이 프로토콜은 크로마틴에 응축수를 만들기 위해 화학적으로 유도된 단백질 이질화를 보여줍니다. 화학 이량제와 텔로미어에 대미원식 백혈병 (PML) 핵 체의 형성이 입증된다. 물방울 성장, 용해, 국소화 및 조성물은 살아있는 세포 이미징, 면역 형광 (IF) 및 시상 혼성화 (FISH)에서 형광으로 모니터링됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
크로마틴 관련 응축수는 많은 핵 프로세스에 연루되어 있지만 기본 메커니즘은 여전히 애매합니다. 이 프로토콜은 텔로미어에 응축수를 만들기 위해 화학적으로 유도된 단백질 이압 시스템을 설명합니다. 화학 이량제는 각각 단백질에 결합할 수 있는 두 개의 연결된 리간드로 구성됩니다: 헤일로 리간드에서 헤일로 효소 및 트리메토림(TMP)에서 대장균 디하이드로폴레이트 환원효소(eDHFR)에 각각 결합한다. Halo 효소를 텔로미어 단백질에 융합하여 이머제는 공유 헤일로 리간드 효소 결합을 통해 텔로미어에 이질화합니다. eDHFR에 TMP의 결합은 텔로미어에 단백질을 분리하는 eDHFR 융합 상을 모집하고 응축수 형성을 유도합니다. TMP-eDHFR 상호 작용은 비 공유이기 때문에, 응축은 eDHFR 바인딩을 위한 이질제와 경쟁하기 위하여 초과 자유로운 TMP를 사용하여 반전될 수 있습니다. 텔로미어에 대한 보골세포 백혈병(PML) 핵체 형성을 유도하고 응축수 성장, 용해, 국소화 및 조성물을 결정하는 예가 도시된다. 이 방법은 Halo를 현지 크로마틴에 직접 결합하는 단백질또는 가이드 RNA와 게놈 궤적을 대상으로 하는 dCas9에 직접 결합하는 단백질에 융합하여 다른 게놈 위치에서 응축을 유도하도록 쉽게 적응할 수 있다. 생화학적 분석을 위한 세포의 인구에서 위상 분리를 유지하면서 단하나 세포 라이브 이미징에 필요한 시간적 분해를 제공함으로써, 이 방법은 크로마틴 관련 응축수의 형성과 기능을 모두 조사하는 데 적합합니다.
서론
많은 단백질과 핵산은 액체-액체 상 분리(LLPS)를 거치고 세포1,2에서생화학을 조직하기 위해 생분자 응축수로 자가 조립한다. 크로마틴 결합 단백질의 LLPS는 특정 게놈 loci와 연관되고 각종 국소 크로마틴 기능에 연루되는 응축수의 형성에 이끌어 냅니다3. 예를 들어, HP1 단백질의 LLPS는 게놈4,5,전사 인자의 LLPS를 구성하는 이종로크로마티닌 도메인의 형성을 기초로 하여 전사6,초기 mRNA및 다성 빗 단백질의 LLPS는 그의 mRNA의 전사 및처리를 조절하기 위해 그의 음색 궤적 바디를 생성한다. 그러나 크로마틴 관련 응축수의 많은 예가 발견되었음에도 불구하고 응축수 형성, 조절 및 기능의 기본 메커니즘은 제대로 이해되지 않습니다. 특히, 모든 크로마틴 관련 응축수들이 LLPS를 통해 형성되는 것은 아니며 살아있는 세포에서 응축수 형성에 대한 신중한 평가는 여전히8,9가필요하다. 예를 들어, 마우스의 HP1 단백질은 살아있는 세포에서 액체 방울을 형성하는 데 약한 용량만 있는 것으로 나타났으며 이종로그로마틴 포시는 붕괴된 폴리머소구(10)로행동한다. 따라서, 살아있는 세포에서 크로마틴에 드 노보 응축수를 유도하는 도구는 바람직하며, 특히 살아있는 화상 진찰 및 생화학 적 분석의 사용을 허용하여 응축수 형성의 운동, 결과 응축수의 물리적 및 화학적 특성 및 응축수 형성의 세포 결과를 모니터링 할 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
