방법 논문

이동식 XY 단계가 있는 플랫폼 인큐베이터: 단백질의 세포 내 빠른 광화학 산화 를 구현하기위한 새로운 플랫폼

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DOI:

10.3791/62153

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2021년 5월 17일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Maryland Baltimore, 2Technology Research Center, University of Maryland Baltimore County, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts

이 논문에서

요약

새로운 정적 플랫폼은 단백질의 세포 내 빠른 광화학 산화(IC-FPOP)라고 불리는 단백질 발자국 기술을 활용하여 네이티브 세포 환경에서 단백질 구조 및 상호 작용 부위를 특성화하는 데 사용됩니다.

초록

질량 분광법(MS)과 결합된 단백질(FPOP)의 빠른 광화학 적 산화는 용매 접근성의 함수로서 단백질 상호 작용, 구조 및 단백질 형성 역학을 심문하는 구조적 프로테오믹스에서 귀중한 도구가 되었습니다. 최근에는 하이드록실 라디칼 단백질 풋 프린팅(HRPF) 기술인 FPOP의 범위가 살아있는 세포 배양에서 단백질 라벨링으로 확장되어 복잡한 세포 환경에서 단백질 상호 작용을 연구할 수 있는 수단을 제공하고 있다. 세포 내 단백질 수정은 세포 내의 모든 단백질 복합 형성을 수반하는 리간드 유도된 구조적 변화 또는 형태 변화에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 단백질 발자국은 관례적인 유량 기반 시스템과 248nm KrF 엑시머 레이저를 사용하여 과산화수소의 광분해를 통해 하이드록실 라디칼을 산출하여 한 세포 샘플에 대해 20분의 분석이 필요합니다. 시간 해결 FPOP 실험을 용이하게 하기 위해 새로운 6웰 플레이트 기반 IC-FPOP 플랫폼의 사용이 개척되었습니다. 현재 시스템에서 단일 레이저 펄스는 FPOP 실험 시간 프레임을 잘 하여 20초의 분석 시간, 60배 감소의 결과로 잘 릿비한 하나의 레이저 펄스를 조사합니다. 이러한 분석 시간이 크게 감소하면 생화학 적 신호 캐스케이드, 단백질 접이식 및 차동 실험 (즉, 약물 이없는 약물 바인딩)과 같은 세포 메커니즘을 시간 의존적 방식으로 연구 할 수 있습니다. 이동식 XY 스테이지(PIXY)가 장착된 플랫폼 인큐베이터라는 제목의 이 새로운 계측기를 통해 사용자는 온도, CO2 및 습도 제어가 가능한 플랫폼 인큐베이터를 사용하여 광학 벤치에서 셀 배양 및 IC-FPOP를 직접 수행할 수 있습니다. 이 플랫폼에는 레이저 빔 가이던스를 위한 포지셔닝 스테이지, 연동 펌프 및 미러 광학도 포함되어 있습니다. 광학 구성, 유량, 일시적인 과도 및 PIXY의 H2 O2농도와 같은 IC-FPOP 조건이 최적화되고 피어 검토를 했습니다. 시스템의 모든 구성 요소를 자동화하면 사람의 조작을 줄이고 처리량을 늘릴 수 있습니다.

서론

단백질 발자국 기술은 단백질의 조직에 대한 심오한 정보를 드러낼 수 있습니다. 이러한 필수 구조 생물학 MS 기반 기술은 질량 분석 도구 상자의 구성 요소입니다. 이들방법은1, 2,3,4를통해 단백질 고차 구조(HOS) 및 시너지 효과를조사한다. 단백질(FPOP)의 빠른 광화학 산화는 하이드록실 라디칼을 사용하여 아미노산5,6(표 1)의용매 접근 측면 사슬을 산화적으로 수정합니다. 이 방법은 과산화수소(H2 O2)의광분해를 위해 248nm에서 엑시머 레이저를 사용하여 하이드록실 라디칼을 생성한다. 이론적으로, 20개의 아미노산 중 19개는 Gly가 외로운 예외인 것으로 산화적으로 변형될 수 있다. 그러나, 하이드록실 라디칼을 가진 아미노산의 다양한 반응성 비율로 인해, 이들의 단지 하위 집합의 변형은 실험적으로 관찰되었습니다. 그러나, 상기 방법은 단백질 서열5의길이에 걸쳐 분석할 가능성이 있다. FPOP는 마이크로초 타임 스케일에서 단백질을 수정하여 빠른 오프 속도와약한 상호 작용을 연구하는 데 유용합니다. 용매 접근성은 리간드 결합 또는 단백질 형성의 변화에 따라 변화하므로, 방법의 힘은 여러 주에서 단백질의 라벨링 패턴의 비교에 있다(즉, 리간드 바운드에 비해 리간드 프리). 그 결과, FPOP는 단백질-단백질 및 단백질-리간드 상호작용 부위 및 규형 변화7,8,9,10의영역을 식별하는 데 성공했다. FPOP 방법은 정제된 단백질 시스템의 연구에서 세포 내 분석으로 확장되었습니다. 세포 내 FPOP(IC-FPOP)는 세포내 천 단백질 이상을 산화적으로 변형하여 프로테오메11,12에걸쳐 구조적 정보를 제공할 수 있다. 기존의 IC-FPOP 플랫폼은 레이저 빔을 지나 셀 단일 파일을 흐르는 유량 시스템을 활용합니다. 이 시스템의 개발은 개별 세포가 레이저 조사에 동등한 노출을 허용하는 것을 허용했습니다. 이로 인해 산화적으로 표지된단백질(12)의수가 13배 상승했다. 그러나, 유량 시스템의 제한은 10분 조사 간격으로 구성된 단일 샘플 실험의 길이이며, 그 동안 수정이 이루어지고 추가10분 세척 주기가 이루어진다. IC-FPOP의 시간 제약은 생화학 신호 캐스케이드의 상호 작용 네트워크 사이에 존재하는 짧은 수명 단백질 접이식 중간체 또는 변경을 연구하기에 적합하지 않습니다. 이러한 시간적 제한은 더 높은 처리량을 갖춘 새로운 IC-FPOP 플랫폼의 설계에 영감을 주어.

