Somitogenesis를 지배하는 신호 진동의 기능적 조사를위한 미세 유체 학적 접근법

요약

미세유동 칩 상에서 마우스 배아 조직의 배양 및 조작을 위한 프로토콜이 제공된다. 경로 조절제의 펄스를 적용함으로써, 이 시스템은 마우스 소미토제네시스의 기능적 조사를 위해 신호전달 진동을 외부적으로 제어하는데 사용될 수 있다.

초록

발달하는 마우스 배아의 전소성 중배엽의 주기적 분할은 신호전달 경로의 네트워크에 의해 조절된다. 신호 진동과 기울기는 각각 세그먼트 형성의 타이밍과 간격을 제어하는 것으로 생각됩니다. 관련된 신호 전달 경로가 지난 수십 년 동안 광범위하게 연구되었지만, somitogenesis를 제어하는 신호 진동의 기능에 대한 직접적인 증거는 부족했습니다. 신호 역학의 기능적 조사를 가능하게하기 위해, 미세 유체학은 이러한 역학의 미묘한 변조를위한 이전에 확립 된 도구입니다. 이 미세유체 기반 연행 접근법을 통해 내인성 신호 진동은 경로 조절기의 펄스에 의해 동기화됩니다. 이것은 예를 들어, 진동 기간 또는 두 진동 경로 사이의 위상 관계의 변조를 가능하게 한다. 또한, 경로 조절제의 공간 구배는 조직을 따라 확립되어 신호 구배의 특정 변화가 소미토제네시스에 어떻게 영향을 미치는지 연구할 수 있다.

본 프로토콜은 미세유체학의 최초 사용자를 위한 미세유체 접근법을 확립하는 것을 돕기 위한 것이다. 미세 유체 시스템을 설정하는 데 필요한 기본 원리와 장비가 설명되고 칩 설계가 제공되어 3D 프린터를 사용하여 칩 생성을위한 금형을 편리하게 준비 할 수 있습니다. 마지막으로, 미세유체 칩 상에서 일차 마우스 조직을 배양하는 방법 및 경로 조절제의 외부 펄스에 대한 신호전달 진동을 수반하는 방법이 논의된다.

이러한 미세유체 시스템은 또한 다른 맥락에서 신호전달 역학 및 모르포겐 구배의 기능적 조사를 위해 위스트룰로이드 및 오가노이드와 같은 다른 생체 내 및 시험관내 모델 시스템을 보유하도록 적응될 수 있다.

서론

발달은 신호전달 경로를 통한 세포간 통신에 의해 제어된다. 조직과 공간의 적절한 세포 분화를 조율하는 신호 전달 경로의 수는 제한되어 있습니다. 이러한 다수의 프로세스를 조절하기 위해, 정보는 신호전달 경로의 역학, 신호^1,2의 주파수 또는 지속기간과 같은 시간에 따른 경로의 변화로 인코딩될 수 있다.

소미토제네시스 동안, 소미틱 조직은 프레소미틱 중배엽(PSM)³으로부터 주기적으로 분절된다. PSM은 Wnt, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 레티노산 신호전달의 구배에 의해 공간적으로 조직된다. Wnt 및 FGF 신호가 낮은 결정 전방의 전방 PSM에서, 세포는 소미트로 분화하기 위해 프라이밍된다. 분화는 전사 활성화의 파동이 이러한 결정 전선에 도달할 때 발생한다. PSM 내에서, Wnt, FGF, 및 노치 신호전달이 발진한다. 이웃 세포는 위상에서 약간 벗어나 진동하며, 이로 인해 Wnt, FGF 및 Notch 경로의 하류에서 후방으로 이동하는 진동 전사 활성화의 파동이 발생합니다. 마우스 배아에서, 전사파는 대략 매 2 시간마다 결정 전면에 도달하고 소마이트 형성을 개시한다. 신호전달 경로를 교란시키거나 활성화시킴으로써 소미토제네시스를 연구하는 것은 이러한 경로의 중요성을 예시할 수 있다^4,5,6,7,8,9. 그러나, 세포 거동의 조절에서 신호전달 역학의 기능을 조사할 수 있으려면, 신호전달 경로를 영구적으로 활성화하거나 억제하는 대신 미묘하게 조절하는 것이 필수적이다.

