방법 논문

표준화된 장 루프 모델을 사용하여 마우스에서 장 투과성 및 호중구 환전 이동의 기능 평가

DOI:

10.3791/62093

⸱

2021년 2월 11일

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

이 논문에서

요약

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Dysregulated 장 상피 장벽 기능 및 면역 반응은 생리적인 모형의 부족 때문에 제대로 조사되지 않는 선동적인 장 질병의 특징입니다. 여기서는 생체 내 점막 투과성 및 백혈구 모집을 연구하기 위해 잘 혈관화되고 외부화된 장 세그먼트를 사용하는 마우스 장 루프 모델을 설명합니다.

초록

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장 점막은 발광 박테리아와 외인성 물질의 통행을 방지하면서 영양분과 물의 파라세포 수송을 허용하는 동적 장벽을 형성하는 상피 세포의 단일 층에 의해 줄지어 있습니다. 이 층의 위반은 발광 내용및 면역 세포의 모집에 증가 투과성 귀착됩니다, 둘 다 염증성 장 질환 (IBD)을 포함하여 창자에 있는 병리학 상태의 특징입니다.

다형성 핵 호중구(PMN)의 상피 장벽 기능 및 환피상전환(TEpM)을 조절하는 메커니즘은 정량적 분석을 허용하는 생체 내 실험 적 방법의 부족으로 인해 불완전하게 이해된다. 여기서, 우리는 ileum 또는 근위 결장의 외부화된 장 세그먼트를 채택하는 강력한 뮤린 실험 모형을 기술합니다. 외부장 루프(iLoop)는 완전히 혈관화되어 있으며 상피 세포 단층층을 통해 투과성 및 PMN 이동을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 전 생체 내챔버 기반 접근 방식에 비해 생리적 이점을 제공합니다.

우리는 이 모델의 두 가지 적용을 자세하게 보여줍니다: (1) 내루피알 주사 후 혈청에서 형광 라벨덱스트랜스의 검출을 통한 장 투과성의 정량적 측정, (2) 장 내 상피로 이동된 PMN의 정량적 평가는 항문 내 항막내 도입 후 장 루멘으로. 우리는 이 모형의 타당성을 입증하고 대조군에 비해 상피 단단한 접합 관련 단백질 JAM-A가 결여된 마우스에 있는 iLoop를 이용한 결과를 제공합니다. JAM-A는 염증 반응 도중 PMN TEpM뿐만 아니라 상피 장벽 기능을 조절하기 위하여 보였습니다. iLoop를 사용하여 우리의 결과는 이전 연구 결과를 확인하고 항상성 및 질병 도중 생체내에 있는 장 투과성 및 PMN TEpM의 규칙에 있는 JAM-A의 중요성을 강조합니다.

iLoop 모델은 장 내 항상성 및 염증의 생체 내 연구에서 재현 가능한 고도로 표준화된 방법을 제공하며 IBD와 같은 질병의 장 장벽 기능 및 점막 염증에 대한 이해를 크게 향상시킵니다.

서론

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장 점막은 기둥 장 상피 세포 (IeCs), 기본 라미나 프로프리아 면역 세포 및 근막 점막의 단일 층을 포괄합니다. 영양분의 흡수에 그것의 역할 이외에, 장 상피는 발광 장성 박테리아, 병원체 및 규정식 항원에서 바디 내부를 보호하는 물리적 장벽입니다. 또한, IeCs 및 lamina propria 면역 세포는 문맥과 자극에 따라 내성 또는 반응을 유도하는 면역 반응을 조정합니다. 상피 장벽의 붕괴는 병리학점막 염증의 발병을 선행하고 궤양성 대장염과 크론병1,2,3,4,5,6,7을모두 포괄하는 염증성 장질환(IBD)에 기여할 수 있다고 보고되었다. 궤양성 대장염을 가진 개인은 다형성 핵 호중구(PMN)의 과도한 환전성 이동(TEpM)을 존재하여 토굴 농양을 형성하고, 질병의 중증도와 연관된 발견8,

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프로토콜

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모든 동물 실험은 국립 보건원의 지침과 정책에 따라 수행되었으며 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 수술 전 준비

참고: 이 방법은 8-12주 된 C57BL/6 유전적 배경에서 성인 마우스를 채용하여 생성되었다. 모든 마우스는 정상적인 차우와 물에 대한 광고 리비툼 액세스를 가진 엄격한 특정 병원체 없는 조건하에서 보관되었다. 결과는 C57BL/6, 잼-a-null 마우스(Jam-a-/-)또는 IEC에 JAM-A의 선택적 손실을 품고 있는 마우스(Villin-cre; 잼 -afl / fl)및 쓰레기 메이트 잼 - afl/ fl 컨트롤 이전에 설명 된30.

  1. 지역 준비
    1. 깨끗한 공간에서 수술을 하십시오. 그러나 장 루프 모델은 무균/멸균 기술이 필요하지 않은 비생존 수술입니다. 수의 위생 관행을 관찰하고 청소 수술 기구를 사용합니다 (즉, 비누로 문질러물로 헹구고 물로 헹구고 70 % 에탄올이 뒤따릅니다).
    2. 온도....

