이 방법은 급성 뇌 슬라이스를 사용하여 내인성 모아민 방출의 검출을위한 간단한 기술을 소개합니다. 설정은 모노아민 방출을 위한 조직 홀더를 포함하는 48웰 플레이트를 사용합니다. 방출된 모노아민은 HPLC에 의해 전기화학적 검출과 결합하여 분석된다. 또한,이 기술은 약물 발견을위한 스크리닝 방법을 제공합니다.
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방법 논문
급성 뇌 슬라이스에서 내인성 모아민 방출 측정을 위한 판 기반 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
모노 아민 신경 전달 물질은 수많은 신경 및 정신 질환과 관련 된. 이러한 조건의 동물 모델은 모노 아민 신경 전달 물질 릴리스 및 섭취 역학에 변화를 보여 주었다. 전기 생리학, 빠른 스캔 순환 볼탐법 (FSCV), 이미징, 생체 내 미세 투석, 광유전학 또는 방사능 사용과 같은 기술적으로 복잡한 방법은 모노아민 기능을 연구하는 데 필요합니다. 여기서 제시된 방법은 모노아민 방출을 검사하기 위한 조직 홀더를 포함하는 48웰 플레이트를 사용하여 급성 뇌 슬라이스에서 모노아민 방출을 검출하기 위한 최적화된 2단계 접근법이며, 모노아민 방출 측정을 위한 전기화학적 검출(HPLC-ECD)과 결합된 고성능 액체 크로마토그래피입니다. 간략하게, 전두엽 피질, 해마 및 등삼 조각을 포함하는 관심 영역을 포함하는 쥐 뇌 단면은 조직 슬라이서 또는 진동을 사용하여 수득하였다. 관심의 이 지역은 전체 두뇌에서 해부되고 산소생리완에서 배양되었습니다. 생존력은 실험 시간 과정 전반에 걸쳐 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석으로 조사되었다. 급성 해부 된 뇌 영역은 수송기 (암페타민)를 통해 또는 외세포 성 성 혈관 방출 (KCl)의 활성화를 통해 모노 아민 방출을 유도하는 것으로 알려진 다양한 약물 조건에서 배양되었다. 인큐베이션 후, 슈퍼나탄에서 출시된 제품은 HPLC-ECD 시스템을 통해 수집 및 분석되었다. 여기에서, 기저 모노아민 방출은 급성 두뇌 조각에서 HPLC에 의해 검출됩니다. 이 데이터는 AMPH와 KCl이 모노아민 방출을 유도한다는 것을 보여주는 생체 내 및 체외 결과를 지원합니다. 이 방법은 모노아민 수송기 의존방출과 관련된 메커니즘을 연구하는 데 특히 유용하며, 신속하고 저렴한 방식으로 모노아민 방출에 영향을 미치는 화합물을 선별할 수 있는 기회를 제공한다.
서론
신경 및 정신 질환의 과다 한 소화 장애 또는 단일 아민 신경 전달 물질의 부족 한 유지 보수와 관련 된 (도파민 [DA], 세로토닌 [5-HT], 노르 피 네 프 린 [NE]) 항상성1,2,3. 이러한 조건은 우울증을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다1,2, 정신 분열증, 불안2, 중독4, 폐경5,6,7, pain8, 및 파킨슨 병3. 예를 들면, 폐경의 몇몇 쥐 모형은 해마 내의 단색민의 난독증 또는 감소, 전두엽 피질 및 striatum가 폐경을 경험하는 여자에서 보인 불경기 및 인식 쇠퇴 둘 다와 연관될 수 있다는 것을 보여주었습니다. 이 ....
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프로토콜
동물 취급 및 조직 수집을 포함한 모든 실험은 플로리다 대학과 뉴욕 시 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 승인 된 프로토콜 201508873 (UF) 및 1071 (CCNY)에 따라 수행되었습니다. 시약 및 버퍼의 경우 보충 파일을 참조하십시오.
1. 급성 쥐 뇌 슬라이스 준비
참고:이 실험에서 성인 수컷 쥐(250-350 g)가 사용하였다. 그러나, 이 설정은 다른 발달 점, 암컷 쥐 및 그밖 종에 대한 기능적이다. 마우스와 같은 작은 동물을 사용하는 경우, 실험자는 조건당 다른 수의 뇌 슬라이스 또는 펀치를 사용하여 프로토콜을 최적화하도록 조정할 수 있다. 해부 버퍼를 버퍼 1이라고 합니다. efflux 버퍼를 버퍼 2라고 합니다.