분절된 마우스 배아 내의 신호전달 경로 활성을 시간적으로 조절하기 위해, Sonnen et al.은 미세유체 시스템¹⁰을 개발하였다. 이 시스템은 생물학적 샘플¹¹을 포함하는 칩의 마이크로채널 내에서 유체 유동의 엄격한 제어를 허용한다. PSM의 적절한 세분화를 위한 신호전달 역학의 중요성을 연구하기 위해, 이러한 미세유체학 셋업은 마우스 세그멘테이션 클럭 ex vivo의 신호전달 역학을 조절하는데 이용된다. 경로 활성화제 또는 억제제를 배양 챔버 내로 순차적으로 펄싱함으로써, Wnt, FGF 및 Notch 신호전달의 역학의 외부 조절이 달성된다¹⁰. 예를 들어, 개별 경로의 기간과 다수의 진동 신호전달 경로 사이의 위상 관계를 수정할 수 있다. 동적 신호 전달 리포터의 수반되는 실시간 이미징을 사용하여 경로 자체에 대한 연행의 효과, 분화 및 소마이트 형성에 미치는 영향을 분석 할 수 있습니다. 신호전달 역학에 대한 이러한 수준의 제어를 사용하여, 소미토제네시스 동안 Wnt-와 Notch-신호전달 경로 사이의 위상 관계의 중요성을 강조하였다¹⁰.

개인화된 칩 설계는 로컬 환경 내의 시공간 교란에 대한 많은 옵션, 예를 들어, 안정적인 기울기 형성12,13,14,15, 맥박 활성화/억제10,16,17,18 또는 국부적 교 란^19,20 . Microfluidics는 또한 실험 처리의 자동화로 인해 더 재현 가능한 판독 및 더 높은 처리량을 가능하게 할 수 있습니다^.21,22,23. 본 프로토콜은 미세유체학 및 조직 내의 내인성 신호전달 진동의 동반을 모든 표준 생명과학 실험실에 도입하기 위한 것이다. 클린 룸 및 소프트 리소그래피 장비와 같은 칩 생성을위한 정교한 장비가없는 경우에도 미세 유체 칩을 제조하고 생물학적 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 금형은 자유롭게 사용할 수 있는 CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 설계할 수 있습니다. 일반적으로 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 구성된 미세유체 칩 생성용 금형은 3D 프린터로 인쇄하거나 인쇄 회사에서 주문할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 미세유체 칩은 고가의 장비의 요구 없이 하루 이내에 생산될 수 있다²⁴. 여기서, 칩 설계가 제공되며, 이와 함께 2차원(2D) 생체외 배양물²⁵에서 마우스 세그멘테이션 클럭의 연입을 위한 몰드가 3D 프린터로 인쇄될 수 있다.

미세 유체 공학에 의해 활성화 된 온칩 배양과 정확한 교란은 신호 전달 경로가 다세포 행동을 제어하는 방법의 분자 메커니즘을 푸는 데 탁월한 잠재력을 가지고 있습니다. 신호 역학 및 형태소 구배는 개발중인 많은 프로세스에 필요합니다. 이전에, 실험실은 세포, 조직 및 전체 유기체를 미세유체 칩에서 배양하였고, 주로 2D 세포 배양의 시공간 교란을 위한 프로토콜이 다른 곳에 제공되었다12,26,27,28,29. 다세포 시스템에서 로컬 환경을 변조하기 위해 미세유체학을 적용하면 높은 처리량과 정밀한 시공간 교란에 대한 새로운 관점이 열립니다. 미세 유체 공학 분야는 이제 발달 생물 학자들에게 비 전문적이고 저렴하며 쉽게 적용 할 수있는 도구가되었다는 점에 도달했습니다.

여기서, Notch 신호전달 억제제의 펄스에 대한 마우스 세그멘테이션 클럭의 연입에 대한 프로토콜이 제공된다. 이러한 실험은 (1) 미세유체 칩의 생성, (2) 튜브의 제조 및 칩의 코팅, 및 (3) 미세유체 실험 자체(도 1A)로 구성된다. 척추동물 모델 시스템과 관련된 연구는 책임있는 위원회의 사전 윤리적 승인이 필요합니다.

프로토콜

여기에 제시된 연구는 EMBL 윤리위원회¹⁰ 및 네덜란드 동물 연구위원회 (dierenexperimentencommissie, DEC)의 승인을 받았으며 동물 보호를위한 Hubrecht 지침을 따릅니다.

