여기서 우리는 3D 서스펜션 문화에서 표피 스페로이드의 체계적인 재배를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 상피 조직 유형과 여러 인간의 질병 및 조건의 모델링에 사용하기위한 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
상피 이장애는 만성 상처, 염증 및 모든 인간 암의 80 % 이상을 포함하여 다양한 인간 질환과 질병을위한 노드입니다. 안 감 조직으로, 피부 상피는 종종 부상의 대상이 되며 손상 된 조직을 복구 하는 데 필요한 세포 가소성을 획득 하 여 진화적으로 적응. 수년에 걸쳐, 시험관 내 및 전 생체 세포 기지를 둔 모형을 사용하여 상피 가소성을 연구하기 위하여 몇몇 노력이 있었습니다. 그러나, 이러한 노력은 상피 세포 가소성의 다양한 단계를 재구성하는 능력에 제한되었습니다. 우리는 여기에서 1 차적인 신생아 인간 각질 세포에서 3D 표피 스페로이드 및 표피 스페로이드 유래 세포를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 표피 스페로이드 배양의 용량을 기능적으로 모델링하여 각질 세포 생성 가소성의 뚜렷한 단계를 모델링하고 표피 스페로이드 재도금이 이질적인 정상적인 인간 각질 세포(NHKc) 배양을 풍부하게할 수 있음을 입증하여 인테그린α6 hi/EGFR로아티뉴세포 와 같은 강화된 스모티코세포 와 같은 스모티코세포 분뇨 를 특징으로 합니다. 우리의 보고서는 피부 각질 세포 가소성 및 표피 재생의 연구를 위한 높은 처리량 시스템의 발달 그리고 유지에 설명합니다.
서론
포유류 계층화 상피는 모든 생활 시스템에서 가장 복잡한 상피 아키텍처이며 가장 자주 손상과 부상의 대상이됩니다. 보호 조직으로서, 계층화된 상피는 복잡하고 효과적인 조직 손상 반응을 생성하기 위해 진화했습니다. 부상 시, 이러한 세포는 리니지 가소성 프로그램을 활성화해야하며, 이를 통해 부상당한 부위로 마이그레이션하여 수리1,2,3을수행할 수 있습니다. 이 다각적 인 응답은 제대로 이해되지 않은 몇 가지 순차적 단계에서 발생합니다.
상피 재생의 복잡한 과정을 연구하는 데 있어 가장 큰 장애물은 세포 재생의 정의된 단계에서 동적 세포 활동을 포착할 수 있는 높은 처리량 모델 시스템의 발굴에 있습니다. 생체 내 마우스 모델은 상처 치유에 대한 관련 통찰력을 제공하고 인간의 재생 과정을 가장 밀접하게 재구성하지만, 개발은 힘든 노력과 상당한 비용이 필요하므로 처리량 용량을 제한합니다. 따라서 높은 처리량 규모에서 인간 상피 조직 재생의 기능적 조사를 가능하게 하는 시스템을 확립해야 하는 중요한 필요성이 존재합니다.
최근 몇 년 동안,....
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프로토콜
피부 표본의 수집 및 취급 및 인간 각질 세포의 격리를 위한 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 대학 (UofSC) IRB에 의해 검토되고 "인간 과목을 포함하지 않는 연구"로 분류되었습니다, 포피 표본은 일상적인 외과 적 절차 (신네이트 소년의 할례) 동안 생성 된 외과 폐기로, 완전히 식별 정보가 없는. 이 프로토콜은 또한 UofSC 생물 안전 위원회에 의해 정기적으로 검토되고 승인되었으며 모든 실험실 직원은 실험실 생물 안전 교육을 받았습니다. 모든 절차는 UofSC의 안전 및 윤리 기준에 일치하여 수행되었습니다.
1. 신생아 포피부 조직에서 인간의 각질 세포의 격리 및 문화
- KSFM 배지의 500mL에 0.1 M HEPES 버퍼를 추가하여 세척 매체를 준비하고 7.2의 pH로 조정한다. 500mL 진공 필터(0.22 μm 모공 크기)로 배지를 살균합니다. MCDB 153-LB 기저형은 KSFM 대신 대체 세척 용액으로도 사용할 수 있습니다.
- 라미나르 플로우 후드에 50mL 원판 튜브에 5mL의 워시 미디어로 신생아 포피를 씻으십시오. 두 번 반복합니다.
- 씻은 포피를 멸균 페트리 접시에 옮기. 메스와 집게를 사용하여 진피 층에서 지방과 느슨한 결합 조직을 긁어 냅니다. 50mL 원물 튜브에서....
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결과
피부 표피피스피어 분석 시 NHKc 배양은 96웰플레이트(도 1A)의아가로즈 코팅 된 우물에서 시드된다. 스페로이드 형성 세포는 48시간 이내에 자가 집계되어야 합니다. 자율 스페로이드 형성은 표준 반전 위상 대비 현미경을 사용하여 24 시간 초에 평가될 수 있습니다. 피부 표피구 형성 및 재도금 분석 모델은 표피 조직 재생의 다양한단계(도 1B). 도 2는 3D 배양에서 표피 스페로이드 형성 능력을 위해 분석된 다양한 NHKc 균주의 고해상도 이미지를 나타낸다. 이것은 자발적인 스페로이드 형성의 특징이기 때문에 조밀 한 구 모양 응집세포를 검사하는 것이 중요합니다. 우리는 적절한 자발적 응집성을 보장하기 위해 2 x 104 세포 이상을 사용할 필요가 발견했습니다. 균주 도 2A에서볼 수 있는 비구.......
