여기에서 우리는 성숙한 인간 망막 오가노이드를 생성하고 이를 광수용체 독성 분석에 활용하여 연령 관련 망막 퇴행성 질환 황반 모세혈관확장증 2형(MacTel)에 대한 제약 후보를 식별하는 단계별 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
오가노이드는 세포 배양의 다양성과 처리량을 통해 인간 조직의 맥락에서 직접 질병 메커니즘 및 치료법을 연구할 수 있는 유망한 플랫폼을 제공합니다. 성숙한 인간 망막 오가노이드는 노화 관련 망막 퇴행성 질환 황반 모세혈관확장증 2형(MacTel)에 대한 잠재적인 약물 치료법을 스크리닝하는 데 사용됩니다.
우리는 최근에 MacTel이 비정형 지질 종인 deoxysphingolipids (deoxySLs)의 상승 된 수준으로 인해 발생할 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 지질은 망막에 독성이 있으며 MacTel 환자에서 발생하는 광수용체 손실을 유발할 수 있습니다. deoxySL 광수용체 독성을 예방하는 능력에 대해 약물을 스크리닝하기 위해 비-MacTel 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 계통에서 인간 망막 오가노이드를 생성하고 기능적으로 성숙한 광수용체를 포함하여 망막의 모든 신경 계통 유래 세포를 발달시키는 유사분열 후 연령으로 성숙시켰습니다. 망막 오가노이드를 deoxySL 대사산물로 처리하고 면역조직화학을 사용하여 광수용체층 내에서 세포자멸사를 측정했습니다. 이 독성 모델을 사용하여 deoxySL 유도 광수용체 사멸을 방지하는 약리학적 화합물을 스크리닝했습니다. 표적 후보 접근법을 사용하여 고콜레스테롤 및 중성지방 치료를 위해 일반적으로 처방되는 약물인 페노피브레이트가 망막 세포에서 deoxySL 독성을 예방할 수 있음을 확인했습니다.
독성 스크리닝은 광수용체 사멸을 예방할 수 있는 FDA 승인 약물을 성공적으로 식별했습니다. 이것은 테스트된 질병 관련성이 높은 모델로 인해 직접 실행 가능한 결과입니다. 이 플랫폼은 망막 질환의 향후 치료 발견을 위해 여러 대사 스트레스 요인과 잠재적인 약리학적 개입을 테스트하도록 쉽게 수정할 수 있습니다.
서론
세포 배양 및 동물 모델에서 인간 질병을 모델링하는 것은 약리학적 치료제의 발견, 변형 및 검증을 위한 귀중한 도구를 제공하여 후보 약물에서 승인된 치료법으로 발전할 수 있도록 합니다. in vitro 및 non-human in vivo 모델의 조합은 오랫동안 약물 개발 파이프라인의 중요한 구성 요소였지만 신약 후보의 임상 성능을 예측하지 못하는 경우가 많습니다1. 단순한 인간 세포 단일 배양과 임상 시험 사이의 격차를 해소하는 기술 개발이 분명히 필요합니다. 자가 조직화된 3차원 조직 배양인 오가노이드의 최근 기술 발전으로 모델링한 조직에 대한 충실도가 향상되어 전임상 약물 개발 파이프라인에서 유망한 도구가 되었습니다2.
비인간 생체 모델에 비해 인간 세포 배양의 주요 이점은 인간 대사의 특정 복잡성을 복제할 수 있다는 것인데, 이는 인간과 생쥐와 같은 고차원 척추동물 사이에서도 상당히 다를 수 있다3. 그러나 이러한 특이성은 조직 복잡성의 손실로 인해 가려질 수 있습니다. 망막 조직의 경우 여러 세포 유형이 복잡하게 얽혀 있고 단일 배양에서 복제할 수 없는 세포 아형 간에 독특한 공생 대사 상호작용이 있습니다
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프로토콜
1. iPSC/ESC의 해동, 패시징 및 확장
참고: 모든 세포 배양 단계에서 모범 사례를 사용하여 멸균 세포 배양을 유지하십시오.
- 6웰 세포 배양 플레이트를 기저막 매트릭스 배지로 코팅합니다.