네이티브 셀 환경에서 단백질 고차 구조를 정확하게 측정하기 위해 새로운 설계를 통해 레이저 플랫폼에서 직접 세포 배양을 수행할 수 있으므로 IC-FPOP가 높은 처리량을 가능하게 합니다. 이 설정은 또한 부착 된 세포가 기판에서 제거되어야하는 흐름을 사용하여 IC-FPOP와는 달리 세포 환경에 대한 경구를 최소화 할 수 있습니다. 새로운 플랫폼은 IC-FPOP가 CO2 및 온도 제어 단계 상단 챔버를 사용하여 멸균 인큐베이션 시스템에서 발생하도록 허용하면서 레이저 빔 안내를 위한 구성된 미러 광학, XY 모션을 위한 포지셔닝 시스템 및 화학 물질 교환용 연동 펌프를 활용합니다. IC-FPOP을 수행하기위한 새로운 플랫폼은 이동식 XY 단계 (PIXY)와플랫폼 인큐베이터 (그림 1)입니다. PIXY에서 IC-FPOP는 플랫폼 인큐베이터 챔버 내에서 6웰 플레이트에서 재배된 인간 세포에서 수행됩니다. 이러한 구성을 위해 레이저 빔은 빔 호환 거울을 사용하여 플레이트에 하향 반사되어 인큐베이터를 보유하는 위치 단계로서 XY 평면에서 이동하므로 레이저 빔은 전략적으로 정렬되어 한 번에 하나만 조사하도록 조정됩니다. 유효성 검사 연구에 따르면 IC-FPOP는 유동 시스템보다 PIXY에서 더 빠르게 수행될 수 있으며 단백질당 아미노산 변형이 증가합니다. 이 새로운 IC-FPOP 플랫폼의 개발은 셀룰러실험13에서얻을 수있는 지식을 설명합니다.

프로토콜

1. 이동식 XY 단계와 플랫폼 인큐베이터의 조립

참고: 새로운 플랫폼에는 인큐베이션 시스템, 포지셔닝 스테이지 및 컨트롤러, 연동 펌프, 248nm KrF 엑시머 레이저 및 제국 광학 브레드보드에 조립된 광학 거울이 포함됩니다.

  1. 인큐베이션 시스템을 조립: 온도 단위, 이산화탄소 단위, 가습기, 공기 펌프, 터치 모니터링 시스템(그림2A-E).
    참고: 자세한 어셈블리 지침은 제조업체에서 제공합니다. 인큐베이션 시스템은 인큐베이터 내에서 세포를 성장시키기 전에 5% CO2,37°C 및 습도 85%로 안정화되어야 합니다. 이러한 매개 변수는 세포주에 따라 달라질 수 있다.
  2. 사용자 정의 6웰 플레이트 인큐베이터, 나노 위치 구동 스테이지 및 XY 드라이브 스테이지를 조립합니다. 전자 나사는 각각 후자에 나사.
    참고: 제조업체에서 제공하는 자세한 어셈블리 지침입니다.
  3. RS-232 케이블을 통해 "데이지 체인" 시퀀스에 4개의 연동 펌프를 RS-232와 제어 컴퓨터에 연결된 USB 케이블에 연결합니다. 각 펌프 채널 롤러의 모든 채널에 3.18mm ID 폴리머 튜브(예: 타이곤)를 연결합니다.
    참고: 각 펌프에는 4개의 롤러가 있습니다. 롤러의 방향과 유량은 수동으로 조작됩니다.
  4. 각 3.18mm ID 폴리머 튜브의 끝에 1/16" x 1/8" 커넥터를 삽입합니다. 커넥터의 1/16'끝을 1.59 ID 폴리머 튜브에 삽입한 다음 사용자 지정 포트를 통해 인큐베이터에 폴리머 튜브를 삽입합니다. IC-FPOP 실험 중에 주입될 용액에 튜브의 다른 끝을 배치합니다.
    참고: 관류 라인의 경우 인큐베이터는 사용되는 모든 시약을 수용하기 위해 주변 의 튜브 라인에 대한 36 개의 사용자 정의 포트가 있습니다.
  5. Ø2용 운동용 미러 마운트 내에 50mm, 248nm, 45° 엑시머 레이저 라인 미러를 스크류하여 248nm 레이저 조리개에서 10-11 그리드 포인트의 브레드보드로 광학합니다. 두 번째 미러를 90° 각도로 인큐베이터의 반대편에 있는 첫 번째 미러에 놓습니다. 두 번째 미러를 약 45°에서 아래쪽으로 각도하여 레이저 빔 가이던스를 인큐베이터(도2F-J)로조정합니다.