이러한 프로토콜은 크로마틴11(도 1A)에단백질 응축수를 유도하는 화학 적 이질 시스템을 보고합니다. 이산화제는 두 개의 연결된 단백질 상호 작용 리간드로 구성되어 있습니다: 트리메토림(TMP)과 헤일로 리간드와 코냑 수용체에 융합된 단백질을 이질할 수 있습니다: 에젤리치아 대장균 디하이드로폴레이트 환원효소(eDHFR) 및 세균성 알킬데할로게나아제 효소(Halo enzyme), 각각12. Halo 리간드와 헤일로 효소 간의 상호 작용은 공유되며, Halo 효소는 크로마틴결합 단백질에 융합하여 eDHFR에 융합된 위상 분리 단백질을 크로마틴에 모집함으로써 앵커로 사용될 수 있게 합니다. 초기 모집 후, 단백질을 분리하는 상의 국소 농도가 증가하여 위상 분리에 필요한 임계 농도를 전달하여앵커(도 1B)에서응축수를 핵을 형성한다. 형광 단백질(예: mCherry 및 eGFP)을 eDHFR 및 Halo에 융합함으로써 응축수의 핵 형성 및 성장을 형광 현미경 검사법과 실시간으로 시각화할 수 있습니다. eDHFR과 TMP 간의 상호 작용은 비공유이기 때문에, 초과 무료 TMP는 eDHFR 바인딩을 위한 이질화와 경쟁하기 위하여 추가될 수 있다. 그러면 앵커로부터 위상 분리 단백질을 방출하고 크로마틴 관련 응축수용을 용해시킬 것이다.
우리는 텔로미어 유지보수를위한 텔로미어(ALT) 경로의 대체 길이를 사용하는 텔로머라제-음성 암 세포에서 텔로미어에 대한 드 노보 보골 성 백혈병(PML) 핵체 형성을 유도하기 위해 이 도구를사용했다. PML 핵체는 많은 핵 공정에 관여하는 멤브레인이 없는 구획으로,ALT텔로미어 관련 PML체(17,18)에대해 APB를 형성하기 위해 ALT 텔로미어로 고유하게 국한된다. 아마도 ALT19에서homology 지향 텔로미어 DNA 합성을 위한 복구 템플릿을 제공하기 위하여, APBs 내의 텔로미어 클러스터. 실제로, 텔로미어 DNA 합성은 APBs에서 검출되고 APBs는 텔로미어20,21에DNA 복구 요인을 풍부하게 하는 데 필수적인 역할을 한다. 그러나 APB 어셈블리와 알토미어 클러스터링의 기본 메커니즘은 알 수 없었습니다. ALT 세포내 텔로미어 단백질은 작은 유비퀴틴 유사 수정제(SUMOs)22에의해 고유하게 변형되기 때문에, 많은 APB 성분은 스모일레이션 사이트(22,23,24,25 및/또는 SUMO)를 함유하고 있습니다. 상호 작용하는 모티프(SEM)26,27 및 SUMO-SIM 상호 작용은 위상 분리28을구동하며, 텔로미어의 스모틸화는 단백질을 함유한 SUMO/SIM의 농축으로 이어진다고 가설을 세우고 이러한 단백질 간의 SUMO-SIM 상호 작용은 위상 분리로 이어집니다. 3개의 스모일화 사이트와 1개의 SIM 사이트가 있는 PML 단백질은, APB를 형성하기 위하여 스모이드텔로미어로 모집될 수 있고 액체 APB의 결합은 텔로미어 클러스터링으로 이끌어 냅니다. 이러한 가설을 테스트하기 위해, 우리는 텔로미어에 SIM을 모집하여 스모닐화 유도 APB 형성을 모방하기 위해 화학 적 이질화를 사용했다(도 2A)11. GFP는 시각화를 위해 Haloenzyme및 텔로미어 결합 단백질 TRF1에 융합되어 이질제를 텔로미어에 고정시합니다. SIM은 eDHFR과 mCherry에 융합됩니다. 응축수 형성 및 액적 융합 유도 텔로미어 클러스터링의 운동제는 살아있는 세포 이미징으로 뒤따릅니다. 단계 분리는 eDHFR 바인딩과 경쟁하기 위해 초과 무료 TMP를 추가하여 반전됩니다. 피시테 혼성화(FISH)에서의 면역형광(IF) 및 형광은 응축수 조성물 및 텔로메릭 협회를 결정하는 데 사용된다. SIM을 모집하면 텔로미어에서 SUMO가 풍부하게 되며 유도된 응축수에는 PML이 포함되어 있으므로 APB가 포함됩니다. SUMO와 상호 작용할 수 없는 SIM 돌연변이를 모집해도 텔로미어에서 SUMO가 풍부하게 하거나 위상 분리를 유도하지 않으며, 이는 APB 응축의 기본 추진력이 SUMO-SIM 상호작용임을 나타낸다. 