이 프로토콜은 크로마틴에 응축수를 만들기 위해 화학적으로 유도된 단백질 이질화를 보여줍니다. 화학 이량제와 텔로미어에 대미원식 백혈병 (PML) 핵 체의 형성이 입증된다. 물방울 성장, 용해, 국소화 및 조성물은 살아있는 세포 이미징, 면역 형광 (IF) 및 시상 혼성화 (FISH)에서 형광으로 모니터링됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
크로마틴 관련 응축수는 많은 핵 프로세스에 연루되어 있지만 기본 메커니즘은 여전히 애매합니다. 이 프로토콜은 텔로미어에 응축수를 만들기 위해 화학적으로 유도된 단백질 이압 시스템을 설명합니다. 화학 이량제는 각각 단백질에 결합할 수 있는 두 개의 연결된 리간드로 구성됩니다: 헤일로 리간드에서 헤일로 효소 및 트리메토림(TMP)에서 대장균 디하이드로폴레이트 환원효소(eDHFR)에 각각 결합한다. Halo 효소를 텔로미어 단백질에 융합하여 이머제는 공유 헤일로 리간드 효소 결합을 통해 텔로미어에 이질화합니다. eDHFR에 TMP의 결합은 텔로미어에 단백질을 분리하는 eDHFR 융합 상을 모집하고 응축수 형성을 유도합니다. TMP-eDHFR 상호 작용은 비 공유이기 때문에, 응축은 eDHFR 바인딩을 위한 이질제와 경쟁하기 위하여 초과 자유로운 TMP를 사용하여 반전될 수 있습니다. 텔로미어에 대한 보골세포 백혈병(PML) 핵체 형성을 유도하고 응축수 성장, 용해, 국소화 및 조성물을 결정하는 예가 도시된다. 이 방법은 Halo를 현지 크로마틴에 직접 결합하는 단백질또는 가이드 RNA와 게놈 궤적을 대상으로 하는 dCas9에 직접 결합하는 단백질에 융합하여 다른 게놈 위치에서 응축을 유도하도록 쉽게 적응할 수 있다. 생화학적 분석을 위한 세포의 인구에서 위상 분리를 유지하면서 단하나 세포 라이브 이미징에 필요한 시간적 분해를 제공함으로써, 이 방법은 크로마틴 관련 응축수의 형성과 기능을 모두 조사하는 데 적합합니다.
서론
많은 단백질과 핵산은 액체-액체 상 분리(LLPS)를 거치고 세포1,2에서생화학을 조직하기 위해 생분자 응축수로 자가 조립한다. 크로마틴 결합 단백질의 LLPS는 특정 게놈 loci와 연관되고 각종 국소 크로마틴 기능에 연루되는 응축수의 형성에 이끌어 냅니다3. 예를 들어, HP1 단백질의 LLPS는 게놈4,5,전사 인자의 LLPS를 구성하는 이종로크로마티닌 도메인의 형성을 기초로 하여 전사6,초기 mRNA및 다성 빗 단백질의 LLPS는 그의 mRNA의 전사 및처리를 조절하기 위해 그의 음색 궤적 바디를 생성한다. 그러나 크로마틴 관련 응축수의 많은 예가 발견되었음에도 불구하고 응축수 형성, 조절 및 기능의 기본 메커니즘은 제대로 이해되지 않습니다. 특히, 모든 크로마틴 관련 응축수들이 LLPS를 통해 형성되는 것은 아니며 살아있는 세포에서 응축수 형성에 대한 신중한 평가는 여전히8,
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프로토콜
1. 일시적인 세포주 생산
- 배양 U2OS 수용세포는 22 x 22mm 유리 커버립(라이브 이미징용) 또는 12mm 직경의 원형 커버립(IF 또는 FISH용)에 6웰 플레이트에 다중 D-리신으로 코팅되어 있으며, 성장 배지(10% 태아 소 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액)이 60%에 도달할 때까지 60%의 컨플루엔시에 도달할 때까지 60%의 컨플루엔시에 도달할 때까지 세포.
- 성장 배지를 1mL 경질 배지(페니실린-연쇄절제술용액 이없는 성장 매체)로 교체하십시오.
- 각 트랜스펙트에 대해 150 μL 감소세럼 매체에 4μL 형질 분출 시약을 추가하고 10초 동안 소용돌이를 한 다음 5분 동안 배양합니다.
- 각 웰에 대해, 헤일로 생성 플라스미드(Halo-GFP-TRF1 또는 Halo-TRF1) 및 eDHFR 분단 플라스미드(mCherry-eDHFR-SIM 또는 mCherry-eDHFR-SIM 돌연변이)를 1:1 질량 비(0.5 μg eDHFR-SIM 돌연변이)에 추가하여 0.5μg eDHFR을 구성하는 플라스미드를 150μg 의 파이프를 150μm로 감소시한다.
