여기에서는 3D 바이오리액터를 이용하여 활액 중간엽 줄기세포로부터 다수의 GMP급 엑소좀을 생산하는 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
중간엽 줄기세포(MSC)에서 분비되는 엑소좀은 연골 손상 및 골관절염 치료의 유망한 후보로 제안되었습니다. 임상 적용을 위한 엑소좀은 대규모 생산이 필요합니다. 이를 위해 인간 활액 MSC(hSF-MSC)를 마이크로캐리어 비드에서 성장시킨 다음 동적 3차원(3D) 배양 시스템에서 배양했습니다. 이 프로토콜은 3D 동적 배양을 활용하여 SF-MSC 배양 상청액에서 대규모 엑소좀을 성공적으로 획득했습니다. 엑소좀을 초원심분리로 수확하고 투과전자현미경, 나노입자 투과분석법 및 웨스턴 블로팅으로 검증하였다. 또한 엑소 좀의 미생물 학적 안전성이 검출되었습니다. 엑소좀 검출 결과는 이 접근법이 우수제조관리기준(GMP) 등급 엑소좀을 많이 생산할 수 있음을 시사합니다. 이러한 엑소좀은 엑소좀 생물학 연구 및 임상 골관절염 치료에 활용될 수 있습니다.
서론
관절 연골과 기저 뼈 파괴로 인한 골관절염(OA)은 장애 1,2로 이어지는 심각한 문제로 남아 있습니다. 혈액과 신경 공급이 없으면 연골자가 치유 능력은 일단 손상되면 최소화됩니다 3,4. 지난 수십 년 동안 자가 연골세포 이식(ACI)에 기초한 치료법은OA 치료에서 약간의 진전을 이루었습니다5. 연골 세포 분리 및 확장을 위해서는 OA 관절의 비 중량 부위에서 작은 연골을 채취하여 연골에 손상을 입힐 필요가 있습니다. 또한, 절차는 확장 된 연골 세포(6)를 이식하기위한 두 번째 수술을 요구할 것이다. 따라서 연골 손상없이 OA 치료를위한 1 단계 요법이 광범위하게 연구되고 있습니다.
중간엽 줄기세포(MSC)는 OA 치료 7,8을 위한 유망한 대안으로 제안되었습니다. 여러 조직에서 유래 한 MSC는 특정 자극으로 연골 세포로 분화 할 수 있습니다....
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프로토콜
이 연구는 심천 제 2 인민 병원의 인간 윤리위원회의 승인을 받았습니다. hSF-MSCs in vitro 프로토콜에서 분리된 엑소좀의 개략도가 그림 1에 나와 있습니다.
1. 인간 SF-MSC 배양 및 식별
- 임상 OA 환자로부터 주사기와 바늘을 사용하여 SF 20mL를 수확합니다.
- OA 환자의 무릎 관절을 소독하십시오. 슬개골 외부의 대퇴사 두근 힘줄에서 7 # 바늘로 관절강으로 구멍을 뚫습니다.
- 관절액 10mL를 추출합니다. 수혈 스틱으로 천자 부위를 덮고 5 분 동안 누릅니다.
- 4°C에서 10분 동안 1,500 x g 에서 원심분리 후 SF 상청액을 폐기한다.
- 세포 펠릿을 10mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 재현탁하고, 4°C에서 10분 동안 1,500 x g 로 원심분리하고, PBS를 버립니다.
- 펠릿을 5 x 104 cells/mL의 세포 밀도로 인간 MSC 배양 배지 10mL로 재현탁한 다음( 재료 표 참조) 현탁액을 10....
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결과
유세포 분석은 국제 세포 치료 학회14,15에서 권장하는 인간 MSC를 정의하기위한 최소 기준에 따라 SF-MSC의 표면 마커를 확인하는 데 사용되었습니다. 유세포 분석 결과, 본 연구에서 배양된 SF-MSC는 MSC의 식별 기준을 충족했다. CD34, CD45 및 HLA-DR에 대해서는 음성이었고(3% 미만), CD73, CD90 및 CD105(95% 이상)에서는 양성이었습니다(그림 2).