이러한 관찰에 동의하면, TRF2 결합인자 RAP1에 융합된 폴리스모 폴리머는 또한 APB형성(29)을유도할 수 있다. 상 분리가 충분한 단백질이 생산되는 한 위상 분리가 발생하는 polySUMO-polySIM 융합 시스템에 비해, 여기에 제시된 화학 적 이질 접근법은 수요에 대한 위상 분리를 유도하고 따라서 상 분리 및 텔로미어 클러스터링 공정의 운동을 모니터링하는 더 나은 시간적 해결을 제공한다. 또한, 이 화학 적 이산화 시스템은 위상 분리 및 텔로미어 클러스터링을 유도하는 능력을 평가하기 위해 다른 단백질의 모집을 허용합니다. 예를 들어, 텔로미어에 채용된 무질서한 단백질은 APB 형성을 유도하지 않고 방울과 클러스터 텔로미어를 형성할 수 있으며, 텔로미어 클러스터링은 APB 화학과 무관하며 APB 액체특성(11)에만의존한다는 것을 시사한다.
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프로토콜
1. 일시적인 세포주 생산
- 배양 U2OS 수용세포는 22 x 22mm 유리 커버립(라이브 이미징용) 또는 12mm 직경의 원형 커버립(IF 또는 FISH용)에 6웰 플레이트에 다중 D-리신으로 코팅되어 있으며, 성장 배지(10% 태아 소 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액)이 60%에 도달할 때까지 60%의 컨플루엔시에 도달할 때까지 60%의 컨플루엔시에 도달할 때까지 세포.
- 성장 배지를 1mL 경질 배지(페니실린-연쇄절제술용액 이없는 성장 매체)로 교체하십시오.
- 각 트랜스펙트에 대해 150 μL 감소세럼 매체에 4μL 형질 분출 시약을 추가하고 10초 동안 소용돌이를 한 다음 5분 동안 배양합니다.
- 각 웰에 대해, 헤일로 생성 플라스미드(Halo-GFP-TRF1 또는 Halo-TRF1) 및 eDHFR 분단 플라스미드(mCherry-eDHFR-SIM 또는 mCherry-eDHFR-SIM 돌연변이)를 1:1 질량 비(0.5 μg eDHFR-SIM 돌연변이)에 추가하여 0.5μg eDHFR을 구성하는 플라스미드를 150μg 의 파이프를 150μm로 감소시한다.
참고: 태그는 상대적으로 작으며(Halo 33 kD, eDHFR 28kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) 위상 분리에 영향을 미치지 않는 것이 관찰되었다. 그러나, 여기에 사용되는 SIM 돌연변이와 같은 돌연변이를 사용하여 위상 행동이 태그가 아닌 돌연변이에 민감하다는 것을 확인하는 것이 좋습니다. SIM은 PIASx28,30에서입니다. SIM 시퀀스는 AAAGTCGATGTAATTGACTTGACTTAAAAC타그맥케이아가아가가와아가와아가가와아아가와아아키크타아ACGTGT입니다. SIM 돌연변이체는 SIM 아미노산 VIDL을 VADA28로돌연변이시킴으로써 생성되며, 시퀀스는 AAAGTCGATGGGCCCCCCACGCCACGACGAC타그가아가가와아가적응CTCTAACGTGT입니다. 우리는 추가 유전자에 우리의 플라스미드를 입금: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mCherry-eDHFR-SIM 돌연변이. - 150 μL의 경질 시약 -감소된 혈청 미디어 혼합물을 DNA, 드롭와이즈, 파이펫팅으로 혼합, 5분 동안 배양하여 혈청 매체를 150 μL 감소시키는 혈청 매체를 추가합니다.