액체 PDMS로 작업하는 동안 장갑을 착용하십시오. 표면과 장비를 덮으십시오. 일단 굳어지면 청소가 어려워지기 때문에 유출물을 즉시 제거하십시오.

1. 칩의 생성

참고: 미세유체 칩은 주형에 PDMS(폴리디메틸실록산)를 주조하여 생성됩니다. 금형은 CAD 소프트웨어(예: uFlow 또는 3DμF30)를 사용하여 설계할 수 있습니다. 무료 디자인의 저장소는 MIT (Metafluidics.org)에 의해 제공됩니다. 몰드는 3D 프린터로 인쇄되거나 원하는 디자인을 포함하는 포토마스크를 사용하는 소프트 리소그래피에 의해 생성될 수 있다(자세한 내용은 예를 들어, Qin et al., ²⁰¹⁰³¹ 참조). 여기서, 마우스 배아 조직의 온칩 배양을 위한 3D 프린터로 인쇄할 수 있는 주형에 대한 설계가 제공된다(도 1B,C, 보충 파일 1 및 2). 저해상도 3D 프린터로 인쇄 할 수 있도록 이전에 게시 된 ^one10에 비해 디자인이 수정되었습니다. 기포 트랩이없는 금형과 기포 트랩이있는 금형이 제공됩니다 (각각 보충 파일 1과 2). 인쇄 절차는 사용 가능한 프린터에 따라 다르므로 인쇄에 대한 세부 정보는 설명되지 않습니다. 그러나 중합되지 않은 모든 수지가 완전히 제거되었는지 확인해야합니다. 미세유체 챔버 내의 작은 <200 μm 구멍으로부터 중합되지 않은 수지를 제거하기 위해 용매로 추가 세척을 수행하는 것이 종종 요구된다. 이들 구멍은 실험 동안 칩 내에 배아 조직을 포획하기 위해 PDMS 기둥을 형성할 것이다. PDMS는 저렴하고 생체 적합성이 뛰어나며 투명하며 자동 형광이 낮기 때문에 미세 유체 공학에 일반적으로 사용됩니다. 경화 후, PDMS 칩은 몰드에서 절단되고 유리 슬라이드 상에 접합된다. 유리와 PDMS 칩 둘 다의 플라즈마 처리는 표면을 활성화시키고 접촉할 때 공유 결합의 형성을 허용한다.