2. 통합 소프트웨어를 통한 시스템의 동기화 및 초기 자동화

  1. 드라이버와 펌프를 제어하는 데 필요한 최신 버전의 통합 소프트웨어를 설치합니다.
  2. 펌프 매뉴얼을 참조하면 '5'로 시작하여 펌프의 이름을 변경하여 가치가 증가합니다. 통합 소프트웨어의 수동 제어 하위 프로그램을 사용하여 명령을 펌프 시스템으로 보낼 수 있습니다.
    참고: 펌프를 채널 모드로 설정하면 펌프 명명 규칙이 4개의 펌프 채널에 해당하는 세트, 1, 2, 3 및 4로 자동으로 변경됩니다.
  3. 플랫폼 인큐베이터의 자동화를 위한 통합 소프트웨어 프로그램을 엽니다.
  4. 펌프용 Comport라는연결 드롭다운 메뉴에서 펌프 시스템 USB 케이블에 대응하는 적절한 USB 컴포트 장치 이름(예: COM4)을 선택합니다.
  5. 스크립트 빌더 버튼을 클릭하여 자동화된 플랫폼 인큐베이터 플랫폼에 대한 스크립트를 편집/생성합니다. 스크립트 저장을 클릭하여 시퀀스를 텍스트 파일로 저장합니다(그림3A).
    참고: 스크립트 빌더는 펌프 수, 방향, 속도, 볼륨, 튜브 직경, 채널 모드 및 시간 지연의 정의로 스크립트를 정의하는 사용자 인터페이스를 가지고 있습니다.
  6. 스크립트 를 만드는 데 채널 모드를 원하는 경우 스크립트의 단계는 펌프를 채널 모드 안팎으로 변경하는 데 전념해야 하며 펌프 채널에 해당하는 다음 단계는 펌프 1-4로 레이블을 지정해야 합니다.
    참고: 이렇게 하면 플랫폼 인큐베이터 스크립트 중에 두 개의 펌프가 채널 모드로 동시에 들어가지 못하고 명령이 필요한 채널로 전송된 후 각 펌프가 레거시 모드로 다시 전환됩니다.
  7. 스크립트 읽기 버튼을 클릭하고 플랫폼 인큐베이터 작업에 원하는 적절한 스크립트 파일을 선택합니다.
  8. 실행 시퀀스 버튼을 ON 위치(녹색)로 전환하여 스크립트를 실행한 다음 시작 버튼(그림 3B)을클릭합니다.

3. 플랫폼 인큐베이터에서 셀을 성장

참고: 세포는 실험 전날 세포 배양 후드의 멸균 조건하에서 플랫폼 인큐베이터에 배치되어야 합니다.

  1. 나노 위치 단계에서 플랫폼 인큐베이터를 풀고 온도, 가스 및 가습기 라인을 분리합니다. 인큐베이터를 70%에탄올로 분사한 후 세포 배양 후드에 놓습니다.
  2. 전송하기 전에 T-175에서 약 80-90%의 합류로 세포를 성장시면 됩니다.
    참고: 용어 인플루엔성은 세포 배양 접시 또는 플라스크에서 세포의 수/커버리지를 측정하여 사용됩니다.
  3. 미디어를 제거하고 버퍼로 헹도 됩니다.
  4. 제조업체의 프로토콜을 사용하여 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 분리합니다.
  5. 8mL의 미디어로 다시 중단하고 셀을 계산합니다.
  6. 종자 fibronectin/콜라겐14 코팅 6 웰 플레이트와 약 90-95 μL 각 우물에서 재중단 된 세포. 이 부피는 다음 날 각 우물에서 80-90 %의 합류 (~120 만 개의 세포)를 달성하는 것이 적절할 것입니다.
    참고: 6웰 플레이트는 파종 전에 콜라겐으로 코팅해야 합니다. IC-FPOP 동안 사용되는 시약은 빠른 유량으로 주입됩니다. 코팅 된 플레이트는 시약의 주입으로 인해 세포가 조기에 분리되지 않도록합니다.
  7. 시드 플레이트를 플랫폼 인큐베이터에 넣고 석영 뚜껑으로 덮습니다.
    참고: 설계 및 개발 중에 유리 인큐베이터 뚜껑이 석영으로 변경되어 자외선 레이저 조명과 호환됩니다.
  8. 나노 포지셔닝 드라이브 스테이지에서 플랫폼 인큐베이터를 교체하고 보호합니다. 온도, 가스 및 가습기 라인을 다시 연결합니다.
  9. 세포가 하룻밤 사이에 합류로 자도록 하십시오.
    참고: 다음 세포 배양 단계는 선택 사항이며 인간 세포가 일시적으로 과도하게 감염된 실험을 위한 것입니다. 이 단계는 세포 배양 조건하에서 경질 효율을 평가합니다.
  10. 기메라 단백질 GCaMP2에 대한 유전자를 함유하는 플라스미드를 HEK 293 세포로 배분하여 상업적 양이온지질 경질 키트를 사용한다.
  11. HEK293T 세포에서 GCaMP2의 일시적인 과도 연동을 두 개의 6웰 플레이트로 수행한다.
  12. 플랫폼 인큐베이터에 6웰 플레이트 1개, 표준 CO2 인큐베이터에서 두 번째 6웰 플레이트를 배양합니다.
  13. 형광 현미경을 사용하여 형광 이미징을 통해 각 플레이트 내의 경질 효율을 비교합니다.

4. 담금질 버퍼와 H2O2 만들기

  1. 125mM N-tert-butyl-α-페닐니트론(PBN) 및 125mMN, N'-디메틸티우레아(DMTU)를 함유한 담금질 버퍼 100mL를 만드십시오.
    참고 : DMTU및 PBN은 자유 라디칼 청소부이며 세포 투과성입니다.
  2. H2O2 ~ 200 mM희석. 각 샘플은 H2O2의 6mL이 필요하며 각 우물의 바닥에 있는 셀층을 완전히 침수합니다.
    참고 : 담금질 버퍼는 전날 만들어지고 빛으로부터 보호 된 하룻밤 사이에 4 °C에 저장됩니다. 실험 당일 H2O2를 희석시희석한다.

5. IC-FPOP용 플랫폼 인큐베이터 설정

참고: 플랫폼 인큐베이터는 멸균 조건하에서 조립해야 합니다. 멸균 세포 배양 후드에 인큐베이터를 조립한다.

