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방법 논문

고주파 두개골 이중 초음파를 가진 수브라크누이드 출혈의 뮤린 모형에 있는 뇌 혈관경련의 분석

3.6K 조회수

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DOI:

10.3791/62186

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2021년 6월 3일

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1Department of Neurosurgery, University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University of Mainz, 2Center for Cardiology - Cardiology I, University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University of Mainz, 3Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University of Mainz, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK) - Partner site Rhine-Main, 5Department of Anesthesiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University of Mainz

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 원고의 목적은 마우스의 대뇌 동맥에서 혈류의 생체 내 이미징을 허용하는 초음파 기반 방법을 제시하는 것입니다. 우리는 지주 막 증 출혈의 뮤린 모델에서 혈관 경련과 관련 된 혈액 흐름 속도의 변화를 결정 하기 위해 그것의 응용 프로그램을 보여줍니다 (SAH).

초록

치피 뇌졸중의 일종인 체해 출혈 후 몇 주 후에 발생하는 뇌 혈관질은 뇌허혈지연에 기여합니다. SAH의 뮤린 모델을 사용하여 실험 연구에서 발생하는 문제는 마우스에서 뇌 혈관 경련의 생체 내 모니터링방법이 부족하다는 것입니다. 여기서, 우리는 마우스에 대한 경두개 이중 초음파 검사를 수행하기 위해 고주파 초음파의 적용을 보여줍니다. 이 방법을 사용하여 내부 경동맥(ICA)을 식별할 수 있습니다. 두개내 IcA의 혈류 속도는 SAH의 유도 후 크게 가속화되었으며, 두개골 ICA의 혈류 속도는 뇌 혈관 경련을 나타내는 낮은 상태를 유지했습니다. 결론적으로, 여기서 입증된 방법은 뮤린 SAH 모델에서 뇌 혈관경련의 기능적 비침습적 생체 내 모니터링을 허용한다.

서론

자발적인 지주막 출혈 (SAH)은 주로 두개 내 동맥류1의파열로 인한 출혈성 뇌졸중의 한 형태이다. 신경학적 결과는 주로 출혈의 효과와 관련된 과도 글로벌 뇌 허혈의 영향으로 인한 조기 뇌 손상(EBI)과 출혈2,3다음 주 동안 발생하는 지연된 대뇌 허혈(DCI)의 두 가지 요인에 의해 좌우된다. DCI는 SAH 환자의 최대 30%에 영향을 미치는 것으로 보고되었다2. DCI의 병리학은 혈관 신생 뇌 혈관 경련, 미세 혈관 경련 및 미세 혈전증으로 인한 방해 된 미세 순환, 피질 확산 우울증 및 염증4에의해 유발되는 효과를 포함한다. 불행하게도, 정확한 병리 생리학은 불분명남아 효과적으로 DCI3을방지하는 가능한 치료가 없습니다. 따라서 DCI는 많은 임상 및 실험 연구에서 조사됩니다.

요즘, SAH에 대한 대부분의 실험 연구는 특히 마우스5,6,7,8,9,10,11,12,13에서작은 동물 모델을 사용합니다. 이러한 연구에서, 대뇌 혈관 경련은 자주 끝점으로 조사. 혈관 경련 ex vivo의 정도를 결정하는 것이 일반적입니다. 이것은 짧은 마취 시간을 요구하고 동물에 작은 고민만 부과하는 뇌 혈관 경련의 생체 내 검사에 대한 비침습적 방법이 부족하기 때문이다. 그러나 생체 내에서 뇌 혈관 경련을 검사하는 것이 유리할 것입니다. 이것은 마우스에 있는 혈관 경련에 생체 내 연구 결과에 있는 세로 연구를 허용할 것이기 때문입니다 (즉, SAH의 유도 후에 일 도중 다른 시점에서 뇌 혈관 경련의 화상 진찰). 이렇게 하면 다른 시점에서 획득한 데이터의 비교도가 향상됩니다. 또한, 세로 학습 설계를 사용하는 것은 동물 수를 줄이는 전략입니다.

