방법 논문

E1A 미니진 도구를 사용하여 mRNA 접합 변화를 연구합니다.

DOI:

10.3791/62181

⸱

2021년 4월 22일

 ,  , 
1Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual de Campinas

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 화학 요법 치료 후 대체 접합 조절에서 특징이 없는 기능을 가진 단백질의 역할을 평가하기 위한 신속하고 유용한 도구를 제공합니다.

초록

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mRNA 처리에는 5'capping, 폴리-A 첨가 및 접합과 같은 번역을 위한 mRNA를 준비하는 다중 동시 단계가 포함됩니다. 구성 접합 외에도 대체 mRNA 접합은 한 유전자에서 다기능 단백질의 발현을 허용합니다. 상호 작용 연구는 일반적으로 새로운 또는 알려지지 않은 단백질에 대한 첫 번째 분석이기 때문에, 접합 인자를 가진 미끼 단백질의 협회는 mRNA 접합 과정에 참여할 수 있다는 표시이지만, 어떤 맥락이나 어떤 유전자가 규제되는지 결정하는 것은 경험적 과정입니다. 이 기능을 평가하는 좋은 출발점은 고전적인 미니진 도구를 사용하는 것입니다. 여기서 우리는 다른 세포 스트레스 자극 후 대체 접합 변화를 평가하기위한 adenoviral E1A 미니 유전자 사용을 제시한다. 다양한 스트레스 치료 후 Nek4 단백질을 안정적으로 과발현하는 HEK293에서 E1A 미니진의 접합을 평가했습니다. 프로토콜은 E1A 미니유전자 이식, 세포 처리, RNA 추출 및 cDNA 합성을 포함하고, E1A 접합변의 PCR 및 겔 분석 및 정량화에 선행됩니다. 특정 치료와 결합된 이 간단하고 잘 확립된 방법의 사용은 세포 프로세스 또는 mRNA 접합에 의해 통제될 수 있는 어떤 유전자에 빛을 비추기 위하여 믿을 수 있는 출발점입니다.

서론

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접합은 5mRNA 캡핑 및 3'mRNA 폴리아데닐레이션에 동시에 발생하는 진핵 mRNA 처리에서 가장 중요한 단계 중 하나이며, 엑손 접합에 이어 인트론 제거로 구성된다. 접합 부위(SS)의 인식은 작은 리보뉴클레오단백질(snRNP U1, U2, U4 및 U6), 소형 RNA(snRNAs) 및 여러 조절 단백질1을 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체에 의해 접합 부위(SS)를 분리하는 데 필요하다.

인트론 제거(구성)외에도 진핵생물에서 인트론을 유지할 수 있으며 엑손을 배제하여 mRNA 대체 접합(AS)이라는 과정을 구성할 수 있다. 대체 사전 mRNA 접합유전자는 상대적으로 적은 수의 유전자로부터 크고 다양한 수의 단백질을 생산할 수 있도록 진핵 게놈의 코딩 능력을 확장합니다. 하나 이상의 기전을 포함하는 인간 mRNA의 95-100%가 대체 접합2,3을겪을 수 있다고 추정됩니다. 이것은 신경 발달, 세포 운동 활성화 및 세포 스트레스 반응4와같은 생물학적 과정에 대한 기본이며, 유전자의 동일한 레퍼토리를 사용하여 세포 기능을 조절하는 유기체 대안을 제공....

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프로토콜

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1. 도금 세포

참고: 본 설명된 프로토콜에서, HEK293 안정세포주, 이전에 는 Nek4의 안정적인 유도발현을 위해 생성된21개가사용되었지만, 동일한 프로토콜은 HEK29322,HeLa23,24,25,26,U-2 OS27,COS728,SH-SY5YYY YY 29Y와같은 많은 다른 세포주에 적합합니다. 기저 조건 하에서 미니진 E1A 동소형의 발현 패턴은 이 세포 마다 변화하고 각 조건에 대해 특징지어져야 합니다. 이 프로토콜은 안정적인 세포주에 국한되지 않습니다. 후보 단백질의 평가에서 가장 일반적인 접근은 미니진의 고정된 양으로 양을 증가의 일시적인 공동 변환에 의해. 동일한 프로토콜은 녹아웃 셀에 적합합니다.

  1. 차량, 비감염 및 GFP 제어를 고려 중인 플레이트 셀.

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결과

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E1A 미니진을 이용한 5' 스플라이스 부위 분석이 화학요법 박람회 후 세포에서 접합 프로필의 변화를 평가하기 위해 수행되었다. Nek4-isoform 1의 HEK293 안정세포에서 의 한층 형성1이 파클리탁셀 또는 시스플라틴 처리 후 평가되었다.

