방법 논문

쿼드러플-체커보드: 약물 조합을 연구하기 위한 3차원 체커보드 수정

DOI:

10.3791/62311

⸱

2021년 7월 24일

 ,  , 
1Faculty of Medicine and Medical Sciences, University of Balamand, 2Department of Clinical Microbiology, Michigan Health Clinics, 3College of Medicine, Central Michigan University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 하나의 실험에서 4개의 약 사이에서 얻을 수 있는 모든 가능한 조합을 공부하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 결과를 평가하기 위해 표준 96-웰 플레이트 마이크로 희석 분석 및 분수 억제 농도(FIC)의 계산을 기반으로 한다.

초록

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약물 조합 요법의 개념은 주로 약물에 대한 저항의 급격한 증가와 함께 매우 중요해지고 있습니다. Q-checkerboard라고도 하는 Quadruple 체커보드는 다른 프로토콜과 동일한 결과를 달성하는 데 필요한 시간과 작업을 최소화하기 위해 한 실험에서 4개의 약물 간에 얻을 수 있는 가능한 조합수를 극대화하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 약물이 희석되고 여러 96 웰 플레이트에서 함께 결합되는 간단한 마이크로 희석 기술을 기반으로합니다.

96웰 플레이트의 첫 번째 세트에서 뮬러-힌튼 국물은 첫 번째 필수 약물(예: Cefotaxime)이 잇따라 첨가되어 이를 연속적으로 희석시합니다. 첫 번째 단계가 완료된 후, 또 다른 96웰 플레이트 세트는 제2약물(예를 들어, 아미카시)을 희석하여 약물 2의 특정 부피를 제거하고 약물을 포함하는 96웰 플레이트의 첫 번째 세트에서 해당 우물에 넣는데 사용된다. 제3단계는 제3약물(예를 들어, 레보플로색사신)의 필요한 농도를 약물 1과 2의 조합을 포함하는 초기 세트의 적절한 플레이트에 첨가함으로써 수행된다. 네 번째 단계는 제 4 약물의 필요한 농도(예를 들어, 트리메토림-설페마페스옥사졸)를 첫 번째 세트에서 적절한 플레이트에 첨가함으로써 수행됩니다. 이어서, 대장균 ESBL 세균성 접종이 준비되고 추가될 것이다.

이 방법은 가능한 모든 조합을 평가하는 것이 중요하며 생체 내 테스트를 위해 더 넓은 범위의 테스트를 테스트할 수 있습니다. 많은 초점을 필요로하는 피곤한 기술임에도 불구하고, 결과는 하나의 실험에서 많은 조합을 테스트 할 수있는 놀라운 시간 절약이다.

서론

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항생제1,2의남용 과용 및 오용으로 인한 저항의 증가와 함께 세균 감염을 치료하기 위한 신약 및 제제를 개발할 필요성이 결정적입니다. 신약 개발과 같은 새로운 접근법은 저항 위기를 극복하기 위해 매우 중요합니다. 그러나 제약 산업은 새로운 항균제 개발에 관심이 없습니다. 더욱이, 신약이 개발되면 박테리아는 이러한신약3,4에대한 저항을 계속 진화하고 개발할 것이다. 따라서, 저항의 문제는 해결되지 않을 것입니다, 다른 접근에 대한 필요성을 고려하고 세균성 저항을 극복하기 위해 연구해야한다.

약물 조합은 주로 다약물 내성 병원균5,6에의해 유발되는 세균 성 감염을 치료하기위한 매우 중요한 개념이다. 그것은 치료의 과정을 감소, 주어진 복용량을 감소; 따라서, 주어진 약물의 독성을 감소시키고, 저항성의 발병속도를 낮추는 데 도움이 되며, 어떤 면에서, 담보 민감도5,

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프로토콜

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1. 준비 단계

  1. 증류수 1L에 MH 국물 25g을 첨가하여 뮬러-힌튼 국물(MHB)을 준비합니다. 2.5 h에 대한 121 °C에서 오토 클레이브. 그런 다음, 실온이나 냉장고에 오토클레이브 미디어를 저장합니다.
  2. 문제의 박테리아를 서브배양(대장균 ESBL) 4 사분면 줄무늬 방법을 사용하여 천 매체에 37 °C에서 하룻밤 배양.
    1. 멸균 루프를 사용하여, 하나의 식민지를 가지고 가까운 병렬 줄무늬를 수행하여 맥콩키 한천 판의 전반부에 확산.
    2. 루프를 사용하여 첫 번째 사분면에서 줄무늬로 두 번째 사분면에 박테리아를 확산시면 됩니다.
    3. 두 번째 사분면에서 가까운 병렬 줄무늬를 사용하여 세 번째 사분면의 줄무늬를 확장합니다.
    4. 세 번째 사분면에서 그것을 줄무늬로 네 번째 사분면의 중심에 박테리아를 확산.

