호스트-병원균 상호 작용을 연구하기 위하여 동일 종에서 항체를 사용하여 면역 형광을 이중 표지합니다

요약

여기서, 프로토콜은 숙주 병원체 상호 작용을 연구하기 위하여 동일 종에서 제기된 1 차적인 항체를 사용하여 이중 표지면역형광을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 본 프로토콜에서 상이한 숙주에서 제3 항체를 포함할 수 있다. 이 접근은 어떤 세포 모형 및 병원체든에서 할 수 있습니다.

초록

요즘, 기생충 호스트 세포 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수있는 분자 도구의 넓은 범위를 찾을 수 있습니다. 그러나, 기생충에 있는 특정 세포 구조 및 단백질을 인식하는 상업적인 단클론 또는 다각성 항체를 얻기 위하여 몇몇 한계가 존재합니다. 게다가, trypanosomatids를 표시하기 위하여 유효한 몇몇 상업적인 항체가 있습니다. 일반적으로 기생충에 대한 다발성 항체는 사내에서 제조되며 동일한 종에서 생산되는 다른 항체와 함께 사용하기가 더 어려울 수 있습니다. 여기서, 이 프로토콜은 숙주 세포 및 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 이중 표기 면역 형광을 수행하기 위해 동일한 종에서 자란 폴리클론 및 단일 클론 항체를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이중 라벨링 면역형광을 달성하기 위해, 마우스 폴리클론 항체를 먼저 배양한 다음 임의의 플루오로크롬에 컨쥬게이트된 이차 마우스 IgG 항체로 인큐베이션을 따르는 것이 중요하다. 그 후, 1차 항체의 흔적이 다음 이차 항체에 의해 인식되는 것을 막기 위해 추가 차단 단계가 필요하다. 이어서, 마우스 단일클론 항체 및 상이한 플루오로크롬에 공주되는 특정 IgG 서브클래스 이차 항체가 적절한 시기에 시료에 첨가된다. 또한, 상이한 종에서 자란 제3 항체를 사용하여 면역형광을 삼중 라벨링수행이 가능하다. 또한, 핵 및 액틴과 같은 구조는 특정 화합물 또는 라벨로 이후에 염색될 수 있다. 따라서, 여기에 제시된 이 접근은 1차 항체의 근원이 제한되는 어떤 세포든지에 대해 조정될 수 있다.

서론

세포 수준에서 숙주 세포와 병원체의 상호 작용을 연구하기 위해 바이러스, 박테리아 및 원생동물과 같은 다른 그룹이 대부분의 숙주 ^{세포 유형을 감염}시킬 수 있기 때문에 질병의 근본 원인에 대한 필수 정보를 제공한다1,2,3,4. 그것은 또한 개발 하 고 병원 체의 성장을 느리게 하거나 억제할 수 있는 잠재적인 치료 목표를 식별 하는 데 도움이 수 있습니다. 살아있는 조건에서, 생성된 항체는 자기 성분, 바이러스, 세균성 성분 또는 제품, 곰팡이, 기생충 및 그 외5에서 항원을 인식하는 책임이 있습니다⁵.

이러한 목적을 위해, 항체는 주로 세포 구조 및 단백질의 위치와 기능을 이해하기 위한 도구로 널리 사용된다. 다중 항체 라벨링을 이용한 여러 연구는 추가 차단 단계가 면역 지역화의 특이성에 기여한다는 것을 보여준다. 또한, 대부분의 기량 프로토콜은 동일한 숙주 종에서 항체를 포함하는 특정 상업적 단일 클론 항체를 사용^{하며 6,7,8,9,10,11,12,13,14를} 사용한다.