도립 현미경 검사에서 SF-MSC가 마이크로 캐리어에서 증식하는 것으로 나타났습니다 (그림 3A). 세포를 2D 배양 용기 및 3D 배양 마이크로캐리어로부터 분해하고 세척한 후, 세포 수를 계수하였다. 2D 배양과 비교하여 3D 배양은 SF-MSC가 6일 이후 더 빠르게 증식하도록 .......
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토론
중간엽 줄기세포는 자가 재생, 특수 기능을 가진 조직세포로 분화, 파라크린 효과로 인해 재생 의학에서 널리 사용되고 있습니다16,17. 특히, 엑소좀이 발휘하는 파라크린 효과는 많은 관심을 끌었습니다18. 엑소좀은 MSC의 생체 정보를 전달하고 생물학적 기능을 수행하며 번거로운 보관 및 출하 등 MSC 단점을 극복합니다. 따라서 중간엽수석에서 유래한 엑소좀이 치료적 개입에 사용되어 OA 치료에서 가장 주목받고 있다.
현재, 중간엽 줄기세포를 전파하는 방법은 2D 배양과 3차원(3D) 배양(19)의 두 가지가 있다. 2D 배양은 저렴한 비용으로 시험관내 연구를 위해 MSC를 배양하는 통상적인 방법이다. 그러나 시간이 많이 걸리고 규모 잠재력이 제한적입니다. 또한 2D 미세 환경.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
중국 국립 자연 과학 재단 (제 81972116 호, 제 81972085 호, 제 81772394 호); 광동성 자연 과학 재단의 핵심 프로그램 (No.2018B0303110003); 광동 국제 협력 프로젝트 (No.2021A0505030011); 심천 과학 기술 프로젝트 (No. GJHZ20200731095606019, 아니오. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); 중국 박사후 과학 재단 (No.2020M682907); 광동 기초 및 응용 기초 연구 재단 (No.2021A1515010985); 심천에서 의학의 Sanming 프로젝트 (SZSM201612079); 광동성의 고급 병원 건설을위한 특별 기금.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BCA 분석 키트 | ThermoFisher | 23227 | 단백질 농도 분석 |
| 혈액 한천 플레이트 | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0903 | 박테리아 배양 |
| CD105 항체 | Elabscience | E-AB-F1243C | 유세포 분석 |
| CD34 항체 | Elabscience | E-AB-F1143C | 유세포 분석 |
| CD45 항체 | BD Bioscience | 555483 | 유세포 분석 |
| CD63 항체 | Abclonal | A5271 | 웨스턴 블로팅 |
| CD73 항체 | Elabscience | E-AB-F1242C | 유세포 분석 |
| CD81 항체 | ABclonal | A5270 | 웨스턴 블로팅 |
| CD9 항체 | Abclonal | A1703 | 웨스턴 블로팅 |
| CD90 항체 | Elabscience | E-AB-F1167C | 유세포 분석 |
| 원심분리기 | Eppendorf | Centrifuge, 5810R | |
| CO2 인큐베이터 | , Thermo | Cell 배양 | |
| 컨포칼 레이저 스캐닝 형광 현미경 | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | 엑소좀 라벨 |
| EZ-PCR 마이코플라스마 검출 키트 | BI | 20-700-20 | 마이코플라즈마 검출 |
| 유세포측정 | Beckman | MSC 식별 | |
| 유전자 펄서 II 시스템 | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | 유전자 형질주입 |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | 버전 8.0.2 | |
| HLA-DR 항체 | Elabscience | E-AB-F1111C | 유세포 분석 |
| Lowenstein-Jensen 배양 배지 | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis 배양 |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC 배양 |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | 나노 입자 추적 분석 |
| NTA 2.3 소프트웨어 | Malvern | 데이터 분석 | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | 형광 웨스턴 블로팅 | |
| OptiPrep 전기천공법 완충액 | Sigma | D3911 | 유전자 형질주입 |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Sigma | P8340 | 단백질분해효소 억제제 |
| RNase A | Qiagen | 158924 | RNA |
| Sabouraud 한천 플레이트 | 제거 Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | 곰팡이 배양 |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| 로터리 세포 배양 시스템(RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D 배양 |
| 초원심분리기 | Beckman | Optima XPN-100 | 엑소좀 원심분리기 |
참고문헌
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B.
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