방법 논문

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

DOI:

10.3791/62109

⸱

2021년 7월 6일

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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광-반응성 포유동물 세포를 안정적으로 제어하려면 광유전학적 방법의 표준화가 필요하다. 이러한 목표를 향하여, 본 연구는 유전자 회로 구축, 세포 공학, 광유전학 장비 운영 및 검증 분석의 파이프라인을 개괄하여 네거티브 피드백 광유전학 유전자 회로를 이용한 광유도 유전자 발현 연구를 사례 연구로 표준화한다.

초록

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포유동물 세포에서 신뢰할 수 있는 유전자 발현 조절은 사용된 방법에 관계없이 높은 배수 변화, 낮은 잡음 및 결정된 입출력 전달 기능을 갖는 도구를 필요로 한다. 이 목표를 향해, 광유전학적 유전자 발현 시스템은 지난 십 년 동안 포유동물 세포에서 단백질 수준의 시공간적 조절을 위해 많은 주목을 받았다. 그러나, 광유도 유전자 발현을 조절하는 대부분의 기존 회로는 구조적으로 다양하고, 플라스미드로부터 발현되며, 가변 광유전학 장비를 이용하여, 안정한 세포주에서 광유전학적 성분의 특성화 및 표준화를 탐구할 필요성을 창출한다. 여기서, 본 연구는 사례로서 음성 피드백 광유전학 회로를 이용하여 포유동물 세포에서 광유도성 유전자 발현을 조절하기 위한 신뢰할 수 있는 유전자 회로 구축, 통합 및 특성화의 실험 파이프라인을 제공한다. 이 프로토콜은 또한 광유전학 장비 및 광 정권을 표준화하는 것이 유전자 발현 잡음 및 단백질 발현 크기와 같은 유전자 회로 특징을 어떻게 확실하게 나타낼 수 있는지를 보여줍니다. 마지막으로,이 논문은 그러한 기술을 채택하고자하는 광유전학에 익숙하지 않은 실험실에 유용 할 수 있습니다. 여기에 설명된 파이프라인은 포유동물 세포에서 다른 광유전학 회로를 적용하여, 포유동물 세포에서 전사, 프로테오믹 및 궁극적으로 표현형 수준에서 유전자 발현의 보다 안정적이고 상세한 특성화 및 조절을 허용해야 한다.

서론

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다른 공학 분야와 마찬가지로, 합성 생물학은 프로토콜을 표준화하는 것을 목표로하며, 재현성이 높은 기능을 가진 도구를 생물학적 시스템과 관련된 질문을 탐구하는 데 활용할 수 있도록합니다1,2. 많은 조절 시스템이 구축된 합성 생물학의 한 도메인은 유전자 발현 조절3,4의 영역이다. 유전자 발현 조절은 단백질 수준과 가변성 (잡음 또는 변동 계수, CV = σ / μ, 평균에 대한 표준 편차로 측정)을 모두 타겟팅 할 수 있으며, 이는 생리 학적 및 병리학 적 세포 상태에서의 역할로 인해 중요한 세포 특성입니다5,6,7,8. 단백질 수준과 소음4,9,10,11,12....

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프로토콜

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1. 유전자 회로 설계

  1. 단일 유전자 회로/플라스미드(예를 들어, 포유동물 DNA 통합 서열 모티프32, 광-반응성 요소33, 또는 기능적 유전자34)로 결합할 유전자 성분을 선택한다.
  2. 임의의 유전 공학 및/또는 분자 클로닝 소프트웨어를 사용하여, 추후 사용 및 참조를 위해 DNA 서열을 저장하고, 각 서열에 주석을 달고, 필요한 모든 특징(예를 들어, START 코돈, 조절 또는 번역된 서열)을 검사한다35.
  3. 전체 유전자 회로 설계에 따라 부품을 개발하거나 채택하십시오36. 일례로서, LITers11에서와 같은 광유전학적 억제기의 경우, 광유도성 분해37,38 또는 리프레서의 DNA 결합 능력39의 불활성화가 가능한 도메인을 암호화하는 유전자 서열을 융합시키고, 리프레서 유전자(예를 들어, TetR)4