여기서 우리는 마우스에 있는 대뇌 동맥에 있는 혈류를 결정하기 위하여 고주파 경두개 초음파의 사용을 보여줍니다. 우리는 두개골 도플러 소노그래피 (TCD) 또는 경두개 색으로 구분된 이중 소노그래피 (TCCD)와 유사한 임상 실습14,15,16,17,18,이 방법은 자궁 내 의 혈류 속도를 측정하여 뇌 혈관 경련을 모니터링하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

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프로토콜

동물 실험은 책임있는 동물 관리위원회 (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz)에 의해 승인되고 독일 동물 복지법 (TierSchG)에 따라 실시되었습니다. 동물의 치료와 사용에 대한 모든 해당 국제, 국가 및 제도적 지침이 준수되었습니다. 이 연구에서는 19-21 g 사이의 체중으로 11-12 주 세 여성 C57BL/6N 마우스에서 두개 내 및 두개골 동맥의 혈류 속도의 측정을 수행했습니다. 마우스는 SAH 유도 또는 가짜 수술을 받았으며, 이는 다른 곳에서 자세히 설명된10,12,13.

1. 재료 의 준비

  1. 초음파 기계를 켜고 동물 ID를 입력합니다.
  2. 초음파 시스템의 가열 판을 37 °C로 데우습니다. 직장 온도 프로브를 사용할 준비가 되었는지 확인합니다.
  3. 수조를 사용하여 초음파 젤을 37 °C로 가열하십시오. 제모 크림, 전극에 대한 접촉 크림, 눈 연고를 준비합니다.

2. 마취

  1. 마우스를 챔버에 넣고 4% 이소플루란과 40% O2로 1분 동안 세척하여 마취를 유도한다. 눈 연고로 눈을 보호합니다. 충분히 깊은 마취에 도달 한 후에만 계속 (통증 자극에 대한 반응의 부재).
  2. 전체 절차 전반에 걸쳐 마취 마스크를 사용하여 1.5 % 이소플루란과 40 % O2로 마취를 유지하십시오.

3. 두개 내 내 경동맥의 혈류 속도 의 결정 및 경두개 고주파 이중 음조

  1. 37°C의 체온을 유지하기 위해 초음파 시스템의 가열 판에 마우스를 놓습니다.
  2. 전도성 페이스트로 동물의 네 가지 사지를 코팅하고 보드에 내장 된 심전도 전극에 테이프로 고정합니다. 생리학적 파라미터(ECG, 호흡 신호)가 이미징 시스템의 화면에 올바르게 표시되는지 확인합니다(예: Vevo3100). 필요한 경우 마취 수준을 조정하여 분당 400-500 비트 (bpm)의 목표 심박수를 얻습니다.
  3. 직장 온도 프로브에 윤활유를 놓고 조심스럽게 삽입하여 체온을 모니터링합니다. 필요한 경우 추가 온난화 램프를 사용합니다.
  4. 첫 번째 시험 전에, 제모 크림을 사용하여 화학적으로 occiput에서 모피를 제거합니다. 면봉을 사용하여 머리카락이 빠지기 시작할 때까지 크림을 2 분 동안 펴고 문지릅니다.
    1. 추가 로 2 분 후, 주걱으로 크림과 머리카락을 제거하고 알코올 피부 방부제로 피부를 소독하십시오. 37°C로 따뜻하게 데운 초음파 젤로 코팅하십시오.
  5. 38MHz 선형 어레이 트랜스듀서와 200프레임/s 이상의 프레임 속도를 사용하여 초음파 이미지를 획득하고 기계암의 프로브를 고정합니다. 트랜스듀서를 30°로 기울어진 occiput에 놓습니다.
  6. 밝기(B)모드와 컬러 웨이브(CW) 도플러 모드를 사용하여 오른쪽 두개 내 내부 경동맥을 시각화하고 동맥의 최대 흐름이 발견될 때까지 제어 장치로 트랜스듀서를 앞뒤로 이동합니다.
  7. 해부학 정보를 수집하려면 기존의 B 모드 및 CW-도플러 모드를 사용하고 획득 버튼을 클릭하여 수집을 시작합니다.
    1. 두개내 선박의 유동 특성에 대한 정보를 기록하려면 펄스웨이브(PW) 도플러 버튼을 클릭하고, 시료 부피를 용기 중앙에 배치하고, 3s보다 긴 시네 루프를 획득한다.
  8. 왼쪽과 동일하게 진행합니다.
  9. 두개골 경동맥을 진행합니다.