- 세포에 300 μL의 트랜스페션 시약-DNA 혼합물을 넣고, 드롭와이즈한 다음 세포를 인큐베이터에 다시 놓습니다.
- 시상 혼성화(FISH)에서 실시간 이미징, 면역 형광(IF) 또는 형광 전에 24-48시간을 기다립니다.
2. 텔로미어의 디머화
- 10mMM에서 디메틸 황산화물에 디메틸 황화물을 녹이고 장기 보관을 위해 -80°C의 플라스틱 미세 센세이프분리기 튜브에 보관하십시오.
참고: Halo(TMP-Halo, TH)에 직접 연결된 TMP를 사용하여 이량제를 사용하는 대신, 감광성 링커를 가진 이질화TMP-NVOC-Halo(TNH) TMP와 Haloligand 사이에 는 6-nitroveratryl 옥시카보닐(NVOC)이31개사용된다. 이는 TNH(~5분)가 TH(~20분)보다 셀안으로 확산되는 데 걸리는 시간이 적기 때문입니다. 여기에 표시된 결과는 TH를 사용하여 얻을 수도 있다. TNH를 사용하는 경우 NOVC 분열을 피하기 위해 이질자를 빛에 노출시키지 않도록주의하십시오. 희미한 빨간 불빛램프가 있는 어두운 방에서 TNH를 처리하고, 이질제를 호박색 플라스틱 튜브에 보관하고 TNH 또는 처리된 세포를 알루미늄 호일로 포장합니다. DIC를 가진 화상 진찰 TNH는 안전합니다. - -80°C에서 10mM 이량제의 알리쿼트를 취하고 이미징 매체에서 10 μM의 재고 농도로 희석하고 -20°C에 저장하십시오.
- 사용할 준비가 되면 이질화제를 10 μM 스톡 솔루션에서 성장 매체(고정 이미징용) 또는 이미징 매체의 최종 작동 농도100nM로 희석합니다. 100nM 이량제(최종 농도)를 가진 세포를 실험용 으로 처리하거나 면역형광(IF) 및 피시 혼성화(FISH)에서 형광을 위해 4-5시간 동안 배양한다.
참고: 사용된 이량제의 농도는 이질화 효율에 영향을 미치므로 위상 분리에 영향을 미칩니다. 최대 이질 효율을 허용하는 이머제 농도는 세포 유형 및 앵커 단백질 농도에 따라 달라지므로 다른 실험에 대해 결정되어야 합니다. 한 가지 간단한 방법은 앵커 단백질 및 mCherry-eDHFR을 발현하는 세포를 배양하는 것입니다 (단백질을 분리하는 단계와 융합하거나 비위상 분리 돌연변이에 융합하지 않고) 앵커에서 가장 높은 mCherry 강도가 달성되는 이질제 농도를 식별하는 것입니다. 보다 체계적인 접근법은 앵커를 다른 농도의 이머제만 발현한 다음 Halo 결합 염료로만 포동을 발동하여 Halo 결합 염료 강도가 고원으로 시작되는 이머제 농도를 결정하는 데 도움을 줍니다(즉, 모든 Halo 융합앵커는 이머제에 의해 점유되고 더 이상 헤일로 결합 염료에 남아 있지 않습니다). - 이산화를 되돌리려면, 2-5시간 동안 이량제로 세포를 배양(라이브 이미징 유무) 또는 원하는 액적 크기가 달성될 때까지 배양하고 이미징 매체에서 세포에 희석된 100μM 무료 TMP(최종 농도)를 추가한다.
3. 면역 형광 (IF)
- 6웰 플레이트에 폴리-D-리신으로 코팅된 12mm 직경의 원형 커버 안경에105셀을 시드. 그런 다음 두 플라스미드 (mCherry-eDHFR-SIM 또는 mCherry-eDHFR-SIM 돌연변이를 가진 Halo-GFP-TRF1)를 횡단하고 면역 불경을 진행하기 전에 24-48 시간을 기다립니다.