  1. 플랫폼 인큐베이터를 포지셔닝 단계에서 풀고 온도, 가스 및 가습기 라인을 분리합니다.
  2. 인큐베이터를 70%에탄올로 분사한 후 세포 배양 후드에 놓습니다.
  3. 플랫폼 인큐베이터에서 6웰 플레이트를 제거하고 플레이트의 원래 뚜껑을 고정하고 현미경을 사용하여 세포 의 합류를 확인합니다.
  4. 세포 결합이 확인된 후, 6웰 플레이트를 세포 배양 후드 내부의 플랫폼 인큐베이터에서 다시 컨플루언셀로 교체한다.
  5. 임베디드 포트를 통해 각 웰에 3개의 프리컷(15cm) 1.59 ID 폴리머 튜브를 삽입한다. 튜브를 우물 벽에 플러시하고 사용자 정의 3D 인쇄 링으로 유지합니다.
    참고: 6 33mm PLA 필라멘트 3D 인쇄 링은 세포를 방해하거나 레이저 펄스의 방해없이 플레이트의 벽에 튜브를 고정하도록 맞춤 설계되었습니다.
  6. 석영 뚜껑으로 플랫폼 인큐베이터를 덮습니다. 포지셔닝 시스템에서 스테이지 상단 인큐베이터를 교체하고 보호합니다. 온도, 가스 및 가습기 라인을 다시 연결합니다.
  7. 1/16x1/8" 커넥터의 1/16"끝에 1.59 ID 폴리머 튜브를 연결합니다.

6. 플랫폼 인큐베이터에서 IC-FPOP 수행

  1. 펌프 인출을 위해 통합 소프트웨어 스크립트를 준비합니다. 하나의 연동 펌프(펌프 8)를 사용하여 6개의 우물에서 셀 미디어를 완전히 제거합니다.
  2. 다른 세 개의 연동 펌프(펌프 5-7)의 각 채널에서 프라임 용매. 시약이 인큐베이터 포트에 도달할 때까지 H2O2및 담금질 버퍼를 각각 의 교대 튜브에 주입합니다.
  3. 레이저 빔이 거울에 의해 올바르게 기울어져 있고 무단으로 인큐베이터에 도달하는지 확인합니다.
    참고: 레이저 안전 고글은 레이저를 사용할 때마다 착용해야 합니다. 앵글링/정렬 프로세스 중에 세포를 조기에 조사하지 마십시오. 빔을 정렬할 때 골판지를 사용하여 석영 뚜껑을 완전히 덮습니다. 또한 6웰 플레이트의 백서에 인쇄된 윤곽선을 사용하여 레이저 빔이 각 우물의 중앙에 부딪히고 있는지 확인합니다. 정렬을 위해 가장 낮은 주파수와 에너지로 연속 펄스 설정을 사용합니다.
  4. 외부 센서를 사용하여 레이저 에너지를 확인합니다. 50Hz 및 27kV에서 160mJ의 단일 레이저 펄스를 사용합니다.
    참고: 다음 단계에타이머가 필요합니다.
  5. 빔 정렬을 확인한 후 펌프 주입을 위한 통합 소프트웨어 스크립트를 준비합니다.
  6. 타이머를 시작하고 통합 소프트웨어 펌프 스크립트의 시작 버튼을 동시에 누릅니다.
  7. 첫 번째 우물 (타이머에 6-10 초 마크)에 35 mL / 분에 200 mM H2O2를 주입합니다.
    참고: 펌프가 주입되기 시작하기 전에 5초 지연이 있습니다. 또한 펄스가 트리거되기 전에 레이저7초가 걸립니다. 레이저 펄스는 H2O2 주입 직후에 와야합니다.
  8. 5초 마크에서 레이저 소프트웨어의 시작 버튼을 눌러 타이머의 11초 마크에서 펄스를 트리거합니다.
  9. 레이저 펄스 직후 첫 번째 우물에 35 mL /min에서 125 mM 담금질 용액을 주입하십시오. 위치 지정 단계를 수동으로 이동하여 다음 단계를 레이저 빔과 잘 정렬합니다.
  10. 각 우물이 처리될 때까지 위의 단계 6.5-6.9를 반복합니다.
    참고: IC-POP는 3개의 레이저 및 3개의 비레이저 샘플의 기술적 삼중에서 수행됩니다. 하나의 처리 된 6 웰 플레이트는 하나의 생물학적 복제 역할을한다.
  11. 세포 배양 후드에서 세포 스크레이퍼를 사용하여 각 우물에서 개별 15 mL 원문 튜브로 세포를 전송합니다. 원심 분리기 세포는 5 분 동안 1,200 x g에서.
  12. RIPA 리시스 버퍼의 100 μL에서 상체를 버리고 셀을 다시 중단합니다.
  13. 개별 1.2 mL 폴리 프로필렌 튜브로 세포를 전송합니다.
  14. 플래시는 액체 질소에 있는 모든 견본을 동결하고 사용될 때까지 -80°C 냉동고에 두습니다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.