1. 중합을 유도하기 위해 단량체와 촉매를 9:1 비(w:w)로 혼합하여 필요한 양의 PDMS를 준비한다. 일회용 도구를 사용하여 플라스틱 컵과 포크와 같은 혼합하십시오. 혼합이 제대로 이루어 졌는지 확인하십시오.
2. PDMS 혼합물을 데시케이터에 넣고 약 30분 동안 진공을 적용하여 PDMS 혼합물로부터 공기를 제거한다. 데시케이터 내부의 진공으로 인해 공기는 PDMS 혼합물에서 제거됩니다.
   참고: PDMS가 흐를 경우 건조기 내부를 조직으로 덮으십시오.
3. PDMS 혼합물을 칩 몰드에 붓습니다 (약 3-5mm의 PDMS 층으로 충분합니다).
4. PDMS로 채워진 몰드를 다시 데시케이터에 넣고 진공을 적용하여 남아있는 기포를 제거하십시오. 금형의 모든 작은 구조물에서 공기가 제거되었는지 확인하십시오.
5. 금형을 65°C(또는 몰드 재료에 따라 그 이하) 오븐에 밤새 위치시켜 경화시킨다. 메스를 사용하여 칩을 금형에서 잘라냅니다. 나중에 접착 할 수 있도록 설계 주위에 충분한 공간 (1-2cm)으로 경화 된 PDMS를 금형에서 잘라냅니다. PDMS를 완전히 잘라 칩을 꺼낼 때 칩이 깨지지 않도록하십시오. PDMS 칩을 조심스럽게 떼어내고, 먼저 메스의 무딘 끝으로, 가능하면 손으로 들어올립니다.
6. 펀치 입구 및 출구 구멍은, 1 mm 생검 펀치를 사용하여 미세유체 챔버의 내부로부터 시작한다.
7. PDMS 칩을 압축 공기로 간단히 청소하고 양쪽에 접착 테이프를 붙여 PDMS와 먼지의 막힌 부분을 제거하고 나중에 사용할 때까지 깨끗하게 유지하십시오.
   참고 : 칩은 추가 사용 시까지 이와 같이 보관할 수 있습니다.
8. 유리 슬라이드를 압축 공기로 청소하십시오. 깨지지 않도록주의하십시오. PDMS 칩에서 접착 테이프를 제거합니다.
9. 플라즈마 오븐을 사용하여 칩을 유리 슬라이드에 결합하십시오. 다음 지침은 공기 플라즈마에 최적화되어 있습니다.
   참고: 실험실의 플라즈마 오븐 설명서를 참조하고 특정 실험에 대한 절차를 최적화하십시오.
   1. 칩과 유리 슬라이드를 플라즈마 오븐에 넣고 측면을 위로 향하게하십시오.
   2. 뚜껑을 플라스마 오븐에 올려 놓고 진공을 가하면서 제자리에 고정시키고 진공이 확립 될 때까지 기다리십시오.
   3. 가스 버튼을 눌러 가스를 켜고 약 1 분 동안 기다리십시오 (압력은 약 0.37mbar에 있어야합니다).
   4. 발전기를 눌러 플라즈마를 생성합니다 (전력 : 9.0, 시간 : 1 분).
   5. 완료되면 펌프와 가스를 끄십시오. 환기시키고 문을 엽니 다.
   6. 활성화 된 표면을 서로 배치하고 압력을 고르게 가하여 칩을 유리에 결합하십시오. 유리가 깨지지 않도록주의하십시오.
      참고 : 플라즈마 처리가 효과가 있는지 확인하기 위해 수질 검사를 수행 할 수 있습니다. 유리 표면에 물 한 방울을 놓습니다. 플라즈마 처리가 효과가 있다면 물방울을 형성하는 대신 물이 즉시 퍼져야합니다.
10. 접합된 칩을 5분 동안 65°C의 오븐에 놓는다.
11. 칩의 노출된 면을 접착 테이프로 밀봉하여 먼지가 입구로 유입되지 않도록 합니다.
    참고: 칩은 사용할 때까지 보관할 수 있습니다. 개구부는 그때까지 테이프로 닫아야합니다.

2. 미세유체학 실험 준비

참고 : 미세 유체 실험을 수행하기 위해 다음과 같은 준비 단계가 필요합니다 : 첫째, 미세 유체 실험을 수행 할 때 입구에서 출구로 유체 흐름이 생성됩니다. 칩의 모든 구멍은 입구에서 압력이 축적되어 콘센트로 작동합니다. 따라서 사용되지 않는 모든 구멍은 닫아야합니다. 예를 들어, 칩에 조직을로드하는 데 사용되는 구멍. 이들이 닫히지 않으면 조직이 유체와 함께 흘러 나올 수 있습니다. 이러한 구멍을 닫으려면 PDMS로 채워진 튜브가 사용됩니다. PDMS 충진 튜브는 무기한으로 보관할 수 있으므로 각 미세 유체 실험을 위해 별도로 준비 할 필요는 없지만 더 큰 배치로 만들 수 있습니다. 둘째, 미세유체 실험의 개시 전에, 실험에 필요한 튜빙, PDMS-충전된 튜빙, 및 칩이 제조되고 UV-멸균된다. 마지막으로, 칩은 피브로넥틴으로 코팅되어야 배아 조직이 유리²⁵에 부착될 수 있다.