일반적으로, 이중 표지 면역 형광은 관심의 세포 구조 또는 병원균 및 숙주 세포 사이의 상호 작용을 보기 위해 다른 종에서 제기 된 두 개의 항체를 사용합니다. 그러나, 이는 일부 병원체에 특이적인 상업적 단일클론 또는 폴리클론 항체가 이중 라벨링을 수행할 수 없을 때 문제가 될 수 있다. 또한, 시판되는 항체 컨쥬게이션 키트가 있으며, 1차 항체를 수치니미딜 에스테르 반응¹⁵에 의해 플루오로포레에 직접 접목할 수 있다. 문제는 이러한 키트는 종종 비싸며 라벨을 붙일 충분한 항체가 필요하다는 것입니다. 이를 알고, 우리는 성공적으로 Trypanosoma brucei16에서 단백질 국소화를 연구하기 위하여 동일 종에서 제기된 2개의 다른 항체를 사용하여 이중 면역 형광 방법을 개발했습니다. 그러나, 세포 내 기생충에 대 한, Trypanosoma cruzi를 포함 하 여, 이 접근 은 입증 되지 않았습니다. 여기서, 우리는 교차 반응 없이 동일한 종에서 제기된 1차 항체를 사용하여 세포내 T. cruzi 기생충 및 숙주 세포를 연구하기 위하여 이중 표지 면역 형광을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이 방법 외에도, 다른 종으로부터 제3 항체를 첨가하여 삼중 면역 형광 라벨링이 확립되었다. 이러한 접근법은 항체의 근원이 제한되고 모든 세포 모형에서 사용될 수 있을 때 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 세포 및 기생충 배양

1. 10% 열 불활성으로 보충된 RPMI 배지에 함유된 25cm2 세포 배양 플라스크에서 미국형 배양 컬렉션(CCL-7)에서 LLC-MK2(Rhesus 원숭이 신장 상피) 세포를 성장 FBS(태아 소 혈청) 및 항생제(U/mL 페니실린 100개 및 100μg/mL 연쇄절제술)에서 37°C에서 5% _CO2 ¹⁷.
2. 이전 프로토콜⁽¹⁸)에 따라 트리파노종 크루지(Y 균주)로 LLC-MK2 세포를 감염시다.
3. 15mL 세포 배양 원심분리기 튜브 및 원심분리기에서 10분 및 22°C에서 LLC-MK2 감염된 세포(5mL)의 상체를 수집하여 세포 이물질을 낮춥니다. 37°C에서 10분간 튜브를 유지하여 시험대고가 상체로 수영할 수 있도록 합니다.
4. 22°C에서 15분 동안 2500 x g에서 새로운 원심분리기및 원심분리기에서 상퍼를 수집합니다. 초신자를 버리고 완전한 RPMI 배지에서 기생충을 함유한 펠릿을 회수하여 노이바우어 챔버에서 세포를 계수하여 세포 밀도를 결정한다.

2. 면역 형광 프로토콜 제어

참고: 일단 고정되면, 1주일 동안 1x PBS(pH 7.2)에 4°C의 커버립이 들어 있는 플레이트를 보관할 수 있다. 저장하려면 세포가 투과성 화 단계를 거치지 않는 것이 중요합니다.

1. 16시간 동안 RPMI 매체에 UV 살균 둥근 커버립을 함유한 24개의 웰 플레이트에 LLC-MK2 셀(2 x ¹⁰⁴)을 세정한다.
2. 감염된 세포의 경우, T. cruzi (항목 1.4)를 포함하는 상체를 각 우물에 비례 (MOI 10:1)를 추가하고 감염의 6 h를 둡니다. 워시 커버립은 PBS 용액으로 감염 및 비감염 세포를 5회 포함하고 실온(RT)에서 10분 동안 1x PBS(pH 7.2)로 파라포름알데히드2%로 고정한다.
3. 커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS(pH 7.2)로 세척합니다.
4. 1x PBS(PH 7.2)에서 0.2%의 IGEPAL CA-630으로 커버립을 10분 동안 페메아빌라이징합니다.
5. 커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.
6. 차단 용액으로 RT에서 30 분 동안 커버립을 큐베이션합니다 (1 x PBS에서 2 % BSA, pH 7.2).
7. 인큐베이션 커버립은 마우스 모노클론 항hnRNPA1(희석 1:200) 또는 차단 용액에서 희석된 마우스 폴리클론 안티-TcFAZ(희석 1:100) 항체로 RT에서 30분 동안 커버립을 커버합니다.
8. 커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.
9. 염소 안티 마우스 IgG F (ab')2 (H +L)와 RT에서 30 분 동안 커버립을 배양 알렉사 플루어 488 (1:600)에 접목 한 Phalloidin과 함께 알렉사 594 (1:300)를 펜주하여 주조 용액의 소염 필라멘트 (F act-in)를 사용하여 주용 세포 차단에 있습니다.
10. 1x PBS(pH 7.2)로 3회 세척하여 각각 5분 동안 세척합니다.
11. DAPI 배지를 사용하여 소량의 ProLong Gold 안티페이드 장착 시약을 슬라이드 표면에 적용합니다.
12. 집게를 사용하여, 부드럽게 거품이 형성되지 않도록 장착 매체에 커버 슬립을 기울. 일단 건조하면, 원하는 경우 커버 슬립을 밀봉.