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결과

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일루프 및 pcLoop 모델의 회로도 표현은 각각 도 1과 도 2에묘사됩니다. 해부학 사진은 장세그먼트(도 1B 및 도 2B)의외부화를 포함한 절차의 중요한 단계를 표시하며, 혈액 공급의 최소한의 교란을 허용하는 결찰에 적합한 위치의 식별(도 1C 및 도 2C)및 시약 용액(도1D 및 도 2D)으로채워질 수 있는 iLoop의 절단 끝의 결찰에 따른 세정이 뒤따릅니다.

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토론

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IBD와 같은 병리학 적 조건하에서 장 장벽 기능 및 면역 세포 모집의 장애 조절을 담당하는 메커니즘은 불완전하게 이해됩니다. 여기서, 우리는 ileum 또는 근위 결장의 잘 혈관화된 외부장 세그먼트를 채택하고 장 투과성, 호중구 이주 연구 및 그밖 응용의 평가를 허용하는 강력한 생체 내 murine 모형을 상세히 기술합니다.

iLoop는 살아있는 동물에서 수행되는 비 회복 수술입니다. 마취는 실험 과정에서 지속적으로 모니터링되어야하며 감도 의 평가는 필수입니다. 가장 중요한 단계는 (1) iLoop의 격리, (2) 절단 끝의 결찰 및 (3) 시약 용액의 내루무분사에 의한 iLoop의 인플레이션을 포함한다. 이러한 각 단계에서 출혈이 발생할 수 있으며 iLoop의 혈액 공급을 손상시키고 결과의 정확성에 영향을 줄 수 있습니다. 참고, PMN TEpM 분석 중 장루 출혈의 드문 경우에, 여기에 제시 된 흐름 세포측정 게이팅 전략은 혈류에서 직접 발생하는 PMN에서 전환 PMN을 구.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 근접 결장 루프 모델의 설립에 자신의 기여에 대한 우에르츠부르크 대학의 박사 스벤 플레밍, 마우스 식민지의 관리에 대한 숀 왓슨과 iLoop 모델의 사진의 수집을 돕는 치트라 K. Muraleedharan에 대한 감사. 이 작품은 독일 연구 재단/DFG(BO 5776/2-1)에서 KB, R01DK079392, R01DK072564, R01DK061379에서 C.A.P까지 지원했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
< 강력 > 장비 및 재질 < / 강력 >
BD 알코올 면봉BD326895
BD PrecisionGlide 바늘, 25G x 5 / 8 "BD305122
BD PrecisionGlide 바늘, 30G X 1 / 2 "BD305106
BD 1ml 투베르쿨린 주사기 (바늘 없음BD309659
15ml 원심분리기 튜브Corning14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black 폴리스티렌 마이크로플레이트FisherScientific07-200-592
Corning 무처리 배양 접시, 10cmMilliporeSigmaCLS430588
면 팁 어플리케이터(면봉), 6", 멸균FisherScientific25806 2WC
Dynarex 면 충전 거즈 스폰지, 비멸균, 2" x 2"Medex3249-1
EZ-7000 마취 기화기 (클래식 시스템, 히팅 유닛 포함)E-Z 시스템EZ-7000
팔콘 원심분리기 튜브 50ml VWR21008-940
Fisherbrand 컬러 라벨링 테이프FisherScientific15-901-10R
Halsey 바늘 홀더 (바늘 홀더) FST12001-13
Kimwipes, 작은 (티슈 와이프)FisherScientific06-666
1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브 토마스 사이언티픽 c2170
마이크로 튜브 1.3ml Z (혈청 응고 활성화 튜브)Sarstedt 41.1501.105
Moria Fine ScissorsFST14370-22
셀 스트레이너 캡이 있는 5ml 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브(35 µ m 나일론 메쉬)Falcon352235
Puralube Vet 연고, 멸균 안구 윤활제Dechra12920060
링 집게 (무딘 조직 집게)FST11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100YD FisherScientificNC9452680
Semken 집게 (해부학 집게)FST1108-13
Sofsilk 비흡수성 코팅 블랙 봉합사 꼰 실크 크기 3-0, 18", 바늘 19mm 길이 3/8 원형 역방향 절단 HenryScheinSS694
학생용 세밀한 펜치, 각도가 있는FST91110-10
10ml 주사기 PP/PE 바늘 없음Millipore Sigma 
96 웰 세포 배양 플레이트Corning3799
설치류 용 노란색 공급 튜브 20G x 30 mmInstechFTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTALonza51201
암모늄-염화-칼륨(ACK) 용해 버퍼BioWhittaker10-548E
Hanks' Balanced Salt SolutionCorning21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and MagnesiumCorning21-040-CV
strong>Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G 항체 (1A8)BioLegend127610
CD11b 단클론 항체, PE, eBioscience (M1/70)ThermoFisher12-0112-81
CountBright 절대 계수 비드InvitrogenC36950
DithiotreitolFisherScientificBP172-5
소 태아 혈청, 열 비활성화R& D Systems511550
플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란, 평균 분자량 4.000시그마60842-46-8
이소플루란할로카본12164-002-25
류코트리엔 B4Millipore 시그마71160-24-2
PerCP 쥐 안티 마우스 CD45 (30-F11)BD 파밍겐557235
정제 된 쥐 안티 마우스 CD16 / CD32 (마우스 BD FC 블록)BD Bioscience553142
재조합 쥐 IFN-&감마;Peprotech315-05
재조합 쥐 TNF-&알파;페프로텍315-01A
) Z248029<

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
  2. Jump, R. L., Levine, A. D. M....

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