1. PDMS로 채워진 튜브 만들기.
   1. ±1m의 튜빙을 이용하십시오. 더 많은 튜빙은 여러 개의 튜빙을 취하여 PDMS로 채울 수 있습니다.
   2. 중합을 유도하기 위해 단량체와 촉매를 9:1 비(w:w)로 혼합하여 필요한 양의 PDMS를 준비한다.
      참고: 플라스틱 컵과 포크와 같은 일회용 도구를 사용하여 혼합하십시오. 제대로 섞으십시오.
   3. PDMS 혼합물을 데시케이터에 넣고 약 30분 동안 진공을 적용하여 PDMS 혼합물로부터 공기를 제거한다.
      참고: PDMS가 흐를 경우 건조기 내부를 조직으로 덮으십시오.
   4. 3 mL 주사기를 PDMS로 채운다. 혼합물에 기포가 형성되지 않도록 조심스럽게 채 웁니다.
   5. 포셉을 사용하여 22G 바늘의 끝을 튜브에 삽입하십시오.
      참고: 튜브나 손가락을 바늘로 뚫지 않도록 주의하십시오.
   6. 튜브를 바늘을 통해 PDMS 충진 주사기에 부착하십시오. 주사기 펌프를 사용하여 약 500μL/h의 유량으로 튜브를 채웁니다. 펌프가 파손되는 것을 방지하기 위해 너무 높은 압력을 가하지 않도록 주의하십시오.
   7. 튜브가 PDMS로 완전히 채워지면 15cm 접시에 넣고 실온에서 경화시킵니다 (적어도 하룻밤).
2. 실험을 위해 튜브 및 칩을 준비합니다.
   참고: 다음 튜빙이 실험에 필요합니다: 첫째, 출구 당 약 50cm의 튜빙과 두 번째, 입구 당 약 2-3m(정확한 크기는 나중에 사용되는 펌프, 인큐베이터 또는 현미경의 공간 조직에 따라 다름). 배양 배지가 실험 중 배아 배양을 위해 _CO2 와 평형을 이룰 수 있도록 입구 튜브가 길어야 합니다.
   1. 뾰족한 끝이 만들어지도록 튜브를 45 ° 각도로 자릅니다. 이렇게하면 튜브를 칩의 구멍에 쉽게 삽입 할 수 있습니다. 각 입구 튜브에 하나의 바늘을 부착하십시오. 2.1.5단계를 참조하십시오.
   2. PDMS로 채워진 튜브를 ±1cm 플러그로 자릅니다. 뾰족한 끝이 생성되도록 45 ° 각도로 자릅니다. 이렇게하면 튜브를 칩의 구멍에 쉽게 삽입 할 수 있습니다. 튜브에 부착되지 않은 각 구멍을 채우기 위해 충분한 플러그가 필요합니다.
   3. 칩에서 접착 테이프를 분리합니다.
   4. 바늘, 칩 및 플러그가 부착 된 모든 튜브를 접시에 넣고 ±15 분 동안 자외선에 노출시켜 살균하십시오. UV 멸균 가능성이 있는 임의의 세포 배양 후드가 사용될 수 있다.
3. 피브로넥틴으로 칩의 코팅.
   참고: 후부 PSM의 2D 생체외 배양의 배양을 위해, 피브로넥틴으로 칩을 코팅하십시오.
   1. 칩을 실온에서 PBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 비이커에 넣는다. 칩이 PBS로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 칩을 PBS로 플러시하여 P200 피펫으로 공기를 제거합니다.
      참고 : 칩의 모든 추가 처리는 칩으로 공기가 유입되는 것을 방지하기 위해 실험이 시작될 때까지이 비커에서 수행됩니다. 칩의 유리 슬라이드가 깨지지 않도록주의하십시오.
   2. PBS에 1:20 피브로넥틴 2 mL를 준비하고 비이커에 채운다.
   3. 칩의 각 챔버에 대해 3 mL 주사기를 로드합니다. 포셉으로 22G 바늘을 출구 튜브에 삽입하십시오. 피브로넥틴을 함유하는 주사기에 바늘을 부착한다.
   4. 주사기를 주사기 펌프에 연결합니다. 튜브에 공기가 남지 않을 때까지 튜브를 플러시합니다.
   5. 칩의 출구에 콘센트 튜브를 부착하십시오. 튜브를 바닥까지 끝까지 밀어 넣으십시오. 칩을 코팅하기 위해 낮은 유량을 설정하십시오. 다른 모든 개구부는 열린 상태로 유지할 수 있습니다. 주사기 펌프를 적어도 2 시간 동안 작동하게하고, 또한 하룻밤 동안 실행할 수 있습니다.
   6. 펌프를 중지하십시오. 바늘 바로 뒤에 튜브를 잘라냅니다. 나머지 튜빙은 나중에 실험 중에 출구 역할을 할 것입니다.