7. 단백질 추출, 정제 및 프로테오리시스

  1. 시료와 열을 95°C에서 5분간 열로 해동합니다.
  2. 가열 후 얼음을 5분간 식힙니다.
  3. 세포 용해에 25 단위의 핵을 추가하여 단일 좌초, 이중 좌초, 선형 및 원형 DNA 및 RNA를 저하시키고 방 온대에서 15 분 동안 배양하십시오.
  4. 원심분리기 샘플은 4°C에서 10분 동안 16,000 x g의 샘플입니다.
  5. 상체를 수집하고 깨끗한 폴리 프로필렌 튜브로 전송합니다.
  6. 색인 단백질 분석법을 사용하여 단백질 농도를 확인하십시오.
  7. 100 μg의 시료를 깨끗한 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 셀 리시스 버퍼로 100 μL로 가져옵니다.
  8. 50°C에서 10mM 디티오트레이톨(DTT)으로 샘플을 45분간 줄입니다.
  9. 실온에서 10분 동안 시료를 식힙니다.
  10. 실온에서 50mM 요오도아세타미드(IAA)를 20분 동안 사용할 수 있습니다.
    참고: 빛으로부터 IAA 보호
  11. 미리 냉각된(-20°C) 아세톤을 460 μL에 추가합니다. 소용돌이 샘플 및 하룻밤 -20 °C에서 배치합니다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
  12. 다음날 원심분리기 샘플은 4°C에서 10분 동안 16,000 x g로 샘플링됩니다.
  13. 단백질 펠릿을 방해하지 않고 아세톤을 제거하십시오.
  14. 90% 미리 냉각된(-20°C) 아세톤의 50 μL을 추가합니다. 소용돌이 샘플을 혼합하고 4 °C에서 추가 5 분 동안 16,000 x g에서 원심분리기를 혼합합니다.
  15. 아세톤을 제거하고 2-3 분 동안 샘플을 건조하게하십시오.
  16. 10m Tris 버퍼 pH 8로 단백질 펠릿을 재차 판하합니다.
  17. 10m Tris 버퍼 pH 8의 40 μL에서 MS 등급 트립신(20 μg 스톡)을 재차 중단하고 각 샘플에 2.5 μg의 트립신을 추가합니다.
  18. 하룻밤 사이에 37°C에서 샘플을 배양합니다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
  19. 색염 펩티드 분석법을 사용하여 펩티드 농도를 평가한다.
  20. 5% 포믹산으로 샘플을 담금질합니다.
  21. 깨끗한 폴리 프로필렌 튜브에 샘플 10 μg를 전송합니다.
  22. 진공 원심분리기를 사용하여 시료를 건조시키고 물 속에서 MS 등급 0.1% 포름산(FA)의 20 μL로 재연합니다.
  23. 각 샘플을 사전 슬릿 캡으로 자동 샘플러 바이알을 청소하도록 전송합니다.

8. 고성능 액체 크로마토그래피 - 탠덤 질량 분광법 (LC-MS / MS)

  1. FPOP 수정을 국소화하려면 LC-MS/MS 분석을 사용하여 소화된 셀 용양을 분석합니다.
  2. 물(A)에서 0.1%, 아세토닐(ACN)(B)에서 0.1%의 FA를 사용합니다.
  3. 180 μm x 20mm C18(5 μm 및 100Å) 트래핑 컬럼에 샘플 0.5 μg를 적재하고 15분 동안 99%(A) 및 1%(B)로 컬럼을 세척합니다.
  4. 75 μm x 30cm C18(5 μm 및 125Å) 분석 컬럼을 사용하여 120분 동안 0.300 μL/min의 유량으로 소화된 펩타이드를 분리한다.
  5. 다음과 같이 LC 그라데이션 실행 : 0-1 분, 3 % 용매 B; 2-100 분, 10-45% B;100−110 분, 45-100% B; 110-115 분, 100 % B.
  6. 115-116분에서 3%(B)로 컬럼을 재조정하고 116-120분에서 3%(B)로 유지합니다.
  7. 나노 전기 분무 이온화와 긍정적 인 이온 모드에서 용출 된 펩티드를 분석하십시오.
  8. 60,000의 해상도로 m/z 스캔 범위인 375-1500을 통해 MS1 스펙트럼을 획득하십시오.
  9. 자동 게인 제어(AGC) 대상을 5.0e5로 설정하고 최대 주입 시간은 50ms 및 5.0e4 강도 임계값입니다.
  10. 충전으로 전구체 이온을 분리하여 1.2m/z의 격리 창과 4초의 사이클 시간으로 DDA(데이터 종속 획득)를 통해 2-6을 기록합니다.
  11. 고에너지 충돌 해리(HCD)(32% 정규화된 에너지)에 대한 대상 MS2 이온.
  12. 1 MS/MS 획득 후 펩티드를 60초 동안 제외합니다.
  13. 5.0e4의 AGC 목표와 35ms의 최대 주입 시간으로 MS/MS 해상도를 15,000으로 설정합니다.

9. 프로테오메 검색기/데이터 처리

  1. 관련 호모 사피엔스 단백질 데이터베이스에 대해 사용 가능한 상향식 프로테오믹스 분석 소프트웨어에서 탠덤 원시 데이터 파일을 검색하고 효소를 소화합니다.
  2. 단백질 분석 검색 매개 변수를 설정합니다.
  3. 조각 허용 오차를 0.02 Da로 설정하고 부모 이온 허용 오차를 10 ppm으로 설정합니다.
  4. 효소 특이성을 트립신에 설정하고 하나의 놓친 분열을 허용합니다.
  5. 질량 범위를 375-1500 m/z로 설정합니다.
  6. 95%(중간)와 잔류율 신뢰도99%(높음)로 펩타이드 신뢰도를 확립한다.
  7. 적어도 2개의 뚜렷한 펩티드가 5% 발견율(FDR) 필터로 확인되면 단백질을 받아들인다.
  8. 카바미도메틸화를 정적 수정으로 설정하고 모든 알려진 하이드록실 라디칼 사이드 체인수정(15,16)을 동적 수정으로 설정합니다.
  9. 파일이 완료되면 파일검색, 내보내기 서열, 수정 위치, 단백질 가입, 스펙트럼 파일, 전구체 풍부 성 및 보존 시간 정보를 전자 데이터베이스로 제공합니다.
  10. 이 방정식에서 펩타이드 또는 잔류물당 수정 정도를 계산합니다.
    figure-protocol-1
    참고: EIC 영역수정은 산화변형을 통해 펩타이드 또는 잔류물의 추출된 이온 크로마토그래피 영역(EIC)이며, EIC 영역은 산화변형 유무에 관계없이 동일한 펩타이드 또는 잔류물의 총 면적이다. 시간이 지남에 따라 과산화수소가 있는 단백질은 산화되어 배경 산화가 발생합니다. 수정 범위를 계산하기 위해, 수정된 펩티드의 면적은 전체 영역으로 나뉩니다. 조사되지 않는 제어 샘플은 백그라운드 산화를 위해 기록됩니다. 제어 샘플에서 의 배경 산화는 FPOP 수정을 식별하기 위해 레이저 처리 샘플에서 빼낸다.