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결과

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유전자 회로 어셈블리 및 본 문서 내의 안정한 세포주 생성은 전사 활성, 단일 안정한 FRT 부위를 함유하는 상업적이고 변형된 HEK-293 세포에 기초하였다 (도 1). 유전자 회로는 플라스미드 내에 FRT 부위가 있는 벡터로 구축되어 HEK-293 세포 게놈 내로의 Flp-FRT 통합을 허용하였다. 이 접근법은 FRT 부위가 CRISPR/Cas950과 같은 DNA 편집 기술을 사용하여 게놈의 어느 곳에서나 관심있는 세포주에 추가될 수 있기 때문에 Flp-In 세포에만 국한되지 않습니다.

일단 적절한 세포주가 구축되고 정확한 삽입을 위해 검증되면, LPA 및 IRIS 소프트웨어는 유전자 발현31,51의 광 유도를 위한 표준화된 프로토콜로서 선택되었다. LPA 시스템은 광도, 펄스.......

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토론

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이 기사의 독자는 1) 유전자 회로 설계, 구축 및 검증을 포함하여 광유전학 유전자 회로 (및 다른 유전자 발현 시스템)를 특성화하는 데 필수적인 단계에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 2) 안정한 세포주 내로 유전자 회로를 도입하기 위한 세포 공학 (예를 들어, Flp-FRT 재조합); 3) LPA와 같은 광기반 플랫폼을 이용한 조작된 세포의 유도; 4) 형광 현미경을 통한 광 유도 분석의 초기 특성화; 및 5) 유세포 분석, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 또는 면역형광 분석을 포함하는 다양한 분석을 통한 최종 유전자 발현 특성화.

추가적으로, 상기 요약된 방법들은 본질적으로 관심있는 유전자들을 발현하는 임의의 유전자 회로 아키텍처에 대해 고도로 모듈화되며, 회로 구축 단계 및 분석이 수행되는 주요 잠재적 프로토콜 변형을 갖는다. 유전자 회로 구축의 경우, 분자 클로닝의 유연성은 관심있는 모든 유전자가 프라이머 설계 또는 어셈블리 프로토콜에 대한 사소한 변형으로 형광 .......

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공개 사항

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저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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우리는 의견과 제안에 대한 Balázsi 실험실, 첫 번째 LPA를 구성하는 데 도움을 준 Karl P. Gerhardt 박사와 Jeffrey J. Tabor 박사, LOV2-degron 플라스미드를 공유 한 Wilfried Weber 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 [R35 GM122561 및 T32 GM008444]의 지원을 받았다. The Laufer Center for Physical and Quantitative Biology; 그리고 국방 과학 및 공학 대학원 (NDSEG) 펠로우십. 오픈 액세스 요금에 대한 자금 조달 : NIH [R35 GM122561].

