우리는 배아와 성인 마우스 혀의 상피 및 중간/ 결합 조직에서 대량의 고품질 단일 세포를 해리시키는 일반화 프로토콜을 개발했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 해리는 개별 세포 수준 및/또는 세포 집단 수준에서의 연구를 위한 필수적인 절차였습니다(예를 들어, 단세포 RNA 염기서열 분석 및 1차 세포 배양). 가능한, 다량에 있는 건강한 세포를 산출하는 것은 중요합니다, 이렇게 하기 위하여 최적 조건은 조직에 달려 있습니다. 혀 상피 및 기본 중간 엽/결합 조직에 있는 세포 인구는 이질적이고 조직 구조물은 다른 지구및 다른 발달 단계에서 변화합니다. 우리는 초기 발달 [배아 일 12.5 (E12.5)] 및 젊은 성인 (8 주) 단계에서 마우스 혀 상피 및 중간/ 결합 조직에서 세포를 격리하기위한 프로토콜을 테스트했습니다. 상피와 근본적인 메센키메/결합 조직 사이의 깨끗한 분리는 쉽게 달성할 수 있었습니다. 그러나 세포를 추가처리 및 분리하고, 가능한 건강한 세포를 대량으로 산출하고, 효소 소화 완충제, 인큐베이션 시간 및 원심 분리 속도와 시간을 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 분리된 상피 또는 기본 메센키메/결합 조직의 배양은 37°C에서 30분 동안 트립신-EDTA0으로, 8분 동안 200 x g에서 원심분리로 이어져 높은 생존율(>90%)으로 세포의 높은 수율을 초래했습니다(>90%) 마우스 단계와 혀 부위에 관계없이. 더욱이, 우리는 배아와 성인 방언에서 해리된 상피 및 중간엽/결합 조직 세포 둘 다 세포 생존성의 유의한 감소 없이 적어도 3 시간 동안 세포 배양 기지를 둔 매체에서 살아남을 수 있었다는 것을 것을을 발견했습니다. 프로토콜은 초기 발달 (E12.5) 및 다른 조직 구획에서 세포 해리를 요구하는 젊은 성인 (8 주) 단계에서 마우스 혀에서 격리 된 세포의 준비를 필요로하는 연구에 유용 할 것이다.
서론
포유류 혀는 맛, 말하기 및 식품 가공에 중요한 복잡한 기관입니다. 그것은 메센키메 / 결합 조직에 의해 구획및 맛 유두와 미각을 포함하는 계층화 상피 시트에 의해 덮여 고도로 조직 된 조직의 여러 유형으로 구성되어 있습니다. 혀 상피와 중간엽/결합 조직 모두에서 세포 인구는 이질적이다. 혀에 있는 세포의 특정 모형의 기능 그리고 분포를 더 잘 이해하기 위하여는, 해리된 세포를 이용한 연구 결과가 필요합니다. 예를 들어, 단세포 RNA 시퀀싱은 개별 세포에서 전사 프로파일링을 위한 강력하고 높은 처리량 방법이며, 이는 단일 세포 해상도1,2,3,4에서복잡한 조직의 전사를 이해하도록 설계된다. 1차 세포 배양은미각5,6에대한 줄기/전구 세포의 기능 및 분화를 연구하는 유용한 도구로 입증되었다. 이러한 연구는 고품질 의 격리 된 세포 집단의 대량을 필요로 (예를 들어, 적절한 농도와 높은 생존력을 가진 충분한 총 세포 수).
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프로토콜
동물 사용 (연구 전반에 걸쳐 C57BL/6 마우스) 조지아 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었고 연구에 대 한 동물의 치료 및 사용에 대 한 건강 지침의 국가 학회에 따라 했다.
1. 동물 사용
참고: 마우스는 12시간/야간 주기하에서 조지아 대학의 동물 및 유제품 과학 부서의 동물 시설에서 사육되고 유지되었습니다.
- 배아 (E) 일 0.5로 마우스에서 질 플러그 검출의 날 정오를 지정합니다. 다음 실험을 위해 8주에 E12.5 및 산후 마우스에서 배아를 사용하십시오.
2. 실험 전 준비
참고: 이 프로토콜에 필요한 계측기는 재료 표에나열됩니다.
- 실험 전에 자동 클라이브 계측기. 실험 중에 비드 멸균제를 사용하여 기기를 살균합니다.
- 70% 에탄올 물티슈를 사용하여 수술 부위, 해부 현미경 및 생물 안전 캐비닛을 청소하십시오. 생물 안전 캐비닛의 자외선을 켜고 실험 절차 전에 20 분 동안 유지하십시오.