참고: 트랜스펙트 후 하루 이상 기다린 후 더 높은 식을 얻을 수 있습니다. - 100 nM의 최종 농도에 도달하기 위해 성장 배지로 이량제를 희석하고, 세포에 희석 된 이량제를 추가하고 4-5 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
참고: 단계 분리는 이질화(< 30분)를 추가한 후 빠르게 유도됩니다. 더 긴 잠큐어는 작은 크기로 물방울 거칠기 도움이 됩니다. 살아있는 화상 진찰을 가진 물방울 성장을 따르는 것은 물방울이 원하는 상태에 도달하는 데 걸리는 시간을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. - PBS 용액의 세포를 4% 포름알데히드 및 0.1% 트리톤 X-100에 대해 실온에서 10분 동안 세포를 충진한다. PBS로 셀을 3번 세척합니다.
참고: 이 단계 후에는 일시 중지할 수 있으며 셀을 최대 1주일 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.
주의: 포름알데히드는 흡입에 의해 유해하며 삼키면 눈, 호흡기 및 피부를 자극하며 암 위험이 있습니다. 개인 보호 장비를 착용해야하며 화학 연기 후드에서만 사용해야합니다. 또한 사용 후 폐용기에 넣고 싱크대에 넣지 마십시오. - 워시커버립은 50 μL TBS-Tx로 두 번, 50μL 항체 희석 버퍼(AbDil)로 한 번 커버합니다. TBS-Tx는 TBS, 0.1% 트리톤 X-100 및 0.05% Na-azide에 의해 만들어졌습니다. AbDil은 TBS-Tx, 2% BSA 및 0.05% Na-azide에 의해 만들어졌습니다.
- 각 커버슬립을 50μL 1차 항PML(AbDil의 1:50 희석) / 항 SUMO1(AbDil에서 1:200 희석) / 항 SUMO2/3 항체(AbDil의 1:200 희석)로 각 커버슬립을 4°C에서 4°C에서 배양한다. mCherry 항체는 또한 FISH에 대한 mCherry 신호를 검출하는 데 도움이 (AbDil에서 1:200 희석)을 사용할 수 있습니다.
참고 : FISH는 mCherry 형광 신호를 담금질하여 mCherry 플라스미드와 함께 감염된 세포를 FISH 실험에 감염되지 않은 세포와 구별하기가 어렵습니다. mCherry 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 대안적으로, 단백질을 함유하는 eDHFR을 발현하는 안정적인 세포주도 만들 수 있다. - 워시 커버립은 AbDil과 함께 3번 커버하여 언바운드 1차 항체를 제거합니다.
- 이차 항체 [항 마우스 IgG (H+L) 이차 항체와 함께 세포를 배양하여 PML 및 SUMO용 알렉사 플루어 647, 항토끼 IgG (H+L) 이차 항체는 엠체리에 대한 알렉사 플루어 555와 결합되어 1시간 동안 AbDil에서 1시간 동안 희석됩니다.
- 세탁 커버립은 TBS-Tx로 3번.
- 라벨 슬라이드, 1 μg/mL의 DAPI 최종 농도에 도달하기 위해 마운팅 매체에서 DAPI를 희석. 그런 다음 슬라이드에 2 μL 희석 DAPI를 넣습니다. 커버슬립을 뒤집어 DAPI 드롭에 놓고 커버슬립 가장자리에서 여분의 유체를 노립니다.
- 매니큐어로 밀봉하고, 물로 커버슬립 의 상단에서 건조하고 헹구십시오. 이미징을 위해 냉동실에 저장하십시오.
4. 시투 혼성화의 형광 (FISH)
- 6웰 플레이트에 폴리-D-리신으로 코팅된 12mm 직경의 원형 커버 안경에105셀을 시드. Halo-TRF1 및 mCherry-eDHFR-SIM 또는 mCherry-eDHFR-SIM 돌연변이 플라스미드를 가진 트랜스펙트 세포는 FISH로 진행하기 전에 24-48h를 기다립니다. 이산화 단계는 3.2에 기재된 것과 동일합니다.
