가하여 최종 농도7.5mMM에 10%에 10%에 이탄올에 10%에 스탁 스톡 TNBS(재료표 참조)를 용해한다.
    주의: TNBS는 화학적 위험을 초래합니다. 연기 후드 내부의 솔루션을 준비하고 장갑, 고글 및 실험실 코트와 같은 개인 보호 장비를 사용하여 TNBS와의 직접적인 접촉을 방지하십시오.
  2. 31 게이지 바늘을 가진 인슐린 주사기에 0.75% TNBS 용액의 50 μL을 적재합니다. 식염수에 10% 에탄올의 50 μL을 차량 제어와 동일한 크기의 주사기에 적재합니다. 주사기를 얼음 위에 놓고 필요할 때까지 빛으로부터 보호하십시오.

2. 마우스 준비 및 수술

  1. 복부 외과 부위에서 모발을 면도합니다.
  2. 수술 전 진통제(예: 부프레노르핀 0.1 mg/kg i.p.)의 선제투여량을 1회 주입한다.
  3. 전신 마취 하에서 마우스를 1.5-2% 이소플루란과 산소 1L/분으로 유도하고 유지합니다. 발가락을 꼬집고 반사의 부족을 위해 동물을 관찰하여 마취를 확인합니다.
  4. 수술 중에 가열 된 수술 패드에 마우스를 놓습니다. 마우스가 마취 하에 있을 때 각 눈에 수의 연고를 적용합니다.
  5. 수술 부위를 2% 요오드로 3배 닦아서 수술 부위를 소독하고, 그 다음으로 70%의알코올(재료표)이 뒤따릅니다.
  6. 0.5-1cm 절개를 생성하기 위해 마이크로 가위로 복강경 절제술을 수행합니다.
  7. 십이지장(duodenum)을 부드럽게 노출시키고 면봉(재료표)을 사용하여 일반적인 담관덕을찾습니다.
  8. TNBS 또는 차량솔루션이간 및 담낭으로 의 흐름을 방지하기 위해 근해 공통 덕트 위에 직선 마이크로 헤모 클립(재료 표)을 배치합니다(그림1A,B).
  9. 십이지장을 부드럽게 노출시키고 바터유두를 통해 췌장 덕트에 바늘을 삽입합니다.
  10. 바늘이 덕트 내부에 들어가면 바늘을 둘러싼 십이지장위에곡선 마이크로 헤모클립(재료 표)을배치하여 바늘을 제자리에 고정시키고 주입된 용액이 십이지장으로 유입되는 것을 방지합니다.
  11. 1분 동안 점차적으로 용액(TNBS 또는 차량)을 췌장 덕트에 주입합니다.
    참고: TNBS는 1분 이상 천천히 주입되어야 하며 췌장이 인슐린 주사기와 5/16 인치 및 31G 바늘로 침투할 때 주입 속도를 쉽게 제어할 수 있습니다. 담관이 찌는 것을 피하기 위해 가능한 한 안정적으로 손을 유지하십시오. TNBS가 성공적으로 주입되면 췌장 내부에 노란색이 표시될 수 있습니다.
  12. 주입 후 간 근처의 마이크로 클램프를 조심스럽게 제거한 다음 바늘과 십이지장에서 마이크로 클램프를 제거합니다.
  13. 십이지덴을 원래 위치로 조심스럽게 되돌려 놓습니다.
  14. 0.5mL의 따뜻한 멸균 식염수(36-37°C)를 폐점 전에 복강에 두고 십이지장상이 원래 위치로 복귀하고 연골 회복을 돕도록 돕습니다.
  15. 5-0 스티치로 연속 봉합사를 사용하여 근육 층의 절개를 닫습니다. 4-0 스티치로 중단 된 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다.
  16. 마취에서 복구 할 수 있도록 가열 패드에 쥐가 포함 된 케이지를 놓습니다.
  17. 쥐가 따뜻하고 자발적인 운동을 할 수 있는지 확인한 후 보류실로 돌려보내게 됩니다.
  18. 진통제 (예를 들어, buprenorphine 0.1 mg/kg i.p.) 매 12 시간 및 수술 후 48 h에 대 한 보충 열을 제공 하 고 계속.

3. 마우스 동작 모니터링

  1. 수술 후 7일째에 봉합사를 제거하십시오.
  2. 수술 후 첫 주 동안 매일 마우스 건강과 행동을 모니터링하십시오. 발성, 구부러진 자세 또는 감소된 운동과 같은 고통의 징후를 조심하십시오. 격일로 체중을 측정합니다.
  3. 본 프레이 모노필라멘트(VFFs)를 사용하여 이전에 복부 기계적 과민증을 측정하고,9,14에설명된 바와 같이 수술 후2,3주.
    1. 1-2s마다 상부 복부 부위10x에 승천 순서에 다른 적용 된 힘의 VFF를 적용하십시오. 복부의 인상, 철회 또는 핥기 (철수 응답)를 긍정적 인 응답으로 고려하십시오.
    2. 긍정적인 반응이 관찰되지 않으면 더 강한 자극을 적용하고, 긍정적인 반응이 관찰되면 약한 자극을 적용한다. 인출 임계값은 마우스가 시간의 50%를 응답하는 힘입니다.