저자 기여도 : M.T.G.와 G.B.가 프로젝트를 구상했습니다. M.T.G., D.C., L.G.는 실험을 수행했다. M.T.G., D..C., L.G., G.B.는 데이터를 분석하고 원고를 준비했습니다. G.B.와 M.T.G.는 프로젝트를 감독했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 mL PCR 튜브Eppendorf951010006PCR
0.25% 트립신 EDTA 1XThermo Fisher Scientific유류 세포 0.5-10 & 수확을 위한 MT25053CI 시약
; L 조절 가능한 볼륨 피펫Eppendorf3123000020피펫팅 반응에 사용되는 도구
100-1000 μ L 조절 가능한 부피 피펫Eppendorf3123000039피펫팅 반응에 사용되는 도구
20-200 μ L 조절 가능한 부피 피펫Eppendorf3123000055피펫팅 반응에 사용되는 도구
2-20 μ L 부피 조절 가능한 피펫Eppendorf3123000039피펫 반응에 사용되는 도구
5 mL 폴리스티엔 라운드 바텀 튜브(Cell Strainer Cap 포함Corning352235유세포분석용
시약 5702R Centrifuge, 4 x 100 로터, 15 및 50 mL 어댑터, 120 VEppendorf22628113포유류 배양 작업용 장비
AgaroseDenville ScientificGR140-500겔 전기영동용 시약
96웰 플레이트용 알루미늄 호일VWR®60941-126광 유도 실험에서 플레이트를 덮는 데 사용되는 도구
AmpicillinSigma AldrichA9518-5G시약 올바른 플라스미드로 박테리아를 선택하기 위한
아날로그 와류 믹서 ThermoFisher Scientific02215365PRPCR, 형질전환 또는 겔 추출 반응을 운반하는 도구
Bacto Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140010시약 성장하는 박테리아
BD LSRAriaBD656700조작된 세포주를 단클론 집단으로 분류하기 위한 도구
BD LSRFortessaBD649225조작된 세포주 BSA
, 소 혈청 알부민정부 과학 IF배양 완충액
용 SIGA4919-1G 시약세포 배양 플레이트 12-well, 투명, 평평한 바닥(뚜껑 포함), 폴리스티렌, 비발열성, 표준 TCCorning353043플레이트 단클론 세포 성장에 사용됨
원심분리기VWR22628113포유류 세포 배양용
기기 화학적 흄 후드N/AIF 반응 수행을 위한 N/A
투명 세포 배양 플레이트 24 웰 평평한 바닥(뚜껑 포함BD353047단클론 세포 성장에 사용되는 플레이트
CytoOne T25 필터 캡 TC 플라스크USA ScientificCC7682-4825포유류 세포 성장용 용기
디메틸설폭사이드(DMSO)Fischer ScientificBP231-100엔지니어링 포유류 세포 동결에 사용되는 시약
Ethidium BromideThermo Fisher Scientific15-585-011겔 전기영동
용 시약Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, 뚜껑 포함Corning분류된 단클론 세포 성장을 위한 353072 용기
FCS ExpressDe Novo 소프트웨어:유세포 분석 데이터 특성화를 위한 N/A
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 포유류 세포
Fisherbrand 투명 뚜껑이 있는 페트리 접시 - 돌출된 능선; 100 x 15 mm피셔 사이언티픽FB0875712세균 성장 장비
Gibco  DMEM, High GlucoseThermo Fisher Scientific11-965-092포유류 세포 Hs00932330_m1 시약
Taqman 유전자 발현 분석Life Technologies4331182qPCR 프로브
Hygromycin B(50mg/mL), 20mLLife Technologies10687-010적절한 유전자 회로 통합으로 세포 선택을 위한 시약
iScript 역전사 슈퍼믹스Bio-Rad Laboratories1708890RNA를 cDNA Laboratory Freezer로 전환하기 위한 시약
-20 ° CVWR76210-392실험 시약 보관 장비
실험실 냉동고 -80 ° CPanasonicMDF-U74VC실험 시약 보관용 장비
실험실 냉장고 +4 ° CVWR76359-220실험 시약 보관용 장비
LB Broth(Lennox), 1kgSigma-AldrichL3022-250G박테리아 증식용 시약
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008유전자 회로를 포유류 세포에 형질주입하기 위한 reagemt
MATLAB 2019MathWorks데이터
분석을 위한 N/A 소프트웨어면역형광 반응용Acros 유기물413775000
마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌 1.7mLVWR20170-333플라스틱 용기