2. 패널 준비

  1. 사각형을 형성하기 위해 서로 옆에 96 웰 플레이트 4개를 놓습니다. 테이프를 사용하여 바닥을 함께 테이프로 테이프로 붙입니다.
  2. 이 단계를 반복하여 각각 4개의 플레이트를 포함하는 4개의 패널을 구하고 A1, A2, A3 및 A4의 이름을 지정합니....

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결과

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도 2A는 세포로메와 아키카신을 레보플로삭신과 트리메호프-설파움톡사졸의 특정 농도를 결합하여 얻은 결과를 나타낸다. 우리는 그림의 오른쪽 부분에 있는 약의 농도와 함께 schematically 제시되는 4개의 판의 왼쪽 부분에서 볼 수 있습니다. 화살표는 성장/성장 없음 인터페이스의 우물을 나타냅니다. 색깔의 우물은 성장을 포함하는 우물입니다. 우리는 네 번째 플레이트가 조합을 포함하는 사분면의 성장을 포함하지 않는 것을 알 수 있습니다. 이 접시에 우리는 성장을 억제 할 레보 플로록사신의 MIC가 있기 때문이다. 이 그림에서, 우리는 Cefotaxime의 MIC가 32 μg /mL와 동일한 우물 A8에서 얻어지는 것을 볼 수 있습니다. Amikacin의 MIC는 16 μg/mL과 동일한 웰 E1에서 수득됩니다. 억제 효과는 트리메호프림-설파움톡사졸의 1/8 MIC 이외에 세포로메와 레보플로록사신의 여러 서브MIC 이외에 아키카신(row D)의 1/2 MIC를 함유하는 행에서.......

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토론

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쿼드러플 체커보드 방법은 체커보드와 프로토콜의 3차원 체커보드와 유사합니다. 그러나 실험 중 오류를 방지하기 위해 특정 중요한 단계를 고려해야 합니다.

테스트된 각 약물의 MIC에 대해 테스트해야 하는 프로토콜을 시작하기 전에 플레이트에서 연속적으로 희석되어야 하는 약물 1 및 약물 2에 대한 희석을 시작하는 데 필요한 농도가 무엇인지 알아야 합니다. 약물 3 및 약물 4에 관해서는, MIC는 또한 시험하는 데 필요한 농도를 계산하는 것으로 알려져야한다 (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC, 및 MIC). MIC를 결정하는 많은 방법이 있지만, Q-checkerboard 프로토콜도 직렬 희석을 위한 미세 희석 분석법을 사용하기 때문에 가장 좋은 방법은 마이크로 희석 기술로 이를 결정하는 것입니다.

첫 번째 단계에서는 플레이트를 녹화하는 동안 벤치가 깨끗하고 오염을 방지하기 위해 멸균 커버로 플레이트를 덮습니다. 이 프로.......

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1000 &마이크로; L 팁Citotest4330000402
200 µ L tipsCitotest4330-0013-17
50 mL 원심분리기 튜브corning430828약물 3 및 4 제제용
5 mL 폴리스테렌 둥근 바닥 튜브Falcon3520580.5 MacFarland 박테리아 접종 제제
용 90mm 페트리 접시JRZ Plastilab다채널 피펫
corning3596연속 diltuion 및 결합 약물
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazoleBy CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France10177403Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime)PHARCO Pharmaceuticals24750/2006Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strainSaint-George에서 의료 균주로 회수 병원 레바논박테리아 균주
맥 콘키 + 크리스탈 바이올렛 한천BIO-RAD64169508외대 배양에 사용되는 한천 플레이트 제조용
HIKMA Pharmaceuticals2BXMIA56N-AEFDrug 2
Muller-Hinton BrothBIO-RAD69444박테리아 배지 제조용
멀티 채널 피펫Thermo ScientificGJ54761배지, 박테리아 및 약물의 연속 희석 및 첨가용
종이 테이프
단일 채널 피펫Thermo ScientificOH19855 HH40868배지, 박테리아 및 약물 첨가용
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)sanofi aventis221937/2009Drug 3
96-well 플레이트를 사용하여 용액을 추가할 베드용 침대 미아신 500 mg / 2 mL (Amikacin)

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ibezim, E. Microbial resistance to antibiotics. African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).
  2. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. <....

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Quadruple CheckerboardDrug Combination TherapyMulti Drug ResistanceMicrodilution Technique96 Well PlatesAntimicrobial CombinationsSerial DilutionBacterial InoculumMuller Hinton BrothMIC Determination

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