- 보충 파일에 설명한 대로 버퍼 1을 준비합니다. 얼음에 20 분 동안 95 %/5 %(O2 / CO2)로 버블링하여 산소로 버퍼 1을 포화. 버퍼 1 50mL을 제거하고 작은 비커 또는 페트리 접시에 얼음을 식힙니다. 이 버퍼는 급성 수확 된 전체 뇌를 보유하는 데 사용됩니다.
- 1%-2%의 이소플루란으로 ....
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결과
이 기술은 내부 조직 홀더가있는 48 웰 플레이트에 기반을 둔 전기 화학 적 검출을 가진 HPLC를 사용하여 내인성 모아민의 방출을 측정하기 위해 뇌 슬라이스의 사용을 설명합니다. 실험 설정은 그림 1 과 도 2에 묘사됩니다. 초기에는 실험이 끝날 때까지 조직의 생존가능성을 보장하기 위해 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드, 테트라졸) 분석이 수행되었다. 기능적 실험 후, 급성 뇌 슬라이스는 대사활성이며 세포 사멸의 상태인 트리톤 X-100 1%로 배양된 것과 비교하여 생존할 수 있다(도 3).
급성, 20 분, AMPH와 해마와 전두엽 피질 뇌 섹션의 치료는 각 .......
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토론
모노아민 방출 측정은 이종 세포, 신경 배양, 뇌 시냅토좀, 전 생체 내 급성 뇌 슬라이스, 및 전체 동물 13,20,41,42,58,65,65,67,67,68 과 같은 여러 시스템에서 수년간 수행되었습니다. . 이러한 준비는 신경 과학의 분야를 탐색 하는 기본 신경 전달 물질 릴리스 메커니즘단일 화 증을 통해 신경 학 및 정신 .......
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공개 사항
저자는 공개가 없습니다.
감사의 글
이 작품은 J.A.P.에 폰데시트 개시 기금 N 11191049, NIH는 G.E.T.에 DA038598을 보조금으로 지원했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 48 웰 플레이트 | NA | NA 분석 | |
| 아세토니트 | 피셔 사이언티픽 | A998-1 | 이동상 |
| 염화칼슘 무수 | 시그마 알드리치 | C1016 | 변형 인공 뇌척수액 또는 유출 버퍼 |
| 선명도 소프트웨어 | Anetc | ||
| 구연산 | 시그마 알드리치 | 이동상 | |
| D-(+)-포도 | 그마 | 1002608421 | 해부 완충액 |
| DMF | 시그마 Aldrich | D4551 | MTT 분석 |
| EDTA-Na2 | 시그마 Aldrich | 모바일 위상 | |
| GraphPad 소프트웨어 | Graphpad Software, Inc | 통계 분석 | |
| 글리세롤 | 시그마 Aldrich | G5516 | 용해 버퍼 |
| HEPES | 시그마 Aldrich | H3375 | 용해 완충기 |
| HPLC, 십년간 Amperometric | Anetc | HPLC, LC-EC 체계 | |
| HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
| L-Asrobic Acid | Sigma Aldrich | A5960 | 해부 버퍼 |
| 마그네슘 황산염 | Sigma | 7487-88-9 | KH 버퍼 |
| 마이크로 원심분리기 필터 유닛 UltraFree | Millipore | C7554 | 분석 - 48웰 플레이트에 맞는 6 |
| MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT 분석 |
| Nanosep | VWR | 29300-606 | 분석, 단백질 분석 |
| 옥탄술폰산 | 시그마 알드리치 | V800010 | 이동상 |
| 파가일린 클로로하이드레이트 | 시그마 알드리치 | P8013 | 변형 인공 뇌척수액 또는 유출 버퍼 |
| 인산 | 시그마 알드리치 | 이동상 | |
| 염화칼 | 시그마 | 12636 | KH 버퍼 |
| 인산칼륨 단일염기 | 성 시그마 | 1001655559 | KH 완충 |
| Precisonary VF-21-0Z | Precissonary | Compresstome | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Sigma Aldrich | P2714 | 용해 완충액. |
| 중탄산나트륨 | 시그마 | S5761 | 해부 완충액 |
| 중탄산나트륨 | 시그마 알드리치 | S5761 | 해부 완충액 |
| 염화나트륨 | 시그마 | S3014 | KH 완충액 |
| 도데실황산나트륨 | 시그마 알드리치 | L3771 | 용해 완충액 |
| 트리톤 X-100 | 시그마 알드리치 | T8787 | MTT 분석 / 용해 완충액 |
참고문헌
- Jesulola, E., Micalos, P., Baguley, I. J. Understanding the pathophysiology of depression: From monoamines to the neurogenesis hypothesis model - are we there yet. Behavioural Brain Research. 341, 79-90 (2018).
- Krystal, J. H., D'Souza, D. C., Sanacora, G., Goddard, A. W., Charney, D. S.
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재인쇄 및 허가