Adenoviral E1A 지역은 다른 스플라이스 기증자의 사용 때문에 1개의 RNA 전구체에서 3개의 주요 mRNAs의 생산을 책임집니다. 그들은 공통 5'와 3 '테르미니를 공유하지만, 그들의 절제 된 인트론의 크기는 다릅니다. Adenoviral E1A mRNAs는 퇴적계 계수, 13S, 12S 및 9S에 따라 명명됩니다. 아데노바이러스 감염(약 7시간)의 초기 단계에서 바이러스 DNA 복제를 위해 감염된 세포를 준비하는 데 중요한 단백질이 생성되고(13S-723 aa 및 12S-586 aa) 및 후반기(약 18h.......

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토론

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Minigenes는 생체 내에서 접합되는 글로벌 대체 품에 있는 효력을 결정하는 중요한 공구입니다. 아데노바이러스 미니진 E1A는 세포13,14에서이들의 양을 증가시킴으로써 단백질의 역할을 평가하기 위해 수십 년 동안 성공적으로 사용되어 왔다. 여기서는 화학요법 노출 후 대체 접합을 평가하기 위한 미니진 E1A 사용을 제안합니다. Nek4 isoform 1을 발현하는 안정적인 세포주가 사용되어 일시적인 과발성 으로 인한 과발현의 아티팩트를 피했습니다. Nek4의 동위 체형 1은 기저조건(21)에서접합하는 미니진 E1A 대안에 효과를 나타내지 않았지만, 많은 접합 관련 인터랙터가 있어 이러한 세포에서 E1A 대안접합에 있어서 화학요법 치료의 특정 효과를 평가할 수 있게 되었다.

낮은 감도에도 불구하고, 주로 방사성 접근법에 비해, 여기.......

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공개 사항

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저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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우리는 Fundação 드 Amparo 페스타도 데 상파울루 (FAPESP, 그랜트 Temático 를 통해 2017/03489-1 JK와 FLB 2018/05350-3) 및 Conselho Nacional desenvolvimento Cientifico e.tientifico e.에 대한 연구(CNPgico) 우리는 E1A 복제에서 자신의 작품에 대한 pMTE1A 플라스미드와 제러와 동료를 제공 박사 애드리안 Krainer에게 감사드립니다. 우리는 또한 Patrícia Moriel 교수, 완다 페레이라 알메이다 박사, 마르셀로 란셀로티 교수, 카리나 코고 코고 뮐러 교수에게 감사드리며 실험실 공간과 장비를 사용할 수 있게 해 주었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100pb DNA 사다리Invitrogen15628-050
6웰 플레이트Sarstedt833920
AgaroseSigmaA9539-250G
시스플라틴SigmaP4394
DEPC 물ThermoFisherAM9920
DMEMThermoFisher11965118
dNTP 믹스ThermoFisher10297-018
태아 소 혈청 - FBSThermoFisher12657029
형광 현미경LeicaDMIL LED FLUO
Gel 이미징 수집 시스템 - ChemiDoc Gel Imagin 시스템Bio-Rad
GFP - pEGFPC3Clontech
HEK293 안정 세포 - HEK293 Flp-InFlp-In&trade에서 생성됨; T-REx&트레이드; 293 - Invitrogen and described in ref 21
Hygromycin BThermoFisher10687010Used for Flp-In cells maintenemant
이미지 처리 및 분석 소프트웨어 - FIJI 소프트웨어ref. 32
Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus ReagentPolyplus117-07
Oligo DTThermoFisher18418020
PaclitxelInvitrogenP3456
플레이트 리더/ UV 흡광BiotechEpoch Biotek/ Take3 어댑터
pMTE1A 플라스미드Dr. Adrian Krainer
pMTE1A FInvitrogen  5' -ATTATCTGCCACGGAGGT-3
pMTE1A RInvitrogen5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3'
냉장 원심분리기EppendorfF5810R
Reverse Transcriptase - M-MLVThermoFisher28025013
Reverse transcriptase - Superscript IVThermoFisher18090050
Ribunuclease inhibitor RNAse OUTThermoFisher10777-019
RNA extraction phenol-chloroform based reagent - TrizolThermoFisher15596018
SybrSafe DNA 젤 염색ThermoFisherS33102
Taq PlatinumThermo10966026
TetracyclinSigmaT3383Flag empty 또는 Nek4- Flag Expression Induction
Thermocycler Bio-RadBio-RadT100
TrypsinSigmaT4799

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of....

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재인쇄 및 허가

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태그

HEK293RNAcDNAPCR

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