에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

요약

여기서 우리는 유전 코드 확장을 사용하여 아세틸화 히스톤 단백질을 발현하고 체외에서 재구성된 뉴클레오좀을 조립하는 방법을 제시한다.

초록

아세틸화 히스톤 단백질은 돌연변이, N ε-아세틸-리신(AcK)-특이적 메타노사르시나 마지 피롤리신 tRNA-synthetase(MmAcKRS1) 및 그 코그네이트 tRNA(tRNA^Pyl)를결합하여 재구성한 단핵형 특이적 군수로 재구성할 수 있는 에셀리치아 대장균에서 용이하게 발현될 수 있다. MmAcKRS1 및 tRNA^Pyl은 대장균에서 번역하는 동안 선택되는 mRNA에 있는 황색 돌연변이 부위에서 AcK를 전달한다. 이 기술은 H3 lysine 사이트에 AcK를 통합하는 데 광범위하게 사용되었습니다. Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS)는 또한 사이트 특정 단백질 수정 또는 기능화를 위한 다른 비카노마이컬 아미노산(ncAA)을 통합하도록 쉽게 진화될 수 있다. 여기서 우리는 MmAcKRS1 시스템을 사용하여 AcK를 히스톤 H3에 통합하고 아세틸화 된 H3 단백질을 재구성 된 단핵구로 통합하는 방법을 자세히 설명합니다. 아세틸화 재구성 된 단핵구는 생화학 적 및 결합 적 반응, 구조 결정 등에 사용될 수 있습니다. 수정된 단핵구를 얻는 것은 새로운 상호 작용을 발견하고 후성 유전학을 이해하는 관련있는 실험을 디자인하기 위해 중요합니다.

서론

우리는 PylRS와 tRNA^Pyl을 사용하여 사이트 특정 아세틸화 히스톤으로 재구성된 단핵구를 합성하고 조립했습니다. PylRS는 포스트 번역 변형 (PTM)을 가진 단백질을 생성하는 유전 코드 확장 도구로 귀중한 입증하고 약 200 다른 ncAA를 통합하기 위해 유전적으로 진화되었습니다. PylRS는 호박색 정지 코돈에 통합되어 번역 중에 다른 아미노산에서 경쟁을 제거합니다. PylRS는 메탄원성 고고학에서 처음 발견되었으며, 이후 화학 생물학에서 새로운 반응성 화학 그룹을 단백질^1,2에통합하는 데 활용되었습니다.

MmAcKRS1은 메타노사르키나 미제이 PylRS로부터 진화하고 아세틸화된 단백질^3,4,5,6의합성을 위해 실험실에서 자주 사용되었다. MmAcKRS1은 대장균에서 번역하는 동안 선택되는 mRNA에 있는 호박색 돌연변이 부위에서 AcK를 전달한다. ....

프로토콜

1. 플라스미드 건설

1. 어떤 히스톤 단백질이 아세틸화되고 어떤 리신 부위를 결정할지 결정하십시오. 사이트 지시 돌연변이 발생을 사용하여 황색 정지 코돈 (TAG)에 사이트를 돌연변이.
   참고: 히스톤 단백질의 발현에 활용된 4개의 이전에 디자인된 플라스미드가 있습니다. 4개의 히스톤 단백질은 모두 N-단말 히스티딘 태그로 pETDuet-1 벡터로 복제하였다. Histone H4에는 또한 SUMO 태그, 약 40의 카피 번호가 있는 복제 colE1의 기원, 암피실린 내성 및 T7 프로모터가 포함되어 있습니다.
   1. 4개의 히스톤 단백질 플라스미드 중 하나에서 원하는 부위(기존 리신 코동을 호박스톱 코돈으로 교체)에서 TAG 돌연변이를 포함하는 전방 및 역프라이머를 설계한다.
   2. 플라스미드가 포함된 태그를 증폭시키기 위해 전체 플라스미드 PCR을 사용합니다. 프라이머에 적합한 어닐링 온도를 결정합니다. 일반적으로, 프라이머의 용융_{온도(Tm)는}5°C를 뺀 값으로 충분할 것이다. 어려움이 PCR 생성물을 얻는 데 어려움이 있는 경우, Tm-5°C 주위의 온도 그라데이션을 사용하여 증폭을 위한 어닐링 온도를 최적화할 수 있습니다.
      참고:본 실험에서 사내 발현PFU 폴리머라제는 30초(데니션레이션)....