참고 : 여기에 TRF1은 GFP와 융합되지 않으므로 녹색 채널은 텔로미어 DNA 프로브를 위해 해제됩니다. - 실온에서 10분 동안 포름알데히드4%로 셀을 수정하고 PBS로 4회 세척합니다. IF-FISH의 경우 IF-FISH의 경우 IF(3.8)에서 이차 항체를 세척한 후 여기에서 IF 프로토콜을 진행하고 실온에서 10분 동안 포름알데히드로 세포를 재고치고 PBS로 세 번 세척하십시오.
- 탈수 커버립은 에탄올 시리즈(각각 70%, 80%, 90%, 2분)입니다.
- 인큐베이트는 488-telC PNA 프로브(1:2000 비율)로 커버립을 75°C에서 5분 동안 5μL 하이브리드화 용액으로 커버립합니다. 혼성화 솔루션에는 70% 디온화된 폼아미드, 10mM Tris(pH 7.4), 0.5% 블로킹 시약이 포함되어 있습니다. 그런 다음 실온에서 가습 챔버에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 워시 커버립워시 버퍼(70% 포르마이네, 10mM Tris) 2분 실온에서 3회, 이미징용 마운팅 미디어에 1μg/mL DAPI가 장착된 마운트.
참고 : FISH 프로토콜은 게시 된 프로토콜33'34입니다.
5. 라이브 이미징
- 세포가 이미징을 위해 준비되면, 환경 챔버의 가열 된 단계에서 페놀 레드없이 1 mL 이미징 배지에서 유지 된 세포가있는 자기 챔버의 커버립을 탑재하십시오.
- 현미경 및 환경 제어 장치를 설정합니다. 이미지는 100x 1.4 NA 목표, 피에조 Z-Drive, 전자 곱합 전하 결합 장치(EMCCD) 카메라, 455, 488, 561, 594 및 647 nm 레이저가 장착된 레이저 병합 모듈을 통해 회전 디스크 공초점 현미경으로 획득되었습니다. 모든 레이저의 출력 능력은 섬유 끝에서 측정된 20mW입니다.
- 핵에 있는 텔로미어 및 확산국화된 mCherry 신호에 밝은 GFP 신호와 세포를 찾아내는. 약 20개의 세포를 찾아, x, y, z 정보로 각 위치를 암기하고 GFP와 mCherry 채널 모두에 대해 총 8 μm 및 5분 시간 간격으로 0.5 μm 간격으로 시간 경과 이미징을 위한 매개 변수를 설정합니다. 594nm의 30%, nm 전력 강도 488의 50%를 사용하며, 노출 시간은 200ms및 카메라 게인 300입니다.
참고: 레이저 장치의 출력 전력은 20mW입니다. 밝은 GFP 포시는 응축수결을 더 쉽게 핵을 할 수 있는 더 큰 앵커 크기를 나타냅니다. 위상 분리는 세포내 SIM 농도에 따라 달라지므로 광범위한 mCherry 신호를 가진 세포를 찾습니다. 너무 어둡거나 너무 밝은 mCherry 신호를 가진 세포는 위상 분리되지 않을 수 있습니다. 광표백을 피하기 위해 너무 많은 레이저 파워 또는 너무 긴 노출 시간을 사용하지 마십시오. - 이미징을 시작하고 사전 이산화로 일회성 루프를 수행합니다. 일시 정지 이미징, 최종 이량제 농도가 100 nM되도록 단계의 이미징 챔버에 10 μM 이량제의 15 μL을 포함하는 0.5 mL 이미징 미디어를 추가합니다. 이미징을 다시 시작합니다.
- 이산화를 되돌릴 준비가 되면, 이미징을 일시 중지하고, 100mM 스톡 TMP의 2μL를 포함하는 0.5mL 이미징 미디어를 스테이지의 이미징 챔버에 추가하여 100 μM TMP 최종 농도를 얻습니다. 1-2 시간 동안 이미징 세포를 계속합니다.
6. 고정 이미징
- 라이브 이미징과 동일한 현미경으로 설정, 단계 가열은 필요하지 않습니다. 488nm를 사용하여 텔로미어 피쉬, mCherry IF의 경우 561nm, PML 또는 SUMO IF의 경우 647nm을 사용하십시오.