결과

플랫폼 인큐베이터 조건이 레이저 플랫폼에서 세포 배양에 충분한지 확인하기 위해 GCaMP2는 혈전 293T로 일시적으로 전환되었고 두 플레이트모두에 대한 경질 효율을 형광이미징(도 4A)을통해 평가하였다. GCaMP2는 유전자 로 인코딩된 세포내 칼슘 지표로 사용되는 칼슘 감지 형광 단백질입니다. 그것은 녹색 형광 단백질 (GFP)과 칼슘 결합 단백질, 칼모둘린의 융합이다. 체형 분석체는 혈소판 프롤-TK로 감염된 HEK 293세포(도 4B)에서수행되었다. 이러한 결과는 플랫폼 인큐베이터가 표준 인큐베이터의 성능을 1.13배 증가하여 최적의 세포 배양 환경에 대한 정량적 벤치마크를 제공한다는 것을 보여줍니다.

유량 시스템에 표지된 HEK293T 세포에서FPOP 변형은 플랫폼 인큐베이터에 표시된 세포와 비교하여 플랫폼 인큐베이터가 변형된 단백질 수(도5)와그 단백질의 총 FPOP 커버리지 모두에서 유량 시스템을 능가하는 것으로 나타났다. 플랫폼 인큐베이터에서 획득한 FPOP 변형 단백질의 수는 일반적인 실험에서 획득한 단백질보다 약 1051, 2.2배 더 많았다. 수정은 각 실험에 대한 두 개의 생물학적 복제 사이에 결합되었다. 또한 PIXY는 더 높은 처리량을 제공합니다.

단백질 전반에 걸쳐 더 높은 변형 커버리지의 이점을 입증하기 위해, IC-FPOP 수정은 펩티드 수준에서 국소화되었고, 변형의 정도는 액틴, 375 아미노산 단백질사이의 결과 차이를 구별하기 위해 정량화되었다. 유동 시스템에서, 2개의 수정된 펩타이드가 검출되어 제한된 구조정보(도 6A)를제공한다. 그러나, 액틴 서열을 아우르는 5개의 수정된 펩타이드는 플랫폼 인큐베이터에서 검출되었다. 탠덤 질량 스펙트럼은 잔류물 Pro322가 각각의 실험에서 모두 수정및 검출되었음을나타낸다(도 6B). 플랫폼 인큐베이터 샘플에서 수정된 5개의 펩타이드는 12개의 변형된 잔류물을 포함하고 있으며, 유량계통(도 6C)으로4개의 잔류물만 수정하였다. 산화 적용 범위의 증가는 단백질 전반에 걸쳐 더 많은 구조적 정보를 제공합니다.

Espino 등은 C. 엘레간내에서 생체 내에서 수행되는 FPOP의 용량을 입증, 인간 질환 상태에 대한 웜 모델(17). IV-FPOP은 유동 시스템을 통해 수행되지만 PIXY 시스템은 웜과의 호환성을 테스트했습니다. 약 10,000개의 벌레가 20°CLC-MS/MS 분석에서 플랫폼 인큐베이터에서 각각 의 우물에서 배양되었다. 이러한 결과는 2D 세포 배양 외에도, 이 새로운 방법론은 또한 C. elegans와같은 그밖 생물학 시스템의 연구 결과와 호환된다는 것을 보여줍니다.

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그림 1. PIXY 시스템의 회로도. 시스템 구성 요소: (a)단계-상단 인큐베이터,(B)포지셔닝 시스템,(C)연동 펌프,(D)관류 라인. 세포 배양 매체는 H 2O 2전에 펌프를 통해 각 우물에서 제거되고 담금질 용액은 계산된 시점에서 주입됩니다. 조사를 위한 레이저 경로는 흰색으로 전시되었습니다. 존슨, D. T., 펀숀 스미스, B., 에스피노, J. A., 게르센슨, A., 존스, L.M., 이동식 XY 스테이지와 플랫폼 인큐베이터에서 단백질의 인셀 빠른 광화학 산화 구현의 허가로 재인쇄. 분석 화학, 92 (2), 1691-1696 2019. 저작권 2020 미국 화학 협회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2. 완전히 조립된 PIXY 시스템. (A)터치 모니터링 시스템,(B)이산화탄소 단위,(C)온도 단위,(D)공기 펌프,(E)가습기,(F)광학 거울,(G)플랫폼 인큐베이터,(H)포지셔 스테이지,(I)248nm KrF 엑시머 레이저 및(J)내연 펌프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3. 연동 펌프의 자동화. (A)LABVIEW의 예제 명령 스크립트. 명령 옵션에는 볼륨, 유량, 일시 정지, 흐름 방향이 포함됩니다. 속도, 단계 거리 및 위치는 현재 자동화되고 있습니다. (B)LABVIEW의 스크립트 리더. 여기서 명령 스크립트가 업로드된 다음 시퀀스를 실행하고 시작을 눌러 펌프를 시작합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4. HEK 세포 형질 변환 효율. (A)표준 인큐베이터(Control)와 스테이지 탑 인큐베이터(PIXY)의 GCaMP2 형광 비교의 평균 형광 강도. 점과 사각형은 측정값을 취한 우물의 각 점을 나타냅니다. (B)다른 벡터 플라스미드, pRL-TK로 배설 효율수량 및 검증. P-값< 0.005. 존슨, D. T., 펀숀 스미스, B., 에스피노, J. A., 게르센슨, A., 존스, L.M., 이동식 XY 스테이지와 플랫폼 인큐베이터에서 단백질의 인셀 빠른 광화학 산화 구현의 허가로 재인쇄. 분석 화학, 92 (2), 1691-1696 2019. 저작권 2020 미국 화학 협회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5. 단세포 유량 시스템 및 PIXY에서 변형된 단백질의 비교. 유동 시스템(보라색)과 PIXY(녹색)에서 사용하여 변형된 단백질의 벤 다이어그램. 존슨, D. T., 펀숀 스미스, B., 에스피노, J. A., 게르센슨, A., 존스, L.M., 이동식 XY 스테이지와 플랫폼 인큐베이터에서 단백질의 인셀 빠른 광화학 산화 구현의 허가로 재인쇄. 분석 화학, 92 (2), 1691-1696 2019. 저작권 2020 미국 화학 협회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6. IC-FPOP 수정의 지역화. 시스템 간의 IC-FPOP 수정 을 비교합니다. (A)유동시스템(purple) 대 플랫폼 인큐베이터(green)로부터 액틴 내에서 산화적으로 변형된 펩티드의 바 그래프. (B)탄뎀 MS 스펙트럼(펩티드 316-326) 시스템 및 수정되지 않은 액틴 펩타이드(C) FPOP 변형액트 잔류물(PDB: 6ZXJ, 체인 A 11개 수정된 잔류물 플랫폼 인큐베이터(green), 3개 수정된 잔류물(purplelapi)의 변형된 잔류물(보라색)의 잔류물(purplelapi)의 잔류물(purplelapi)의 잔류물(purplelap)을 과열한다. 존슨, D. T., 펀숀 스미스, B., 에스피노, J. A., 게르센슨, A., 존스, L.M., 이동식 XY 스테이지와 플랫폼 인큐베이터에서 단백질의 인셀 빠른 광화학 산화 구현의 허가로 재인쇄. 분석 화학, 92 (2), 1691-1696 2019. 저작권 2020 미국 화학 협회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7.  C. 엘레간에서 FPOP 변형 단백질의 비교는 PIXY 대 흐름에 의해. 유동 시스템에 비해 PIXY를 사용하여 산화적으로 변형된 단백질이 1.5배 증가합니다. 존슨, D. T., 펀숀 스미스, B., 에스피노, J. A., 게르센슨, A., 존스, L.M., 이동식 XY 스테이지와 플랫폼 인큐베이터에서 단백질의 인셀 빠른 광화학 산화 구현의 허가로 재인쇄. 분석 화학, 92 (2), 1691-1696 2019. 저작권 2020 미국 화학 협회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1. 워크플로 수정 배포 및 대량 교대 (Da). . .

