광-반응성 포유동물 세포를 안정적으로 제어하려면 광유전학적 방법의 표준화가 필요하다. 이러한 목표를 향하여, 본 연구는 유전자 회로 구축, 세포 공학, 광유전학 장비 운영 및 검증 분석의 파이프라인을 개괄하여 네거티브 피드백 광유전학 유전자 회로를 이용한 광유도 유전자 발현 연구를 사례 연구로 표준화한다.
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방법 논문
포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
포유동물 세포에서 신뢰할 수 있는 유전자 발현 조절은 사용된 방법에 관계없이 높은 배수 변화, 낮은 잡음 및 결정된 입출력 전달 기능을 갖는 도구를 필요로 한다. 이 목표를 향해, 광유전학적 유전자 발현 시스템은 지난 십 년 동안 포유동물 세포에서 단백질 수준의 시공간적 조절을 위해 많은 주목을 받았다. 그러나, 광유도 유전자 발현을 조절하는 대부분의 기존 회로는 구조적으로 다양하고, 플라스미드로부터 발현되며, 가변 광유전학 장비를 이용하여, 안정한 세포주에서 광유전학적 성분의 특성화 및 표준화를 탐구할 필요성을 창출한다. 여기서, 본 연구는 사례로서 음성 피드백 광유전학 회로를 이용하여 포유동물 세포에서 광유도성 유전자 발현을 조절하기 위한 신뢰할 수 있는 유전자 회로 구축, 통합 및 특성화의 실험 파이프라인을 제공한다. 이 프로토콜은 또한 광유전학 장비 및 광 정권을 표준화하는 것이 유전자 발현 잡음 및 단백질 발현 크기와 같은 유전자 회로 특징을 어떻게 확실하게 나타낼 수 있는지를 보여줍니다. 마지막으로,이 논문은 그러한 기술을 채택하고자하는 광유전학에 익숙하지 않은 실험실에 유용 할 수 있습니다. 여기에 설명된 파이프라인은 포유동물 세포에서 다른 광유전학 회로를 적용하여, 포유동물 세포에서 전사, 프로테오믹 및 궁극적으로 표현형 수준에서 유전자 발현의 보다 안정적이고 상세한 특성화 및 조절을 허용해야 한다.
서론
다른 공학 분야와 마찬가지로, 합성 생물학은 프로토콜을 표준화하는 것을 목표로하며, 재현성이 높은 기능을 가진 도구를 생물학적 시스템과 관련된 질문을 탐구하는 데 활용할 수 있도록합니다1,2. 많은 조절 시스템이 구축된 합성 생물학의 한 도메인은 유전자 발현 조절3,4의 영역이다. 유전자 발현 조절은 단백질 수준과 가변성 (잡음 또는 변동 계수, CV = σ / μ, 평균에 대한 표준 편차로 측정)을 모두 타겟팅 할 수 있으며, 이는 생리 학적 및 병리학 적 세포 상태에서의 역할로 인해 중요한 세포 특성입니다5,6,7,8. 단백질 수준과 소음4,9,10,11,12....
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프로토콜
1. 유전자 회로 설계
- 단일 유전자 회로/플라스미드(예를 들어, 포유동물 DNA 통합 서열 모티프32, 광-반응성 요소33, 또는 기능적 유전자34)로 결합할 유전자 성분을 선택한다.
- 임의의 유전 공학 및/또는 분자 클로닝 소프트웨어를 사용하여, 추후 사용 및 참조를 위해 DNA 서열을 저장하고, 각 서열에 주석을 달고, 필요한 모든 특징(예를 들어, START 코돈, 조절 또는 번역된 서열)을 검사한다35.
- 전체 유전자 회로 설계에 따라 부품을 개발하거나 채택하십시오36. 일례로서, LITers11에서와 같은 광유전학적 억제기의 경우, 광유도성 분해37,38 또는 리프레서의 DNA 결합 능력39의 불활성화가 가능한 도메인을 암호화하는 유전자 서열을 융합시키고, 리프레서 유전자(예를 들어, TetR)4
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결과
유전자 회로 어셈블리 및 본 문서 내의 안정한 세포주 생성은 전사 활성, 단일 안정한 FRT 부위를 함유하는 상업적이고 변형된 HEK-293 세포에 기초하였다 (도 1). 유전자 회로는 플라스미드 내에 FRT 부위가 있는 벡터로 구축되어 HEK-293 세포 게놈 내로의 Flp-FRT 통합을 허용하였다. 이 접근법은 FRT 부위가 CRISPR/Cas950과 같은 DNA 편집 기술을 사용하여 게놈의 어느 곳에서나 관심있는 세포주에 추가될 수 있기 때문에 Flp-In 세포에만 국한되지 않습니다.
일단 적절한 세포주가 구축되고 정확한 삽입을 위해 검증되면, LPA 및 IRIS 소프트웨어는 유전자 발현31,51의 광 유도를 위한 표준화된 프로토콜로서 선택되었다. LPA 시스템은 광도, 펄스.......