3. 미세유체학 실험

참고: 여기서, Notch 신호전달 억제제 DAPT의 펄스를 적용함으로써 2D 생체외 배양물에서 마우스 세그멘테이션 클럭의 동반을 위한 프로토콜이 제시된다. 마우스 분할 클럭(137min25)의 자연 주기에 가까운 130분의 주기로 펄스를 적용하면 효율적인 유입이 가능합니다. 배지 100분과 2μM DAPT 30분의 펄스가 적용됩니다(그림 2A). 칩 내 약물의 존재는 형광 염료를 사용하여 모니터링됩니다. 이 염료와 형광 신호전달 리포터의 여기 및 방출 스펙트럼은 형광 실시간 이미징 동안 블리드스루를 방지하기에 충분히 달라야 한다. 황색 형광 단백질이 노치 신호전달 리포터 ^LuVeLu5(Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe)와 같은 신호전달 리포터로 사용될 경우, 염료인 캐스케이드 블루가 적용될 수 있다. 형광 염료와 리포터의 다른 가능한 조합을 확인하기 위해, 자유롭게 이용가능한 스펙트럼 뷰어가 사용될 수 있다. 동반의 효과는 동적 신호 리포터^5,10,32의 실시간 이미징에 의해 검출될 수 있다. 각 칩에는 두 개의 인큐베이션 챔버가 있습니다. 이를 통해 약물 펄스 (DAPT)를 직접 비교하여 펄스 (DMSO)를 제어 할 수 있습니다.