3. 동일한 호스트에서 자란 단일 클론 및 다각성 항체를 사용하여 면역 형광 프로토콜을 이중 라벨링

1. 위에서 설명한 2.1 ~ 2.6 단계를 반복합니다.
2. 인큐베이트는 RT에서 30분 동안 차단용액에서 희석된 사내 마우스 폴리클론 항TcFAZ 항체(1:100)를 함유한 감염 및 비감염 세포를 함유하고 있다.
3. 커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.
4. 인큐베이트는 RT에서 30분 동안 염소 안티마우스 IgG F(ab')2(H+L)를 블로킹 용액에서 희석한 알렉사 플루어 647(1:600)으로 접합한다.
5. 커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.
6. RT에서 30분 동안 차단 용액에서 아피니퓨어 토끼 안티마우스 IgG(H+L) 희석(0.12 mg/mL)으로 두 번째 차단 단계를 수행한다.
7. 커버립을 1x PBS(pH 7.2)로 각각 5분 동안 세 번 씻습니다. 그런 다음 마우스 모노클론 항hnRNP A1 IgG2b 항체(1:200)로 RT에서 30분 동안 배양한다.
8. 커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.
9. 알렉사 플루어 488 (1:600)에 컨쥬게이드 염소 안티 마우스 IgG2b 항체와 블로킹 용액에서 희석 된 알렉사 594 (1:300)로 접합 된 플라코로이드와 함께 30 분 동안 커버립을 배양합니다.
10. 커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.
11. 위에서 설명한 2.8 ~ 2.10 단계를 반복합니다.

4. 다른 숙주 종으로부터 제3 폴리클론 항체를 첨가한 삼중 라벨링 면역 형광 프로토콜

참고: 추가 라벨링의 경우 IgG 하위 클래스, 항체 동소형을 기록하고 항체 순서를 따릅니다: 1. 마우스 폴리클로날, 2. 토끼 폴리클로날, 3. 두 번째 블록 및 4. 마우스 모노클로날. 올바른 불소 공조 -공수 이차 항체를 선택하기 위해 공초점 현미경에서 사용할 수있는 레이저의 유형을 고려하십시오.

1. 위에서 설명한 2.1 ~ 2.6 단계를 반복합니다.
2. 3.2 ~ 3.5 단계 (세척 단계)를 마친 후 RT에서 30 분 동안 차단 용액에 토끼 폴리클론 항체로 새로운 인큐베이션을 시작합니다.
3. 커버립을 1x PBS(pH 7.2)로 각각 5분간 세 번 씻습니다.
4. 30분 동안 차단용액에서 알렉사 647(1:600)에 공주된 염소 안티래빗 항체 IgG로 커버립을 배양한다.
5. 커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.
6. RT에서 30분 동안 차단용액에서 아피니퓨어 토끼 안티마우스 IgG(H+L)를 블로킹(0.12 mg/mL)으로 차단단계를 수행한다.
7. 커버립을 1x PBS(pH 7.2)로 각각 5분간 세 번 세척하고 차단 용액에서 희석된 마우스 단일 클론 IgG 서브클래스 항체로 30분 동안 배양한다.
8. 커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.
9. 30분 동안 차단용액에서 알렉사 594(1:600)에 공주된 특정 염소 안티마우스 IgG 서브클래스 항체로 30분 동안 커버립을 배양한다.
10. 커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.