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토론
3D 스페로이드 배양 시스템의 사용은 세포 줄기를 평가하는 데 광범위한 유틸리티를 가지고 있다. 이러한 시스템은 조직 줄기 세포의 농축을 향상시키기 위해 입증되었습니다13,아직 인간의 표피 줄기 세포의 연구를위한 자신의 유틸리티는 제한적으로 탐구하고있다. 여기서는 3D 배양 기술을 사용하여 인간 각질 세포 줄기 세포를 풍부하게 하는 전략을 설명합니다. 이 시스템에서 NHKc는 KSFM-scm이 함유된 아가로즈 침대 위에 매달린 여러 각질 세포 구형으로 구성된 자체 조립 다세포 스페로이드 서스펜션으로 재배됩니다. 이 프로토콜에 대한 설정은 한천이 실온에서 빠르게 중합됨에 따라 시간에 민감합니다. 예열 세리컬 파이펫, 마이크로파이펫 팁, 그리고 한천/세포 혼합 튜브뿐만 아니라 42°C의 매체는 조기 중합을 극적으로 감소시킬 수 있다. 우리는 우물에 한천/미디어 믹스를 첨가한 직후 96웰 플레이트를 4°C에 넣으면 중합화를 상당히 가속화하고 한천 쿠션이 세포의 후속 파종에 충분히 견고하다는 .......
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공개 사항
저자는 공개할 재정적 관계가 없습니다.
감사의 글
UofSC 의과 대학 계측 자원 시설 (IRF)은 이미징 및 세포 선별 장비 및 기술 지원에 대한 액세스를 제공했습니다. 이 작업은 보조금 1R21CA201853에 의해 부분적으로 지원되었습니다. MCF와 IRF는 NIH 보조금 P20GM103499, SC INBRE로부터 부분 지원을 받습니다. MCF는 또한 NIH 보조금 P20GM109091의 지원을 받습니다. 이본 워피(Yvon Woappi)는 NIH 보조금 2R25GM066526-06A1(PREP)과 R25GM076277(IMSD)과 UofSC의 그레이스 조던 맥파든 교수 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다. 제럴딘 에제카와 저스틴 베르첼리노는 UofSC에서 NIH 보조금 2R25GM066526-10A1 (PREP)에 의해 지원되었다. 숀 M. 블로오스는 UofSC에서 2016 마젤란 학자 상을 수상했다.
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재료
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| Affymetrix 플랫폼 | Affymetrix | 마이크로어레이 실험용 | |
| Affymetrix ' s HuGene-2_0-st 라이브러리 파일 | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | 마이크로어레이 실험용 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | RNA 분리에 사용됨 |
| 분석 콘솔 소프트웨어 버전 3.0.0.466 | 분산의 단방향 피험자 간 분석을 사용하여 세포 유형별 전사 반응을 분석 | ||
| BD FACSAria II 유세포 분석기 | Beckman | 유세포 분석 | |
| 콘솔 소프트웨어 버전 3.0.0.466/Expression console 소프트웨어 | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | 데이터 품질 확인용 | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | 세포 배지용 |
| FITC-conjugated anti-integrinα 6 | Abcam | ab30496 | FACS 분석용 |
| GeneChip Command Console 4.0 소프트웨어 | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | 데이터 품질 확인용 | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | 하이브리드 어레이의 세척 및 염색용 | |
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| 인간 표피 성장 인자(hEGF) | 세포 신호 전달 기술 | 8916 | 세포 매체용 |
| 인간 인슐린 | Millipore Sigma | 9011-M | 세포 매체용 |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | RT-qPCR에 사용되는 | Bio-Rad | |
| 1708880 iScript cDNA 합성 키트 | Bio-Rad | 1708890 | 다음에 사용됩니다. RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | 1% 페니실린/스트렙토마이신, 20ng/ml EGF, 10ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자, 0.4% 소 혈청 알부민(BSA) 및 4 &마이크로가 보충되었습니다. g/ml 인슐린 |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | 1% 페니실린/스트렙토마이신, 20ng/ml EGF, 10ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자, 0.4% 소 혈청 알부민(BSA) 및 4 &마이크로가 보충되었습니다. g/ml 인슐린 |
| MCDB 153-LB 기저 매체 | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB 기저 매체(HEPES 완충액 포함 |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR (San Jose, CA; 카탈로그 번호) | BD Pharmingen | 555997 | FACS 분석용 |
| pMSCV-IRES-EGFP 플라스미드 벡터 | Addgene | 20672 | 형질주입용 |
| Promega TransFast 키트 | Promega | E2431 | 형질주입용 |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 마이크로어레이 실험용 | |
| Thermo Scientific™ 멸균 일회용 진공 필터 장치 | Thermo Scientific | 09-740-63D | 세포 매체용 |
| Zeiss Axionvert 135 형광 현미경 | Zeiss | Axiovision Rel. 4.5 소프트웨어와 함께 사용 |
참고문헌
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dyna....
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