4. 고주파 이중 음극을 가진 초두개 내경 동맥의 혈류 속도 의 결정

  1. 37°C의 체온을 유지하기 위해 초음파 시스템의 가열 판상에 마우스를 배치합니다.
  2. 전도성 페이스트로 동물의 네 가지 사지를 코팅하고 보드에 내장 된 심전도 전극에 테이프로 고정합니다. 화면에 생리 적 매개 변수의 올바른 디스플레이를 다시 확인합니다.
  3. 첫 번째 시험 전에, 위에서 설명한 바와 같이 제모 크림을 사용하여 전두부목에서 모발을 화학적으로 제거하십시오. 37°C로 따뜻하게 데워진 초음파 젤로 앞목을 코팅합니다.
  4. 38MHz 선형 어레이 트랜스듀서와 200프레임/s 이상의 프레임 속도를 사용하여 초음파 이미지를 획득합니다. 트랜스듀서를 동물과 평행하게 배치하고 올바른 경동맥의 세로 이미지를 얻기 위해 위치를 조정한다.
  5. 밝기-(B) 모드와 컬러 웨이브(CW) 도플러 모드를 사용하여 올바른 경동맥을 시각화합니다. 이미지에는 올바른 일반적인 경동맥(RCC), 올바른 내부 경동맥(RICA) 및 오른쪽 외부 경동맥(RECA)이 포함되어야 합니다.
  6. 해부학 정보를 수집하려면 기존의 B 모드 및 CW-도플러 모드를 사용하고 획득 버튼을 클릭하여 수집을 시작합니다.
    1. 맥박파(PW) 도플러 버튼을 클릭하면 초두개 동맥의 흐름 특성에 대한 정보를 기록하려면, 일반적인 경동맥, 내부 경동맥 및 외부 경동맥의 중앙에 샘플 볼륨을 배치하고 3s 보다 긴 시네 루프를 획득한다.
  7. 왼쪽과 동일하게 진행합니다.
  8. 마취를 종료하고 온난화 플레이트에서 동물을 제거합니다. 저체온증을 방지하고 완전한 회복을 확인하기 위해 1 시간 동안 37 °C로 가열 된 인큐베이터에 배치 된 케이지로 동물을 반환하십시오.

5. 초음파 검사 데이터 처리

  1. 고주파 초음파 데이터의 후처리를 위해 외부 워크스테이션을 사용합니다. B 모드, CW-도플러 모드 및 PW-도플러 모드 이미지와 시네 루프를 내보냅니다.
  2. 수출 된 초음파 연구를 엽니 다. 한 동물을 선택하고 두개 내 경동맥의 PW-도플러 시네 루프를 엽니다. 이 프로토콜에서는 일반적으로 7~8개의 하트비트와 해당 유량 속도 곡선이 기록됩니다.
  3. 시네 루프를 일시 중지하고 측정 버튼을 클릭합니다. 혈관 패키지를 선택하고 RICA PSV를 클릭하여 최대 수축기 압력(PSV)을 측정합니다. 이제 속도 곡선의 피크를 왼쪽으로 클릭하고 직선을 0 선으로 당깁니다. 오른쪽 마우스 버튼을 클릭하여 측정을 결정합니다.
  4. 이제 RICA EDV를 선택하여 종말 속도(EDV)를 측정합니다. 디아스톨 끝에 속도 곡선의 최소한의 발진을 왼쪽으로 클릭합니다. 선을 0선으로 바로 당기고 오른쪽 마우스 버튼을 클릭하여 측정을 결정합니다.
  5. RICA VTI를 선택하여 속도 시간 일체형(VTI)을 측정합니다. 속도 곡선의 시작 부분에 왼쪽을 클릭하고 확장기 고원의 끝까지 마우스와 곡선을 따릅니다. 그런 다음 마우스를 다시 클릭하여 측정을 결정합니다.
  6. 보고서 버튼을 사용하여 인트레이스 내경 동맥의 데이터를 내보냅니다. 내보내기를 누르고 데이터를 VSI 보고서 파일로 저장합니다.
  7. 동일한 접근 방식을 사용하여 오른쪽 두개골 내부 경동맥의 PSV, EDV 및 VTI를 측정하고 그에 따라 데이터를 내보냅니다.
  8. 왼쪽과 동일하게 진행합니다.

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결과

6마리의 마우스에서, 3마리가 샴 수술을 받는 동안 내측 경동맥(ICA)과 자궁내경동맥(ICA)의 혈류 속도가 수술 1일 전에 결정되었고, 수술 후 1일, 3, 7일 동안 내혈관 필라멘트 천공 모델을 사용하여 SAH를 유도하였다. 측정은 37°C19에서체온을 유지하면서 이소플루란을 가진 마취하에 다른 연구의 에코카르디그래피 검사의 일환으로 수행되었다.