1. 중간 및 탈가스를 만드십시오.
   1. 실험 당일에, 50 mL의 배지를 준비하였다(마우스 꼬리새싹 배양에 대한 추가 정보를 위해 0.5 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1% BSA로 보충된 DMEM-F12 참조²⁵).
   2. 실험을 위해 배지로 채워진 주사기를 준비합니다. 비커에서 배양 배지 준비: 노치 신호전달 진동을 연행시키기 위해, 1.2 μL의 DMSO + 10 μM 캐스케이드 블루로 배지 6 mL를 준비; 2 μM DAPT + 10 μM 캐스케이드 블루를 갖는 배지 6 mL; 각각 6 mL의 배지를 가진 두 개의 튜브. 주사기 당 최소 6 mL의 배지를 사용하십시오. 주사기를 매체로 로드합니다. 약물과 DMSO가 들어있는 주사기에 라벨을 부착하십시오.
   3. 칩을 PBS 및 주사기 내 배지를 함유하는 주사기를 데시케이터에서 탈기화시킨다. 주사기를 비커에 넣고 팁이 위를 향하게하여 공기가 상단에서 빠져 나올 수 있도록하십시오. 칩이 떠 다니고 여전히 거품으로 가득 차있을 수 있습니다. 이들은 나중에 제거 될 것입니다.
   4. P200 피펫을 사용하여 칩에서 대부분의 기포를 내뿜거나 빨아 들이십시오. 일부 공기가 남아 있으면 다음 실험 중에 제거됩니다.
   5. 펌프에 주사기를 설치하고 주사기에 입구 튜브를 부착하십시오. 노치 신호를 훈련시키려면 두 개의 주사기 펌프를 사용하는데, 하나는 중간 주사기를 운반하고 다른 하나는 약물/DMSO 주사기를 운반합니다. 튜브에서 기포를 제거하기 위해 실험이 시작될 때까지 더 높은 유속 (0.5 mL / h)으로 실행하십시오. 펌프에서 주사기 세부 사항(직경)을 올바르게 설정하도록 주의하십시오.
2. 칩에 조직 로딩.
   1. 마우스 배아 조직을 해부하십시오. 꼬리 (꼬리 새싹)의 가장 뒤쪽 끝을 해부하십시오. 해부된 조직을 배지 + 25 μM HEPES에 넣는다.
   2. P200을 사용하여 칩을 배지 + 25 μM HEPES로 플러싱하여 PBS를 제거하였다.
   3. P200 피펫을 사용하여 칩에 조직을 로드합니다(그림 1C). 칩에 기포가 유입되지 않도록 하십시오.
      참고: 효율적인 로딩을 위해서는 몇 가지 연습이 필요합니다. 조직이 제대로 지향되지 않으면 조심스럽게 빨아 들여 다시 씻어 낼 수 있습니다. 그러나 이것은 종종 빠른 세포 사멸을 초래합니다.
   4. 각 조직 로딩 단계 후에, PDMS 충전된 튜빙의 조각을 사용하여 상응하는 조직 로딩 입구를 닫는다. 플러그가 무딘 핀셋을 사용하여 칩 바닥으로 충분히 밀어 넣었는지 확인하십시오.
   5. 모든 샘플이 로드된 후 무딘 포셉을 사용하여 PDMS로 채워진 튜브 조각으로 사용하지 않는 입구/출구를 닫으십시오.
3. 미세 유체 설정의 조립.
   1. 미세 유체 펌프의 유량을 낮춥니다. 60-100 μL / h는 마우스 배아 꼬리 새싹에 잘 작동합니다. 더 높은 유속에서, 세포 사멸이 관찰되었다 – 아마도 너무 높은 세포 전단 때문이었을 것이다. 여러 펌프의 누적 유량은 주어진 시간에 미세 유체 챔버 당 60-100 μL / h를 초과해서는 안됩니다.
   2. 튜브를 미세 유체 칩에 부착하십시오. 칩 내부에 기포가 생기지 않고이 작업을 수행하십시오 (이것은 튜브 끝에 매체 방울이 존재하도록함으로써 달성 될 수 있습니다). 유출구는 피브로넥틴 코팅으로부터 여전히 존재한다(2.3 참조).
   3. 모든 튜빙이 칩에 부착되면 비이커에서 꺼내어 제대로 건조시킨 다음 접시에 넣고 인큐베이터 (37 °C, 20 _{% O2}, 5 _{% CO2})에서 약 1.5m의 입구 튜브와 함께 넣어 밤새 배양하십시오. 배관은 가스 투과성이다; 이것은 매체에서 _O2 와 _CO2 의 평형을 허용 할 것입니다. 대안적으로, 동시 형광 실시간 이미징을 위해, 칩 및 대략 1.5 m 입구 튜빙이 현미경 내로 직접 배치된다. 표준 96웰 플레이트 홀더에 맞는 칩용 홀더는 보충 파일 3에 제공됩니다.
      참고: 인큐베이션 중에 습도가 충분히 높은지 확인하십시오. 필요한 경우, 미세유체 셋업에서 증발을 방지하기 위해 이미징 챔버 또는 인큐베이터에 촉촉한 조직을 첨가한다. 현미경 인큐베이터의 습도가 너무 낮 으면 튜브 및 미세 유체 칩에 기포가 형성됩니다. 그런 다음 칩과 튜브가 배치되는 닫힌 이미징 박스를 사용할 수 있습니다. 이러한 이미징 박스를 만드는 가장 간단한 방법은 칩 위에 큰 뚜껑을 놓고 젖은 티슈를 추가하는 것이므로 완전히 닫을 필요가 없습니다. 펌프와 칩의 높이 차이가 너무 크지 않은지 확인하고 필요한 경우 중력으로 인한 기포 형성을 방지하기 위해 높이를 천천히 변경하십시오.
   4. 셋업을 최종 위치에 배치한 후 모든 펌프가 20분 동안 20μL/h의 유속으로 흐르도록 합니다. 챔버와 펌프가 높이가 움직일 가능성이 높기 때문에 튜브의 올바른 압력을 다시 설정하는 데 필요합니다.
   5. 약물 펌프를 끄고 실험/실시간 이미징이 시작될 때까지 중간 펌프만 60μL/h에서 작동시키십시오.
4. 실험 시작.
   1. 실험을 위해 계획된 펌핑 프로그램을 시작하십시오. 노치 신호를 연행하려면 실험이 끝날 때까지 일반적으로 24시간 동안 반복되는 100분 매체 및 30분 약물 펄스의 펌핑 프로그램을 사용합니다.
      참고: 프로그래밍 가능한 모든 미세유체 펌프를 사용할 수 있습니다. 가장 간단한 형식에서 펌프를 프로그래밍하고 수동으로 시작할 수 있습니다. 대안적으로, 펌프는 컴퓨터 소프트웨어에 의해 제어될 수 있다.
   2. 실시간 이미징이 수행되는 경우, 적어도 30분의 기간 후에 이미징을 시작한다. 이렇게하면 칩의 온도가 인큐베이터 내부의 온도에 맞게 조정되고 이미징 중에 너무 강한 드리프트를 방지 할 수 있습니다. 자동 초점은 여전히 유용합니다.
   3. 반전 현미경을 사용하여 칩의 유리 슬라이드를 통해 표준 공초점 이미징을 수행하십시오. 10분의 이미징 간격을 사용하여 130분의 기간으로 신호 진동을 충분히 감지합니다.
   4. 더 짧은 기간의 경우 충분한 샘플링을 위해 간격을 짧게 하십시오. 캐스케이드 블루의 검출을 위한 저해상도 이미징 트랙을 포함시켜 칩에 약물의 존재를 시각화합니다.
   5. 금성 리포터의 여기를 위해서는 파장 960nm에서 515nm 레이저 또는 2-광자 레이저를 사용하십시오.
   6. 20x 계획 목표(해상도 512 x 512 픽셀, 1.38 μm/픽셀)를 통해 거리가 8μm인 6-8개의 평면으로 구성된 z 스택을 획득합니다. 전동 스테이지를 사용하여 하나의 실험 내에서 여러 샘플을 이미지화할 수 있습니다.
   7. 405nm 레이저로 캐스케이드 블루를 흥분시키고 10분마다 단일 z 평면을 획득합니다(해상도 32 x 32픽셀, 22.14μm/픽셀).
      참고: 이미징 및 이미지 분석에 대한 자세한 내용은 대표 결과에 제공되며 참조¹⁰에서 찾을 수 있습니다.