5. 공초점 이미징 인수

1. 공초점 현미경을 사용하여 면역 불피성 샘플을 분석하고 63X 오일 침지 목표를 달성하고 광증 관(PMT) 및 하이브리드 검출기(HyD)로 형광을 감지합니다.
   참고 : 우리는 공초점 현미경 검사의 다중 사용자 실험실에서 설정을 사용 - LMMC, 리베이라오프 프레토 의과 대학, 상파울루 대학.
2. 분리된 채널로 모든 공초점 이미지를 획득합니다. Adobe 포토샵을 사용하여 이미지 처리를 수행합니다.

결과

여기서, 우리는 항체의 근원이 trypanosomatids에 있는 특정 구조물 및 단백질을 인식하는 상업적인 항체의 가용성 때문에 제한될 때 면역 형광에 의하여 호스트 기생충 상호 작용을 공부하는 방법을 보여줍니다.

트리파노소마티드 중 T. cruzi는 척추동물과 무척추 동물 호스트 ¹⁹ 사이의 다양한 개발 단계를 포함하는 가장 복잡한 수명 주기 중 하나입니다. T. cruzi 수명 주기 동안, 포유류 감염의 초기 단계에서, 대사 시험포마티고스는 기생충과 척추 동물 숙주 세포^19,20에 존재하는 분자의 다양한 관련시키는 과정을 통해 세포를 침략합니다. 이러한 과정을 연구하기 위해, 우리의 실험실은 정기적으로 T. cruzi, T. 브루시, 리슈매니아 sp16,21...

토론

여기서, 우리는 동일한 숙주 종으로부터 2개의 상이한 항체를 사용하여 Trypanosoma cruzi 감염한 세포에 있는 이중 면역 라벨링을 능력을 발휘하는 프로토콜을 제시합니다. 연구하기 위하여는, 더 자세히, 감염의 연루, 핵 또는 세포소기관과 같은 호스트 세포에 있는 구조물이 프로토콜을 사용하여 표지될 수 있습니다. 또한, 배후 임베딩 씬 섹션 면역골드 라벨링 방법에 사용될 수 있다. 이 접근은 trypanosomatids 및 그밖 기생충을 공부하기 위하여 유효한 몇몇 항체가 있는 장애물을 극복하는 것을 돕습니다.

추가적으로, 우리의 프로토콜은 세포내 기생충이 호스트 세포와 함께 표지되는 것을 보여주었습니다, 동일한 면역 형광에 있는 2개의 진핵생물, 조직의 다른 종류에서 실현된 그 프로토콜과 다른 7,8,9,10,12,13,14 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Alexa Fluor 488 - IgG2b 항체	Life technologies, USA	A21141	염소 안티 마우스
AffiniPure Rabbit 안티 마우스 IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch, USA	315-005-003	안티 마우스 항체
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) 항체	Life technologies, 미국	A11017	염소 안티 마우스
Alexa Fluor 594 IgG1 항체	Life technologies, 미국	A21125	염소 안티 마우스
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) 항체	Life technologies, USA	A21237	염소 안티 마우스
Anti-hnRNPA1 항체 IgG2b	Sigma-Aldrich, 미국	R4528	마우스 항체
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) 항체	우리 연구실	사내	마우스 항체
소 혈청 알부민 (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A2153-10G	알부민 단백질
세제 Igepal CA-630	Sigma-Aldrich, 미국	I3021	비이온성 세제
소 태아 혈청(FBS)	Gibco, Thermo fisher scientific, 미국	12657-029	혈청
페니실린 스트렙토마이신	Gibco, Thermo fisher scientific, 미국	15140-122	항생제
팔로이딘 Alexa Fluor 594	Life technologies, 미국	A12381	Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPI	Life technologies, 미국	P36935	마운팅 배지 시약
RPMI 1640 1X with L-glutamine	Corning, USA	10-040-CV	세포 배양 배지
트립신-EDTA 용액	Sigma-Aldrich, USA	T4049-100ML	바이오시약