참고 : mCherry 항체를 사용하지 않는 경우, 직접 이미지 mCherry 단백질하지만 물고기에 담금질 때문에 어쩌면 희미한 신호. 여전히 사용 561 nm 보다는 594 nm 레이저 이미지 mCherry Cy5의 신호 출혈을 피하기 위해 mCherry. - 전자식 세포를 선택하려면 적색 신호(mCherry 또는 mCherry IF)를 사용하여 약 30-50개의 세포를 찾습니다.
- 더 많은 신호를 수집하기 위해 Z에서 총 8 μm의 간격으로 0.3 μm 간격으로 이미지를 촬영했습니다. 647nm의 80%, 561nm의 80%, 488nm 전력 강도의 70%를 사용하며, 노출 시간은 600ms및 카메라 게인 300을 사용합니다.
7. 시간 경과 이미지 처리
- 텔로미어에 대한 바이너리 정의
모든 시간 및 z 스택 정보를 가진 셀 을 선택하고 GFP 채널만 선택하고 임계값을 정의하여 이진 레이어를 만듭니다. 임계값의 아래및 상부 값을 조정하고 "Smooth", "정리" 및 "구멍 채우기"와 같은 함수를 사용하여 임계값이 모든 시간 점을 통해 원하는 개체를 얼마나 잘 집어들수 있는지 확인합니다. - 배경 빼기
모든 채널을 선택하고, 배경(셀 제외)에 관심 있는 직사각형 영역(ROI)을 그립니다. 이 ROI를 배경으로 정의한 다음 배경 강도를 뺍니다. - 텔로미어 이진을 텔로미어 강도에 연결
텔로미어 이진을 선택하고 이진 오브젝트의 GFP 강도를 텔로미어 강도로 계산하기 위해 GFP 채널에 연결합니다. - 시간이 지남에 따라 텔로미어 수와 강도 계산
시간, 개체 ID, 평균 강도, 합계 강도 및 내보내기 데이터와 같이 내보낼 정보를 지정합니다. 그림 플로팅 소프트웨어를 사용하여 내보낸 테이블을 읽고 텔로미어 수와 텔로미어 강도의 수치를 생성합니다(각 텔로미어의 볼륨에 대한 강도를 요약한 다음 셀의 모든 텔로미어에 대한 평균).
8. 고정 셀 이미지 처리
- AP에 대한 바이너리 정의
561nm 채널에서 신호를 찾아 분석을 위해 감염된 세포를 선택합니다. 7.1에서의 절차에 따라, 각각 텔로미어및 PML 바디 또는 SUMO에 대한 바이너리를 생성하기 위해 GFP(텔로미어 DNA FISH)와 Cy5(PML 또는 SUMO IF) 채널 모두에서 임계값을 정의한다. GFP 및 Cy5 바이너리 레이어를 병합하고 GFP 및 Cy5 신호가 모두 포함된 입자를 포함하는 새 레이어를 만들어 텔로미어에서 PML 본체의 공동 지역화를 나타내므로 APB를 생성합니다. - APB/SUMO 번호 및 강도 계산
7.2 다음에 이미지 배경을 뺍니다. 다음 7.3다음에 Cy5 채널에 APB/SUMO 바이너리 레이어를 연결합니다. APB/SUMO 번호와 강도를 계산합니다. 7.4 다음에 데이터를 내보내고 플롯합니다.
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결과
텔로미어 DNA FISH 및 SUMO 단백질 IF에 의해 확인된 SUMO의 텔로메릭 국소화의 대표적인 이미지는 도 2에도시된다. SIM 모집을 가진 세포는 SIM 돌연변이 모집을 가진 세포에 비해 텔로미어에 SUMO1 및 SUMO 2/3을 풍부하게 했습니다. 이는 말단소에 대한 SIM 이수화로 인한 SUMO 농축이 SUMO-SIM 상호 작용에 달려 있음을 나타냅니다.