토론

단백질은 살아있는 세포에서 많은 일을 능력을 발휘합니다. 이러한 중요성을 감안할 때, 세포 환경에서 단백질 기능 및 고차 구조(HOS)에 대한 상세한 데이터는 정제 시스템과는 달리 세포의 복잡성과 효소 반응에 대한 이해를 심화하는 데 필요합니다. 이를 위해, 하이드록실 라디칼 단백질 풋 프린팅(HRFP) 방법은 단백질(IC-FPOP)의 세포 내 고속 광화학 산화(IC-FPOP)라는 제목의 방법을 채택하였다. 대부분의 FPOP 연구는 상대적으로 순수한 단백질 시스템에서 시험관내에서 수행되었으며, 이는 결합 상호 작용과 단백질 형성 역학에 영향을 미치는 혼잡한 분자 환경과 현저하게 대조됩니다. 그 결과, 체외 실험(18)과 실제 세포 환경에서 얻을 수 있는 실험 사이의 차이가 있다. 시험관 내 FPOP 실험의 이상화된 조건과 세포의 복잡한 특성 사이의 격차를 해소하기 위해 셀-FPOP 플랫폼에서 새로운 자동화된 6웰 플레이트 기반플레이트 기반이 개발되었습니다. 이 새로운 FPOP 기술은 이러한 분자 종을 식별하고 특성화하고 건강하고 병에 걸린 상태에서 동적 분자 상호 작용을 추적 할 수 있습니다. 이 새로운 플랫폼은 이동식 XY 단계(PIXY)가 있는 플랫폼 인큐베이터라고 합니다.

FPOP는 프로테오메 내의 구조적 정보를 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 그러나, 모든 생물학적 기술은 추가 개선을 필요로 하는 특정 한계가 있습니다. 레이저 광분해 중에 특정 시약이 필요하며 반응하지 않은 하이드록실 라디칼을 효율적으로 담금질해야 합니다. 소화 된 펩티드의 분리는 구조적 정보를 극대화하기 위해 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 이러한 풍부한 정보는 MS 이후 데이터 분석1에서 광범위한 수량을 요구할 수도 있습니다. 레이저 플랫폼에서 세포 배양 및 IC-FPOP에 필요한 주변 기계와 IC-FPOP을 포함한 플랫폼 인큐베이터는 일부 실험실에서 실현 가능하지 않을 수 있는 큰 비용이 함께 제공됩니다. 진전이 계속됨에 따라 강력한 소프트웨어 및 분석 도구는 기술을 더 발전시켜야 합니다. 그 중 일부는 이 연구에서 소개됩니다. 이 플랫폼 인큐베이터의 현재 연구는 HEK293T 세포와 C. elegans에서수행되었습니다. IC-FPOP 방법은 중국 햄스터 난소(CHO), 베로, MCF-7 및 MCF10-A세포(19)를포함한 다양한 세포주와 호환되는 것으로 나타났다. 일반적인 IC-FPOP 방법은 이 정적 플랫폼으로 번역할 수 있기 때문에 이러한 세포주도 PIXY를 사용하여 연구에 적합해야 합니다.

IC-FPOP는 H2O2를 사용하여 아미노산의 용매 접근 가능한 측면 사슬을 산화적으로 수정한 다음 생물학적 맥락을 제공하는 데 중요한 실행 가능한 세포 내에서 단백질 상호 작용, 구조 및 대사 효과를 추가로 분별합니다. IC-FPOP 실험 전에 세포가 H2O2 첨가 후 실행 가능한지 확인하는 것이 필수적입니다. 세포 생존성 연구는 세포가 최대 200mMMM 13까지H2O2 농도의 존재에서 실행 가능하다는 것을 입증하였다. 또한H2O2가 미디어를 제거한 후 세포에 직접 200mMM의 최종 농도로 주입되는지 확인하는 것도 중요합니다. 세포 배양 매체를 완전히 제거하지 못하면 H2O2의농도가 다양하게 발생합니다. 표준 조건에 비해, H 2O2 농도증가와 함께인큐베이션 시간을 10초로 증가시켜 플랫폼 인큐베이터에서 IC-FPOP에 의해 변형된 단백질의 수가 증가하였다. 펌프가 제대로 작동하고 액체가 분산되고 있는지 확인하기 위해 사용하기 전에 정연성 펌프를 프라임하는 것이 필수적입니다. 그렇게 하지 않으면 튜브에 기포가 부족하거나 H2 O2의부피가 부족하여 세포를 침지하거나 담금질 용액의 부피가 부족할 수 있습니다.