수술 전, 초두개 및 두개 내 혈류 속도뿐만 아니라 내외 혈액 흐름의 수분은 SAH와 가짜 동물 사이에 유사했습니다. SAH 유도 후 첫날에는 두개 내 혈류 속도 또는 두개 내 및 외두개 혈류의 비율에 큰 변화가 없었습니다.

3일과 7일에 ICA의 두개 내 혈류 속도는 SAH 동물의 2에서 현저하게 증가하여 SAH 후 뇌 혈관 경련을 나타냅니다. 두개골 혈류 속도가 거의 변하지 않았기 때문에, 대뇌 혈관 경련을 나타내는 SAH 동물의 7 일...

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토론

우리의 지식의 최고에, 이 연구는 고주파 경두개 색 으로 코딩 된 듀플렉스 초음파와 SAH의 뮤린 모델에서 뇌 혈관 경련의 모니터링을위한 프로토콜을 제시하는 첫번째입니다. 우리는 이 방법이 마우스에 있는 SAH 유도 후에 두개 내 혈류 속도의 증가를 측정할 수 있다는 것을 보여줍니다. 인간 의학에서 이 현상은 잘 알려져있다3,15. 몇몇 임상 연구는 큰 두개 내 동맥의 높은 혈류 속도와 자궁 내 및 외두개 혈류 속도의 높은 몫이 혈관 협개및 혈관 질화증과 상관 관계가 있는 기능적인 결과이다는 것을 보여주었습니다(15에서검토됨). 임상적 관행에서, 따라서 SAH3,15이후 뇌 혈관 경련의 비침습적 침대 측 모니터링을 위해 TCD 또는 TCCD를 사용하는 것이 일반적이다.

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공개 사항

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

저자는 비디오에서 일러스트의 준비스테판 킨델에게 감사드립니다. PW, MM 및 SHK는 독일 연방 교육 연구부(BMBF 01EO1503)의 지원을 받았습니다. 이 작품은 독일 연구 재단 (DFG INST 371/47-1 FUGG)의 대규모 계측 보조금에 의해 지원되었다. MM은 엘스 크뢰너-프레세니우스-스티퉁(2020_EKEA.144)의 보조금으로 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Balea 제모 크림Balea; 독일ASIN B0759XM39V제모 크림
C57BL/6N 마우스Janvier; Saint-Berthevin Cedex, 프랑스n.a.mice
CorneregelBausch& 롬; 미국 뉴욕주 로체스터REF 81552983안연고, 윤활
면봉Hecht Assistent; Sondenheim vor der Rö hn, 독일REF 44302010면봉
Ecco-XS 면도기Tondeo; Soligen, 독일DE 28693396면도기
전극 크림GE; 보스턴, 매사추세츠, 미국REF 21708318전도성 페이스트
가열판Medax; Kiel, 독일2005-205-01
IsofluraneAbvie; 독일 비스바덴n.a.휘발성 마취제
LeukofixBSN medical; 독일 함부르크REF 02137-00테이프
기계 팔 + 미세 조작기VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CAP/N 11277
마이크로백 티슈Paul Hartmann AG; 독일 함부르크REF 981387항균 조직
MZ400, 38MHz 선형 어레이 변환기VisualSonics; FujiFilm, 토론토, CAREF 51068-30초음파 변환기
SonosidASID Bonz GmbH; Herrenberg, 독일REF 782010초음파 검사 젤
초음파 플랫폼(가열판 및 ECG 기록VisualSonics 포함); FujiFilm, 토론토, CAP/N 11179
UniVet-PortaGroppler; 독일 Oberperasberg,S/N BKGM0437이소플루란 기화기
Vevo3100VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CAREF 51073-45초음파 검사 장치
VevoLab 소프트웨어VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CAn.a.평가 소프트웨어

참고문헌

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  12. Neulen, A., et al. Large Vessel Vasospasm Is Not Associated with Cerebral Cortical Hypoperfusion in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
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  14. Neulen, A., et al. Volumetric analysis of intracranial vessels: a novel tool for evaluation of cerebral vasospasm. Int J Comput Assist Radiol Surg. 14 (1), 157-167 (2019).
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