- 1:1 디스파제(5.0 mg/mL)와 콜라게나아제(2.0 mg/....
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결과
기본 메센키메/결합 조직으로부터 혀 상피의 분리
배아 마우스 혀에서, 적당한 효소 소화 후에 하위 상피 공간에 있는 간격이 보입니다. 일부 혀의 상피 시트는 인큐베이션 중에 기계적 힘없이 분리됩니다.
성인 마우스 혀에서, 성공적인 효소 주입은 주입 된 영역(도 1B2)에서붓기에 의해 표시되며, 이는 효소가 혀에 의해 유지 될 수 있음을 시사한다. 바늘에 의한 중간및/또는 혀 상피 침투에 대한 불충분한 효소 및/또는 깊은 바늘 삽입은 주입 부위의 부분적 부종또는 전혀 붓지 유발하지 않습니다. 효소 소화 후, 적절한 효소 소화를 가진 근본적인 결합 조직은 느슨해지고 끈적거리게 됩니다. 상피 시트의 가장자리를 부드럽게 들어 올릴 때 상피 공간의 간격이 표시됩니다.
총 세포 수 및 생존.......
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토론
현재까지, 혀 상피 및 기본 중간 엽/결합 조직에서 세포 해리에 사용할 수 있는 상세한 프로토콜이 없습니다. 이 현재 세포 해리 프로토콜은 높은 세포 생존가능성(>90%)을 가진 단일 세포 현탁액을 생성하는 재현 가능한 절차를 제공합니다. E12.5및 성인 마우스에서 고립된 세포가 크기가 다르더라도 태아 및 산후 단계에서 상피 시트 및 중간 엽/결합 조직을 포함한 마우스 혀 조직에서. 예를 들어, E12.5 마우스 혀의 상피 및 중간부에서 분리된 세포는 8주 된 마우스 혀에서 세포의 큰 가변성(작은 에서 큰 것)과 는 대조적으로 일관되고 작습니다. 높은 생존율(>90%)의 장점으로 분리된 세포의, 항복된 단세포 현탁액은 실행 가능한 세포의 고품질을 요구하는 다운스트림 실험을 용이하게 할 수 있다(예를 들어, 단세포 RNA 시퀀싱 및 1차 세포 배양).
세포의 높은 생존가능성을 보장하기 위해 주의 해야 합니다. 디스파제 와 콜라게나아제 혼합물을 가진 적절한 소화 시간은 실행 가능한.......
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공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
이 연구는 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다, HXL에 R01DC012308 및 R21DC018089를 부여 번호. 우리는 브렛 마샬 (조지아 대학, 아테네, GA) 및 에곤 랑히니 (10 X 게놈, 플레전턴, 캘리포니아)에게 세포 해리에 관한 기술 적 지원 및 상담에 감사드립니다. 프란시스카 깁슨 번리 (조지아 대학, 아테네, 조지아) 영어 편집에 대한.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 소 혈청 알부민(BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 마우스(C57BL/6J) | 잭슨 연구소 | 000664 | |
| 콜라겐분해효소(콜라겐분해효소 A) | 시그마-알드리치 | 10103586001 | |
| 배양 접시(직경 35mm) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| 배양 접시(직경 100mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| 해부 가위 (Student Fine Scissors) | 찾기과학 도구 | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine typs (Dumount #3 Forceps) | 과학 도구 찾기 | 11293-00 | |
| 혈구계 | Hausser Scientific | 3520 | |
| 도립 현미경(EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| 저유지 피펫 팁 | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| 미니 가위(Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| 플라스틱 워프 | VWR | 46610-056 | |
| 주걱 (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| 수술용 집게 (Dumount #2 Laminectomy 집게) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode ' S 용액 | : Sigma-Aldrich | T2145-10L | , Tyrode의 염, |
| 0.25 % typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M 인산염 완충 식염수 (PBS) | Hoefer | 33946 | 1 M PBS로 만든 |
| 0.22-μ m 주사기 필터 | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% 에탄올 | Koptec | 233919 | 100% 에탄올로 제작 |
| 1-mL 주사기 | BD | 8194938 | |
| 5-mL 저결합 마이크로 원심분리기 튜브 | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G 바늘 | BD | 9193532 | |
| 35-μ m 세포 여과기 | Falcon | 64750 | |
| 70-μ m 셀 스트레이너 | 팔콘 | 64752 |
참고문헌
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple....
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재인쇄 및 허가