4. 췌장 조직의 수집 및 조직학적 분석

  1. 자궁 경부 탈구에 의해 마취하에 마우스를 희생하고, 조심스럽게 창자 및 기타 기관에서 췌장을 해부.
  2. 췌장을 파라핀에 24시간 동안 10% 파라포름알데히드로 고정하고, 파라핀에 포함시키고, 5 μm 두께의 조직 부분을 잘라내고, 염색을 위해 유리 슬라이드에 놓습니다.
  3. 이전에 보고된 바와 같이 표준 방법을 사용하여 헤마톡시린-에오신과 마슨의 삼색 염색을수행한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

담관 주입 절차는 이절차(10)와관련된 마우스 사망률을 감소시키기 위해 최적화되었다. TNBS는 35 μL 또는 50 μL의 총 부피로 처음 주어졌다. 50 μL의 부피에서 TNBS의 주사는 전체 췌장에 도달하고 보다 균일한 질병 표현형(도 1B)을유도할 수 있었다. 또한, 31G 바늘을 가진 인슐린 주사기를 사용하여 TNBS의 주입은 일반 주사기 및 바늘 크기에 비해 주입 속도를 더 잘 제어할 수 있었습니다. 얼음에 저장되고 약물 준비 후 1시간 이내에 사용된 갓 준비된 TNBS는 1시간 이상 제조된 TNBS에 비해 더 나은 결과를 산출했습니다. 이러한 개선으로, 수령인의 사망률은 통제되고 10% 미만으로 남아 있었습니다.

체중 감량은 수술 후 처음 3일 동안 원래 체중의 약 6%를 잃은 대조군에서 CP.Mice의 특성 중 하나이며, 그 후 점차 회복(21일째 104.6%)(도

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

만성 췌장염을 유도하기 위해 TNBS의 담관 주입은 마우스에서 기술적으로 도전적이며, 마우스의 최대 22.5 %는 약물 주입10의3-4 일 이내에 죽을 수 있습니다. 여기서, 이 보고는 이전 연구 결과에 근거를 둔 절차를 정제하고 <10%로 초기 마우스 사망률을 감소시켰습니다. 예를 들어, 약물 부피 증가(35 μL에서 50μL로) 약물이 전체 췌장에 도달하도록 보장할 수 있다. 인슐린 주사기와 작은 바늘 크기 (31G)를 사용하여 췌장 덕트에 잠재적 인 손상을 감소시키고 담낭이나 복부에 담즙이 누출되어 수술 후 처음 며칠 이내에 마우스 사망을 일으킬 가능성이 큽니다. 담관의 양쪽 끝을 클램핑하면 TNBS가 담낭과 내장으로 누출되는 것을 방지할 수 있으며, 이는 사망을 유발할 수 있습니다. 혈모 클립은 주입 된 췌장 내에서 TNBS를 억제하여 다른 조직에 대한 손상을 줄이면서 효능을 향상시킵니다. 또한 TNBS는 0°C 이상의 온도에서 안정적이지 않습니다. 따라서, 갓 준비된 TNBS...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

모든 저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 재향 군인 사무부 (VA-ORD BLR&D 메리트 I01BX004536)에 의해 지원되었으며, 국립 보건 연구소는 HW에 1R01DK105183, DK120394 및 DK118529를 보조금으로 지원했습니다. 우홍주 박사님의 기술 경험을 공유해 주셔서 감사합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10% 중성 완충 포르말린 v/vFisher Scientific23426796
알코올 준비 패드, 멸균Fisher Scientific22-363-750
동물 마취 시스템VetEquip, Inc.
부프레노르핀 염산염, 주입Par Sterile Products, LLCNDC 42023-179-05
원심분리기 튜브, 15mLFisher Scientific0553859A
에탄올, 절대(200 proof), 분자 생물학 등급Fisher ScientificBP2818500
Extra fine Micro Dissecting Scissors 4" 스트레이트 샤프Roboz Surgical 악기 (주)RS-5882
그레이프 집게 4" 엑스트라 델리케이트 팁 Roboz Surgical Instrument Co.RS-5136
가열 패드AmazonB07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner 바늘 홀더 5.25"Roboz 수술 기구 Co.RS-7850
인슐린 주사기, 31게이지 바늘BD324909
요오드 준비 패드Fisher Scientific19-027048
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-25
마이크로 클립 적용 겸자 5.5"Roboz 수술 기구 Co.RS-5410
마이크로 클립, 스트레이트 강한 곡선 1x6mmRoboz 수술 기구 Co.RS-5433
마이크로 클립, 스트레이트, 0.75mm 클립 너비Roboz Surgical Instrument Co.RS-5420
피크릴설폰산 용액, TNBS, H2OMillipore Sigma92822-1ML
폴리프로필렌 봉합사 4-0Med-Vet InternationalMV-8683
폴리프로필렌 봉합사 5-0Med-Vet InternationalMV-8661
염화나트륨, 0.9% 정맥 주사 용액VWR2B1322Q
외과용 드레이프, 멸균Med-Vet InternationalDR1826
조직 카세트피셔 사이언티픽22-272416
폰 프레이 필라멘트BiosebEB2-VFF
901806

참고문헌

  1. Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
  2. Liao, Y. H., et al. Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain. Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).
  3. Gui, F., et al. Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).
  4. Sun, Z., et al. Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice. Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).
  5. Aghdassi, A. A., et al. Animal models for investigating chronic pancreatitis. Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26(2011).
  6. Scoggins, C. R., et al. p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).
  7. Bradley, E. L. Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis. The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).
  8. Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study. World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).
  9. Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain. Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).
  10. Cattaruzza, F., et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).
  11. Bai, Y., et al. Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats. Molecular Brain. 12 (1), 76(2019).
  12. Puig-Diví, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
  13. Zhang, Y., et al. PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment. Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).
  14. Ceppa, E. P., et al. Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).
  15. Puig-Divi, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
  16. Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).
  17. Drewes, A. M., et al. Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms. Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

담관 주입췌장 섬유화췌장 염증신경병성 통증췌장 위축외과적 기법췌장 약물 전달
담즙 덕트 TNBS 주입을 통한 만성 췌장염을 위한 마우스 모델
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.