참고: 태그는 상대적으로 작으며(Halo 33 kD, eDHFR 28kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) ....
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결과
텔로미어 DNA FISH 및 SUMO 단백질 IF에 의해 확인된 SUMO의 텔로메릭 국소화의 대표적인 이미지는 도 2에도시된다. SIM 모집을 가진 세포는 SIM 돌연변이 모집을 가진 세포에 비해 텔로미어에 SUMO1 및 SUMO 2/3을 풍부하게 했습니다. 이는 말단소에 대한 SIM 이수화로 인한 SUMO 농축이 SUMO-SIM 상호 작용에 달려 있음을 나타냅니다.
IMERIzation 후 TRF1 및 SIM의 대표적인 타임랩스 동영상이 비디오 1에표시됩니다. 4개의 시간 포인트의 스냅샷은 그림 3A에표시됩니다. SIM은 텔로미어에 성공적으로 채용되었고, 액체 액적 형성 및성장(그림 1B)에대한 예측대로 SIM및 TRF1 포시가 더 크고 밝아졌습니다. 또한, TRF1 포시의
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토론
이 프로토콜은 화학 적 분수 시스템을 갖춘 텔로미어의 응축수 형성 및 용해를 입증했습니다. 상 분리 및 액적 융합 유도 텔로미어 클러스터링의 운동은 라이브 이미징으로 모니터링됩니다. 응축수 국소화 및 조성물은 DNA FISH 및 단백질 IF로 결정됩니다.
이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 단백질과 이량제 농도를 결정하는 것입니다. 게놈 궤적에서 국소 상 분리를 유도하는 성공은 위상 분리를 위한 중요한 농도 이상의 단백질을 분리하는 위상의 국소 농도 증가에 의존한다(그림 1B). 단백질을 분리하는 단계의 세계적인 농도는 국소 집중될 충분한 단백질이 있기 위하여 충분히 높을 필요가 있습니다. 단백질을 분리하는 상의 농도는 글로벌 위상 분리가 발생하거나 쉽게 유도될 수 있도록 너무 높을 수 없다. 앵커 DNA 길이(또는 앵커 단백질이 결합하는 변형된 크로마틴의 크기) 및 Halo-융합 앵커 단백질의 농도.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 미국 국립 보건원 (1K22CA23763201 H.Z., GM118510에서 D.M.C.) 및 찰스 E. 카우프만 재단에 의해 지원되었다. 저자는 원고를 교정제이슨 톤에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신, 0.1% EDTA 칼슘, 마그네슘 및 중탄산나트륨 | 없음 코닝 | MT25053CI | |
| 16% 포름알데히드(w/v), 메탄올이 없는 | Thermo Scientific | 28906 | 1x PBS |
| 6 웰 배양 플레이트 | VWR | 10861-554 | |
| 알루미늄 호일 | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry 항체 | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML 항체 | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 항체 | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 항체 | 세포골격 | Asm23 | |
| 차단 시약 | Roche | 11096176001 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX 튜브 마이크로 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| 원형 커버 슬립 | Thermo Scientific | 3350 | |
| 컨포칼 현미경 | 니콘 | MQS31000 | |
| DAPI | 피셔 사이언티픽 | D1306 | |
| 디메틸 설폭사이드 | L | ||
| DMEM | |||
| 897 | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| 소 태아 혈청, 적격, USDA 승인 지역 | Gibco | A4766801 | |
| 포름아미드, 탈이온화 | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| 염소 항 마우스 IgG (H+L), 재조합 2차 항체, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| 염소 안티-토끼 IgG (H+L), 재조합 보조 항체, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| 고정밀 직선 테이퍼드 초미세 포인트 핀셋/펜치 | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| 레이저 병합 모듈 | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz의 L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection 시약 | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure 플로팅 소프트웨어, MATLAB | The MathWorks | ||
| 현미경 슬라이드 박스 | Fisher Scientific | 34487 | |
| 매니큐어 | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| 이미징 소프트웨어, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM 감소 세럼 미디어 | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10X, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 솔루션,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| 피펫 팁 | VWR | 10017 | |
| 일반 및 젖빛 클리핑 코너 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine 용액 | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| 아지드화 나트륨 | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| 스피닝 디스크 | 요코가와 | CSU-X1 | |
| 스퀘어 커버 슬립 | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x 솔루션 | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | 시 TNH | |
| Synthesized by Chenoweth lab | 시 제공 | ||
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% 용액 | MilliporeSigma | 64-846-350ML | 1x PBS |
| U2Os 세포주 | E.V. Makayev lab(Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
참고문헌
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology<....
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재인쇄 및 허가
