방법 논문

Axin2-mTurquoise2 Reporter Thymocytes에서 낮은 Wnt 발현의 유세포 분석 및 컨포칼 이미징 분석

DOI:

10.3791/62141

⸱

2021년 9월 24일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, Leiden University Medical Center, 2Department of Cell and Chemical Biology, Leiden University Medical Center

이 논문에서

요약

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신호 수준은 세포의 운명을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 이는 Wnt 신호 전달의 조절이 흥미로운 치료 표적을 구성한다는 것을 나타냅니다. 여기에서는 뚜렷한 Wnt 신호 수준을 측정하는 강력한 쥐 표준 Wnt 신호 리포터 모델에 대한 유세포 분석 및 컨포칼 현미경 분석 방법에 대해 설명합니다.

초록

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Wnt 발현 수준을 측정하는 것은 새로운 Wnt 치료 표적을 식별하거나 테스트하려고 할 때 필수적입니다. 이전 연구에서는 표준 Wnt 신호전달이 투여 기반 메커니즘을 통해 작동한다는 것을 보여주었으며, 이는 다양한 세포 유형에서 Wnt 신호전달을 연구하고 측정해야 할 필요성을 유발했습니다. 생리학적 Wnt 발현을 나타내기 위해 여러 리포터 모델이 제안되었지만, 유전적 맥락 또는 리포터 단백질이 이러한 도구의 유효성, 정확성 및 유연성에 큰 영향을 미쳤습니다. 본 논문은 변이된 Axin2em1Fstl 대립유전자를 포함하는 Axin2-mTurquoise2 마우스 Wnt 리포터 모델로 얻은 데이터를 획득하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 광범위한 Wnt 활성에 걸쳐 개별 세포에서 내인성 표준 Wnt 신호 전달에 대한 연구를 용이하게 합니다.

이 프로토콜은 세포 표면 마커 또는 β-catenin 세포 내 염색과 결합된 조혈계의 세포 집단 분석을 사용하여 Axin2-mTurquoise2 리포터 활성을 완전히 평가하는 방법을 설명합니다. 이러한 절차는 다른 관심 조직 또는 세포에서 구현 및 증식을 위한 기초 역할을 합니다. 형광 활성화 세포 분류와 컨포칼 이미징을 결합하여 뚜렷한 표준 Wnt 발현 수준을 시각화할 수 있습니다. 권장되는 측정 및 분석 전략은 표준 Wnt 신호의 정확한 평가를 위해 형광 발현 수준에 대한 정량적 데이터를 제공합니다. 이러한 방법은 표준 Wnt 발현 패턴에 Axin2-mTurquise2 모델을 사용하려는 연구자에게 유용할 것입니다.

서론

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표준 Wnt 신호전달은 건강한 조직 항상성 및 질병과 관련된 보존된 신호 전달 경로입니다. Wnt 신호 수준의 정확한 조절은 배아 발달에 중요한 것으로 밝혀졌지만 성체 조직에서도 매우 중요합니다. 표준 Wnt 신호는 장, 피부 및 조혈계와 같은 여러 기관의 조직 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 Wnt 신호전달이 규제가 완화되면 심각한 병리가 발생합니다. 대장암, 간암, 피부암, 신경질환 및 특정 혈액 악성 종양은 조절되지 않은 Wnt 신호가 원인 요인 또는 기여자인 예시적인 병리학이다1. 따라서, 서로 다른 Wnt 표적에 대한 여러 억제제가 현재 Wnt 관련 암 치료제2로 임상 시험에서 테스트되고 있습니다.

또한, 신경학적 회복, 노화 관련 신경 장애 및 선천성 자폐 스펙트럼 장애에 대한 Wnt 치료 잠재력에 대한 흥미로운 발전이 이루어지고 있습니다 3,4,5. Wnt 신호는 후속 이식을 위한 줄기세포의

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프로토콜

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참고: 모든 생쥐 절차는 Leiden University Medical Center(LUMC) 동물 실험 윤리 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다. 수컷 및 암컷, 6-12주령, Axin2-mTurquoise2 리포터 구조체가 삽입되지 않은 야생형(wt), Axin2-murquoise2 리포터 구조체를 한 번 삽입한 이형접합성(Tg/0), 따라서 하나는 Axin2 유전자를 파괴하고, Axin2-mTurquoise2 리포터 구조체를 삽입한 동형접합적(Tg/Tg)은 두 대립유전자 모두에 Axin2-mTurquoise2 리포터 구조체를 삽입하여 두 개의 Axin2 유전자를 파괴했습니다. Axin2-mTurquoise2 마우스 (B6; CBA-Axin2em1Fstl/J 마우스)를 실험에 사용하였다. 동물은 장기 격리 전에 CO2 안락사에 의해 희생되었습니다. 절차 전반에 걸쳐 샘플이 빛에 노출되는 것을 최소화하고 달리 표시되지 않는 한 항상 얼음 또는 4°C에 보관하십시오. 샘플을 알루미늄 호일로 덮으십시오. 모든 단계는 생물 안전 작업대가 있는 표준 실험실에서 수행해야 합니다.

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결과

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표준 Wnt 신호전달의 역할을 조사하기 위해 Axin2-mTurquoise2 표준 Wnt 리포터 모델을 β-catenin 단백질 발현과 함께 테스트했습니다. 흉선세포는 취약하고, 흉선세포 성숙 과정의 여러 단계에서 낮은 표준 Wnt 신호를 보이며, 세포질 대 핵 비율이 낮은 것으로 알려져 있습니다. 이러한 모든 요인은 세포질 mTurquoise2 또는 β-catenin의 검출을 방해합니다. 프로토콜에 따라 흉선에서 쥐 Axin2-mTurquoise2 흉선세포를 수확하여 Axin2-mTurquoise2 및 total β-catenin의 유세포 분석 및 사이토스핀 공초점 분석(그림 1)을 위한 단일 세포 현탁액으로 처리했습니다.