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토론
이 기사의 독자는 1) 유전자 회로 설계, 구축 및 검증을 포함하여 광유전학 유전자 회로 (및 다른 유전자 발현 시스템)를 특성화하는 데 필수적인 단계에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 2) 안정한 세포주 내로 유전자 회로를 도입하기 위한 세포 공학 (예를 들어, Flp-FRT 재조합); 3) LPA와 같은 광기반 플랫폼을 이용한 조작된 세포의 유도; 4) 형광 현미경을 통한 광 유도 분석의 초기 특성화; 및 5) 유세포 분석, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 또는 면역형광 분석을 포함하는 다양한 분석을 통한 최종 유전자 발현 특성화.
추가적으로, 상기 요약된 방법들은 본질적으로 관심있는 유전자들을 발현하는 임의의 유전자 회로 아키텍처에 대해 고도로 모듈화되며, 회로 구축 단계 및 분석이 수행되는 주요 잠재적 프로토콜 변형을 갖는다. 유전자 회로 구축의 경우, 분자 클로닝의 유연성은 관심있는 모든 유전자가 프라이머 설계 또는 어셈블리 프로토콜에 대한 사소한 변형으로 형광 .......
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공개 사항
저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 의견과 제안에 대한 Balázsi 실험실, 첫 번째 LPA를 구성하는 데 도움을 준 Karl P. Gerhardt 박사와 Jeffrey J. Tabor 박사, LOV2-degron 플라스미드를 공유 한 Wilfried Weber 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 [R35 GM122561 및 T32 GM008444]의 지원을 받았다. The Laufer Center for Physical and Quantitative Biology; 그리고 국방 과학 및 공학 대학원 (NDSEG) 펠로우십. 오픈 액세스 요금에 대한 자금 조달 : NIH [R35 GM122561].
저자 기여도 : M.T.G.와 G.B.가 프로젝트를 구상했습니다. M.T.G., D.C., L.G.는 실험을 수행했다. M.T.G., D..C., L.G., G.B.는 데이터를 분석하고 원고를 준비했습니다. G.B.와 M.T.G.는 프로젝트를 감독했습니다.
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재료
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| ; L 조절 가능한 볼륨 피펫 | Eppendorf | 3123000020 | 피펫팅 반응에 사용되는 도구 |
| 100-1000 μ L 조절 가능한 부피 피펫 | Eppendorf | 3123000039 | 피펫팅 반응에 사용되는 도구 |
| 20-200 μ L 조절 가능한 부피 피펫 | Eppendorf | 3123000055 | 피펫팅 반응에 사용되는 도구 |
| 2-20 μ L 부피 조절 가능한 피펫 | Eppendorf | 3123000039 | 피펫 반응에 사용되는 도구 |
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| 실험실 냉장고 +4 ° C | VWR | 76359-220 | 실험 시약 보관용 장비 |
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| Nikon Eclipse Ti-E 도립 현미경과 DS-Qi2 카메라 | Nikon Instruments Inc. | 유전자 발현을 정량화하는 N | /A |
| NIS-Elements | Nikon Instruments Inc. | 형광 현미경 검사 데이터 | |
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| Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ 시리즈 CO2 UV 및 H2O2 Control | Panasonic | MCO-170AICUVHL-PA | 포유류 세포 |
| 성장을 위한 기기파라포름알데히드, 16% 전자 현미경 등급 | 전자 현미경 과학 | 15710-S | 시약 |
| PBS, 둘베코의 인산염 완충 식염수(D-PBS) (1x) | 포 | 유류 세포 배양을 위한 인14190144 시약, IF 배양 완충액 | |
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| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | 유전자 회로 단편 정제를 위한 시약 키트 |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR 시스템 | Eppendorf | A28137 | qRT-PCR |
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| 2차 ERK 항체 | 세포 신호 전달 기술 | 8889S | 면역형광용 2차 ERK 항체 |
| 2차 KRAS 항체 | Invitrogen | A11005 | 면역형광용 2차 KRAS 항체 |
| 혈청학적 피펫 5.0mL | Olympus Plastics | 화학 반응 설정에 사용되는 | 12-102 |
| SmartView Pro Imager 시스템 | 주요 과학 | UVCI-1200 | 올바른 PCR 밴드 이미징을 위한 도구 |
| SnapGene Viewer(무료) 또는 | SnapGene SnapGene | N/A | 소프트웨어 DNA 염기서열 설계 및 분석 |
| 스테이지 상단 인큐베이터 | Tokai Hit | INU-TIZ | PCR, 형질전환 또는 겔 추출 반응을 운반하는 도구 |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | 유전자 회로 단편의 | ||
| PCR을 위한 Thermo Fisher Scientific 4444557 시약TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn | Life Technologies | 4326317E | qPCR probe |
| Thermocycler | Bio-1851148 Rad | PCR, 형질전환 또는 겔 추출 반응 운반용 도구 | |
| VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated | PerkinElmer | 1450-605 | plate 광 유도에 사용 실험 |
| VWR 일회용 파스퇴르 피펫, 유리, 붕규산 유리 피펫, 짧은 팁, 용량=2mL, 전체 길이=14.6cm | 포유류 세포 배양을 위한 | VWR | 14673-010 |
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| Flp-In 293 | Thermo Fisher Scientific | R75007 | FRT를 사용한 엔지니어링 세포주 사이트 |
참고문헌
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- Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors....
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