결과

디머, 테트라머 및 옥타머는 12% SDS PAGE젤(그림 1 및 도 2)을실행하여 평가할 수 있다. 여기서 당신은 아세틸화 테트라머중 일부가 다른 테트라머보다 낮은 수율을 가지고 있음을 알 수 있습니다(그림 1). 사실, 코어 영역에 가까울수록 수율이 낮아집니다. 이것은 가장 가능성이 있기 때문에 테트라머의 조립을 방해 하는 아 세 틸 화 코어 영역에 가까이. 옥타머를 조립한 후 유사한 영향을 관찰한다(도2). 601 DNA 서열로 옥타머를 조립한 후, 뉴클레오닉은 에티듐 브로마이드로 염색한 후 5% 1x TBE 네이티브 PAGE 젤을 사용하여 평가될 수있다(도 3). TEV 소화 전에 뉴클레오소성 대역은.......

토론

실험 중에 이 프로토콜을 모든 세부 사항으로 따르는 것이 필수적입니다. 뉴클레오좀은 매우 안정적이지 않으며 많은 시행착오가 이 프로토콜을 결정하는 데 들어갔습니다. 미립자가 조립 공정을 쉽게 방해할 수 있기 때문에 모든 단계(또는 관찰 될 때마다)에서 침전을 제거하는 것이 중요합니다. 항상 얼음에 히스톤 샘플을 유지합니다. 뉴클레오좀이 너무 오래 4°C로 저장되면 자발적으로 분해될 수 있습니다. 어떤 실험에서 사용하기 전에 4 °C에 저장된 경우 네이티브 PAGE에 의해 어떤 샘플을 확인해야합니다. 이것은 또한 분해하는 원인이 될 수 있기 때문에 옥타머와 뉴클레오좀을 소용돌이피하십시오. 문제가 어렴풋이 조립 발생 하는 경우, 테트라머, 또는 옥타머이것은 일반적으로 가난한 단백질 품질을 나타냅니다. 단백질 품질을 15% SDS-PAGE로 확인합니다. 단백질 순도가 낮으면 단백질을 순수한 물에 투석하는 것입니다. 이것은 무거운 강수량을 일으키는 원인이 되고 단백질 수율을 크게 감소시킬 것입니다, 그러나 더 순수한 견본을 생성할 것입.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5 M TE 완충액	NA		0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
1 M TE 완충액	NA		NA 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
100x TE 완충액	NA
2 M TE 완충액	NA	NA	2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
20 mM TE 완충액	NA		NA 20 mM NaCl, 20 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 7.8
6 M GuHCl			6M 구아니디늄 클로라이드, 20 mM 트리스, 500 mM NaCl, pH 8.0
아세틸리신
컬럼 세척 버퍼	NA	NA	6 M 요소, 500 mM NaCl, 20 mM 트리스, 20 mM 이미다졸 pH 7.8
용리 버퍼	NA	NA Fisherbrand
가변 흐름 화학 물질 이송 펌프	Fischer Scientific	15-077-67
His-TEV 프로테아제
히스톤 용해 완충액	NA		NA 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0
Ni-NTA 수지			6 M 요소, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM 이미다졸, pH 7.8
PCR 클린업 키트	Epoch Life Sicences	2360050
펠렛 세척 완충액	NA		NA 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS	Addgene	137976
pGEM-3z/601	Addgene	26656
저장 버퍼	NA		NA 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% 글리세롤, pH 7.8
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