유세포 분석은 다양한 흉선세포 성숙 단계의 특성화를 용이하게 하여 활성 표준 Wnt 신호전달을 위한 리포터 단백질로서 세포 서브세트당 mTurquoise2 형광색소의 존재를 측정합니다. Axin2-mTur.......

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토론

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여러 표준 Wnt 리포터는 리포터 민감도와 실제 리포터 단백질이 다른 상태로 사용할 수 있습니다. 합성으로 도입된 다중합체 TCF/LEF 결합 부위를 사용하는 리포터 모델은 형광 리포터 단백질과 함께 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 전이유전자의 반복은 육종 또는 장기간 의 생체 내 실험 동안에 손실될 수 있으며, 리포터 발현에 영향을 미치는 주변 게놈 서열로부터의 비-Wnt 신호에 민감할 수 있다. 따라서 가장 많이 사용되는 리포터는 살아있는 세포에서 사용하기 어려움에도 불구하고 이전 변이체인 Axin2-LacZ로 남아 있습니다.

Axin2-mTurquoise2 표준 Wnt 리포터 모델은 밝고 상대적으로 안정적인 형광 리포터 단백질의 단순성에도 불구하고 Axin2-LacZ와 동일한 리포터 신뢰성을 제공합니다. 이 청록색 변이체 형광 단백질은 장기 이미징에 유용하며 가장 일반적으로 사용되는 항체 형광.......

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업은 새로운 마우스 모델을 개발하기 위한 프로파일링 Area Regenerative Medicine을 위한 Leiden University의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BD FACScantoII 유세포 분석기BD Biosciences적용 불가일련 번호 V96300710. 이 프로토콜의 유세포 분석기 설정에는 505 longpass filter, 530/30 nm bandpass filter, 470/20 nm bandpass filter가 있는 405 nm laser line이 포함되어 있습니다. 735nm 장역통과 필터 및 780/60nm 대역통과 필터, 670nm 장역통과 필터 및 655nm 장역통과 필터, 610nm 장역통과 필터, 550nm 장역통과 필터 및 575/26nm 대역통과 필터, 505nm 장역통과 필터 및 530/30nm 대역통과 필터, 및 488/10nm 대역통과 필터가 있는 488nm 레이저; 735nm 장역 통과 필터 및 780/60nm 대역 통과 필터, 685nm 장역 통과 필터 및 660/20nm 대역 통과 필터가 있는 633nm 레이저 라인.
BSA이 시그마 A9647
코닝 70 μ M 세포 스트레이너 팔콘/코닝 352350
Cytospin 4 Type A78300101Thermo Scientific적용 불가 
DMSO시그마 알드리치 D5879-1L
DNAse I시그마 A9647
Falcon 50 mL 원추형 원심분리기 튜브Greiner bio-one227261
Falcon 라운드 바텀 폴리스티렌 테스트 튜브와 셀 여과기 스냅 캡Fisher Scientific 
태아 송아지 세럼 (FCS)Greiner Bio-One B.V. 적용 가능하지 않음 원산지에 따라 다름
피지 소프트웨어 ImageJ선택 불가 버전 1.53
필터 카드 화이트 (사이토스핀용)VWRSHAN5991022
FlowJo 10 소프트웨어Treestar비적용 가능 버전 10.5.3
프로스트 슬라이드 Klinipath
Gibco IMDM 매체 피셔 사이언티픽 
HCX PL APLO 40x 1.4 오일 렌즈Leica 마이크로시스템 적용 가능하지 않음 
소수성 펜: Omm Edge 펜 벡터를 적용할 수 없음 
라이카 TCS SP5 DMI6000라이카 마이크로시스템 적용 가능하지 않음 이 프로토콜의 현미경 설정은 8비트 해상도, 1024 픽셀 x 1024 픽셀, 400Hz 속도, 핀홀 68 및 마이크로의 HCX PL APO 40x/1.2 오일 이멀젼 대물렌즈로 구성되었습니다. m, 실온에서 확대/축소 계수 1.5. 이 시스템에는 405 다이오드 레이저, 아르곤 레이저, DPSS 561 레이저, HeNe 594 레이저 및 HeNe 633 레이저와 4개의 하이브리드 검출기(HyD) 및 5개의 광전자 증배관(PMT)이 포함되어 있습니다.
메탄올 VWR1060091000
NaN3/sodium azide병원 농장불가 
일반 마우스 혈청자체 마우스aplicable 
PBS LonzaBE17-517Q
ProLong 다이아몬드 안티페이드 마운트런트 피셔 과학 P36965
정제된 마우스 항-베타;-카테닌 (CTNNB1)BD Biosciences610154
TO-PRO-3 요오드ThermofisherT3605
어떤 약국에서도투명 네일폴리적용 불가 
트윈-20시그마 알드리치 P1379-500ml 
zenon Alexa Fluor 568 마우스 IgG1 라벨링 키트ThermofisherZ25006
35223512440053싱

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kahn, M. Can we safely target the WNT pathway. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (7), 513-532 (2014).
  2. Jung, Y. S., Park, J. I. Wnt signaling in cancer: therapeutic targeting of Wnt signaling beyond beta-catenin and the destruc....

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