IMERIzation 후 TRF1 및 SIM의 대표적인 타임랩스 동영상이 비디오 1에표시됩니다. 4개의 시간 포인트의 스냅샷은 그림 3A에표시됩니다. SIM은 텔로미어에 성공적으로 채용되었고, 액체 액적 형성 및성장(그림 1B)에대한 예측대로 SIM및 TRF1 포시가 더 크고 밝아졌습니다. 또한, TRF1 포시의
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토론
이 프로토콜은 화학 적 분수 시스템을 갖춘 텔로미어의 응축수 형성 및 용해를 입증했습니다. 상 분리 및 액적 융합 유도 텔로미어 클러스터링의 운동은 라이브 이미징으로 모니터링됩니다. 응축수 국소화 및 조성물은 DNA FISH 및 단백질 IF로 결정됩니다.
이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 단백질과 이량제 농도를 결정하는 것입니다. 게놈 궤적에서 국소 상 분리를 유도하는 성공은 위상 분리를 위한 중요한 농도 이상의 단백질을 분리하는 위상의 국소 농도 증가에 의존한다(그림 1B). 단백질을 분리하는 단계의 세계적인 농도는 국소 집중될 충분한 단백질이 있기 위하여 충분히 높을 필요가 있습니다. 단백질을 분리하는 상의 농도는 글로벌 위상 분리가 발생하거나 쉽게 유도될 수 있도록 너무 높을 수 없다. 앵커 DNA 길이(또는 앵커 단백질이 결합하는 변형된 크로마틴의 크기) 및 Halo-융합 앵커 단백질의 농도...
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공개 사항
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감사의 글
이 작품은 미국 국립 보건원 (1K22CA23763201 H.Z., GM118510에서 D.M.C.) 및 찰스 E. 카우프만 재단에 의해 지원되었다. 저자는 원고를 교정제이슨 톤에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신, 0.1% EDTA 칼슘, 마그네슘 및 중탄산나트륨 | 없음 코닝 | MT25053CI | |
| 16% 포름알데히드(w/v), 메탄올이 없는 | Thermo Scientific | 28906 | 1x PBS |
| 6 웰 배양 플레이트 | VWR | 10861-554 | |
| 알루미늄 호일 | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry 항체 | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML 항체 | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 항체 | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 항체 | 세포골격 | Asm23 | |
| 차단 시약 | Roche | 11096176001 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX 튜브 마이크로 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| 원형 커버 슬립 | Thermo Scientific | 3350 | |
| 컨포칼 현미경 | 니콘 | MQS31000 | |
| DAPI | 피셔 사이언티픽 | D1306 | |
| 디메틸 설폭사이드 | L | ||
| DMEM | |||
| 897 | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| 소 태아 혈청, 적격, USDA 승인 지역 | Gibco | A4766801 | |
| 포름아미드, 탈이온화 | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| 염소 항 마우스 IgG (H+L), 재조합 2차 항체, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| 염소 안티-토끼 IgG (H+L), 재조합 보조 항체, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| 고정밀 직선 테이퍼드 초미세 포인트 핀셋/펜치 | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| 레이저 병합 모듈 | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz의 L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection 시약 | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure 플로팅 소프트웨어, MATLAB | The MathWorks | ||
| 현미경 슬라이드 박스 | Fisher Scientific | 34487 | |
| 매니큐어 | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| 이미징 소프트웨어, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM 감소 세럼 미디어 | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10X, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 솔루션,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| 피펫 팁 | VWR | 10017 | |
| 일반 및 젖빛 클리핑 코너 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine 용액 | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| 아지드화 나트륨 | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| 스피닝 디스크 | 요코가와 | CSU-X1 | |
| 스퀘어 커버 슬립 | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x 솔루션 | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | 시 TNH | |
| Synthesized by Chenoweth lab | 시 제공 | ||
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% 용액 | MilliporeSigma | 64-846-350ML | 1x PBS |
| U2Os 세포주 | E.V. Makayev lab(Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
참고문헌
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
- Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
- Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
- Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
- Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
- McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
- Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
- Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
- Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
- Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
- Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
- Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
- Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
- Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
- Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
- Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
- Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726(2009).
- Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
- Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
- Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
- Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
- Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
- Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
- Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
- Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
- Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
- Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
- Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
- Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
- Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
- Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
- Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
- Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
- Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).
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