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman 유전자 발현 분석Life Technologies4331182qPCR 프로브
MultiTherm Shaker벤치마크 ScientificH5000-HC장비 박테리아
DNA/RNA 농도 측정을 위한NanoDrop Lite 분광 광도계Thermo Fisher ScientificND-NDL-US-CAN
NEB Q5 고충실도 DNA 중합효소 2x 마스터 믹스NEBM0492S유전자 회로 단편 PCR용
시약 NEB10-beta 유능한 대장균(고효율)New England Biolabs (NEB)C3019H유전자 회로 증폭을 위한 박테리아 세포 관심
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England Biolabs (NEB)E2621L유전자 회로 균열 결합용 시약
Nikon Eclipse Ti-E 도립 현미경과 DS-Qi2 카메라Nikon Instruments Inc.유전자 발현을 정량화하는 N/A
NIS-ElementsNikon Instruments Inc.형광 현미경 검사 데이터
올리고뉴클레오티드IDT유전자 회로 구성 요소의 PCR에 사용되는 N/A
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ 시리즈 CO2 UV 및 H2O2 ControlPanasonicMCO-170AICUVHL-PA포유류 세포
성장을 위한 기기파라포름알데히드, 16% 전자 현미경 등급전자 현미경 과학15710-S시약
PBS, 둘베코의 인산염 완충 식염수(D-PBS) (1x)포유류 세포 배양을 위한 인14190144 시약, IF 배양 완충액
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)유류 세포
1차 ERK 항체세포 신호 전달 기술4370S면역형광을 위한 1차 ERK
항체 1차 KRAS 항체Sigma-AldrichWH0003845M1면역형광을 위한 1차 KRAS 항체
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106정제 유전자 회로 플라스미드용 시약 키트
QIAquick Gel Extraction Kit (50)Qiagen28704유전자 회로 단편 정제를 위한 시약 키트
QuantStudio 3 Real-Time PCR 시스템EppendorfA28137qRT-PCR
관련 정량 분석 앱Thermo Fisher ScientificRNA/cDNA 정량화를 위한 소프트웨어 N/A amplificaiton
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134키트, 조작된 포유류 세포의 RNA 추출을 위한
2차 ERK 항체세포 신호 전달 기술8889S면역형광용 2차 ERK 항체
2차 KRAS 항체InvitrogenA11005면역형광용 2차 KRAS 항체
혈청학적 피펫 5.0mLOlympus Plastics화학 반응 설정에 사용되는12-102
SmartView Pro Imager 시스템주요 과학UVCI-1200올바른 PCR 밴드 이미징을 위한 도구
SnapGene Viewer(무료) 또는SnapGene SnapGeneN/A소프트웨어 DNA 염기서열 설계 및 분석
스테이지 상단 인큐베이터Tokai HitINU-TIZPCR, 형질전환 또는 겔 추출 반응을 운반하는 도구
TaqMan Fast Advanced Master Mix유전자 회로 단편의
PCR을 위한 Thermo Fisher Scientific 4444557 시약TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxnLife Technologies4326317EqPCR probe
ThermocyclerBio-1851148 RadPCR, 형질전환 또는 겔 추출 반응 운반용 도구
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture TreatedPerkinElmer1450-605plate 광 유도에 사용 실험
VWR 일회용 파스퇴르 피펫, 유리, 붕규산 유리 피펫, 짧은 팁, 용량=2mL, 전체 길이=14.6cm포유류 세포 배양을 위한VWR14673-010
VWR Mini 수평 전기영동 시스템, Mini10 겔 시스템VWR89032-290DNA 겔 전기영동을 위한 장비
Flp-In 293Thermo Fisher ScientificR75007FRT를 사용한 엔지니어링 세포주 사이트
포) 기기) 소프트웨어 성장을 위한 500 mL Corning 35-010-CV 시약 KRAS 동형 실험 메탄올 시약변환 장비 기기 특성화를 위한 N/A 시약용 시약, 포 성장을 위한 100x Fisher Scientific 15140-122 시약용 장비 키트 다양한 시약 시약

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822(2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors....

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