- 이 배지의 1x를 준비하려면 제품 사양을 따르거나 75μL 저온 매트릭스 배지를 9mL의 DMEM/F12로 희석하십시오. 6웰 플레이트에 웰당 1.5mL의 새로 준비한 1x 배지를 추가합니다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 기저막 매트릭스 배지를 흡인하고 각 웰을 3mL의 DMEM/F12로 헹굽니다. DMEM/F12 2mL를 넣고 사용할 때까지 37°C에서 배양합니다. 접시가 준비된 날에 사용하십시오.
- PBS 중의 10 mM 락 억제제 (Y-27632 dihydrochloride) 원액을 준비하고, 사용 전까지 -20 °C에서 보관한다.
- iPSC/ESC 바이알을 DMEM/F12 배지에 해동하고 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 펠릿을 mTeSR 배지에 재현탁합니다. 플레이트 1 바이알을 10 μM의 암석 억제제 (Y-27632 디히드로클로라이드)와 함께 mTeSR 배지 중의 코팅된 6-웰 웰 ....
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결과
망막 오가노이드는 비-MacTel 대조군 iPSC 라인으로부터 생성되었다. 오가노이드가 배양 26주에 도달한 후 선별되어 실험군으로 나뉩니다. 오가노이드는 다양한 농도의 deoxySA로 처리하여 deoxySA가 광수용체에 독성이 있는지 확인했습니다. 0에서 1 μM까지 4가지 농도의 deoxySA를 테스트하고(그림 2) 오가노이드를 8일 동안 처리했으며 격일로 배지를 교체했습니다. deoxySA에 대한 반응으로 세포 사멸은 농도에 따라 달라지며 50nM deoxySA에서만 검출할 수 있습니다(그림 2D). 테스트된 최고 농도인 1μM deoxySA는 망막 오가노이드의 무결성을 유지하면서 강력한 효과를 제공했습니다(그림 2B,D). 5μM deoxySA의 더 높은 농도는 며칠 내에 오가노이드의 붕괴를 일으켰습니다(데이터는 표시되지 않음). d.......
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토론
차별화 프로토콜 변형
요시키 사사이(Yoshiki Sasai)의 그룹20에 의한 자가 형성 광학 컵의 발명 이후, 많은 실험실들은 거의 모든 단계 5,18,19,21에서 변할 수 있는 망막 오가노이드를 생성하기 위한 프로토콜을 개발했다. 프로토콜의 전체 목록은 Capowski et al.22에서 찾을 수 있습니다. 여기에서 제공하는 분화 프로토콜은 성숙한 망막 오가노이드를 감화하려는 모든 실험실에 좋은 출발점을 제공하는 간단하고 개입이 적은 프로토콜입니다. 사용자는 이 프로토콜의 변형을 탐색하고 채택하는 것이 좋습니다. 프로토콜 변형을 위한 일반적인 단계는 EB의 생산 및 조기 분화.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
Lowy Medical Research Institute에서 지원합니다. MacTel 프로젝트를 지원해 주신 Lowy 가족에게 감사드립니다. 원고 준비에 도움을 주신 Mari Gantner, Mike Dorrell, Lea Scheppke에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL 삼각 플라스크 | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 보충제, 비타민 A 뺀 | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 미니 블레이드 | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | 써모-피셔 | D1306 | |
| Dispase II, | 분말 Gibco | 17105041 | |
| DMEM, 고포도당, 피루브산 | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| 당나귀 안티-토끼 Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| 당나귀 혈청 | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, 열 비활성화 | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| 현장 세포 사멸 감지 키트, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, 성장 인자 감소 | Corning | 356230 | |
| MEM 비필수 아미노산 용액 | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 보충제 | Gibco | 17502048 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% 포름알데히드 | 써모-피셔 | 28906 | |
| 토끼 안티 리커버린 항체 | Millipore | AB5585 | |
| 구연산나트륨 | 시그마 | W302600 | |
| Steriflip 멸균 일회용 진공 필터 장치 | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| 타우린 | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. 화합물 | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 초저 어태치먼트 6웰 플레이트 | Corning | 29443-030 | |
| 초저 어태치먼트 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| 진공 여과 시스템 | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
참고문헌
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J.
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