발생할 수 있는 또 다른 문제는 시스템에서 원치 않는 지연입니다. 예를 들어 통합 소프트웨어를 사용하여 1000밀리초 이상의 순서에 상당한 지연이 추가되는 펌프 시스템에 대해 수신된 명령을 확인하는 프로세스입니다. 이 문제는 실험 중에 펌프와의 통신을 최소화하고 가능한 한 미리 설정된 명령을 사용하여 해결할 수 있습니다.

앞으로 PIXY의 목표는 완전히 자동화되고 통합된 시스템을 생산하는 것입니다. 연동 펌프 외에도 레이저 펄스의 트리거링이 자동화됩니다. 새로운 포지셔닝 시스템은 속도와 정확성을 향상시키기 위해 플랫폼 인큐베이터의 빠른 움직임에도 활용될 것입니다. 시스템의 모든 구성 요소는 처리량을 더욱 늘리기 위해 통합 소프트웨어를 사용하여 계속 프로그래밍됩니다.

공개 사항

저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
본 명세서에 제시된 연구는 아래 참조특허 출원과 관련이 있습니다.
미국 비잠정 특허 출원 번호: 17/042,565
제목: "단백질 접이식 을 결정하는 장치 및 방법"
UMB Docket 번호: LJ-2018-104 UMass Ref: UMA 18-059.

감사의 글

이 작업은 NIH R01 GM128983-01의 보조금에 의해 지원되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Ismatec Reglo ICC 연동 펌프Cole-Palmer122270050
  Ø를 위한 Kinematic Mirror 마운트; 2" 광학Thor Labs
10X 트립신&마이너스; EDTACorningAB00490-00005
50.0mm 248nm 45°C;, 엑시머 레이저 라인 미러Edmond Optics
아세톤, 0.1
아세토니트릴, LC/MS 등급Fisher Scientific
ACQUITY UPLC M-Class 대칭 C18 트랩 컬럼, 100°C, 5&마이크로; m, 180 &마이크로; m x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkgWaters23275기타 고해상도 기기(예: Q exactive Orbitrap 또는 Orbitrap Fusion)를 사용할 수 있습니다
ACQUITY UPLC M-Class SystemWatersA53225
Afinia H480 3D Printer(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)공기
펌프OKOlabsD12345
알루미늄 호일Fisher ScientificStock #63-120
Aqua 5 &마이크로; m C18 125 &아링; 포장재:Phenomenex
이산화탄소 장치OKOlabsMadMotor®-UHV
CentrifugeEppendorf
connectors (Y PP 1/16" 및 1/16x1/8")Cole-Palmer116891000
섬세한 작업 와이퍼Fisher Scientific022625501
Dithiothreiotol (DTT)AmericanBio
DMSO, 무수InvitrogenLS118-500
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS)CorningSK-78001-82
EX350 엑시머 레이저GAM 레이저PI89900
소 태아 혈청(FBS)CorningSK-12023-78
포름산, LC/MS 등급Fisher ScientificA929-44 L 수량은 필요하지 않습니다
HEK293TPaul Shapiro Lab(메릴랜드 대학교 볼티모어)
가습기OKOlabsNano-LPMW 스테이지
HV3-2 VALVEHamiltonBP152-500
과산화수소Fisher ScientificLS120-500
요오드아세트아미드 (IAA)ACROS Organics
LABVIEW Professional 2018National Instruments86728
MadMotor 포지셔닝 시스템 및 컨트롤러Mad City LabsW6-4
메탄올, LC/MS 등급Fisher Scientific01-213-100모든 브랜드가 충분함
마이크로 원심분리기Thermo ScientificH301-T Unit-BL-PLUS
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU)ACROS Organics
Nanopositioinging stageMad City Labs
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN)ACROS Organics
OKO 터치 모니터링 시스템OKOlabs
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량 분석기Thermo Scientific7Z02936
PE50-C 초전기 에너지 미터Ophir Optronics
페니실린-스트렙토마이신코닝
Pierce 정량 비색 펩타이드 분석Thermo Scientific
Pierce Rapid Gold BCA 단백질 분석 키트Thermo Scientific
Pierce Trypsin Protease, MS 등급Thermo Scientific75002436
세포 용해를 위한 Pierce Universal Nuclease FisherScientific06-666A
압력계OKOlabsOKO-AIR-PUMP-BL
PTFE 필터OKOlabsCO2-UNIT-BL
33mm PLA 필라멘트 링 6개(Innovation Space 메릴랜드 대학교 볼티모어 캠퍼스 도서관)
멸균 인큐베이터OKOlabs
온도 장치OKOlabsOKO-TOUCH
Thermo Scientific Pierce RIPA 버퍼Fisher ScientificA117-50
TiNKERcad(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)
Tris BaseFisher ScientificH325-10030% 과산화수소면 충분합니다
(Tygon 3.18 및 1.59 ID)Cole-Palmer177350250
0.1% 포름산(V/V), LC/MS 등급Fisher ScientificA454SK-44 L 수량은 필요하지 않습니다
물, LC/MS 등급Fisher Scientific88702
90058
KM200
186007496
% 포름산(v/v)이 포함된 HPLC 등급 Fisher Scientific . 세포

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