결과

이 프로토콜로, 미세유체학을 이용한 마우스 세그멘테이션 클럭의 신호전달 진동의 외부 연입에 대한 방법이 제시된다. Notch 신호전달 억제제의 펄스를 적용함으로써, 독립적인 배아 배양물에서의 신호전달 진동은 서로 동기화된다¹⁰. 세그멘테이션 클럭의 기능을 연구하기 위해 이 시스템을 적용하기 위한 전제 조건은 시그널링 다이내믹과 세그멘테이션이 여전히 온칩에 존재한다는 것이다. 이전에 Wnt 및 Notch 신호 전달 역학은 일정한 배지 흐름에도 불구하고 유지되고 물리적 경계 형성은 전방 ^PSM10을 나타내는 말초 2D 배양물에서 지속된다는 것을 이전에 보여주었습니다.

외부 약물 펄스에 대한 신호전달 진동의 수반을 확인하기 위해, 미세유체 실험 동안 황색 형광 단백질 금성을 발현하는 Notch 신호전달 리포터 LuVeLu5의 실시간 이미징이 수행된다. 칩 상의 2D 배양물의 배향은 제어하기 어렵기 때문에, 전방 조직에서의 신호전달 진동이 분석된다. 2D 배양물의 주변은 재현 가능하게 검출될 수 있다. 온칩 조직 절편의 방향은 마음대로 제어 할 수 없으며 칩의 전체 내부 표면은 피브로넥틴으로 코팅됩니다. 따라서 문화가 칩의 측면이나 천장에 부착되는 경우가 종종 있습니다. 샘플이 시야각(x, y 및 z 방향)에서 벗어나거나 꼬리의 후부 끝이 아래쪽을 향하도록 부착하는 경우 일반적으로 이러한 샘플은 제외됩니다.

추가 분석을 위해, 이러한 연입 실험의 배수가 결합된다. 독립적인 실험은 대략 400 nm에서 염료, 캐스케이드 블루에 의해 시각화된 약물 펄스의 타이밍을 사용하여 서로 정렬될 수 있다. 동기화를 분석하고 시각화하기 위해 정량화된 진동을 추세를 낮춘 다음(그림 2B,D) 평균 및 표준 편차로 표시하거나 진동의 위상을 계산할 수 있습니다. 이를 통해 독립적 인 후부 배아 배양의 진동과 외부 약물 펄스 간의 위상 관계를 분석 할 수 있습니다 (그림 2C, E). 파이썬 기반 프로그램 ^pyBOAT33은 이러한 신호 진동의 주기, 위상 및 진폭을 결정하는 간단하고 사용자 친화적 인 도구입니다. 동반을 확인하기 위해, 예를 들어, 내인성 신호 진동의 기간을 결정할 수 있습니다. 130분의 주기로 펄스를 인가할 때, 노치 신호 진동은 또한 130분의 기간을 나타낸다(그림 2F)¹⁰. 또한, 캐스케이드 블루 펄스를 사용하여, 상이한 시그널링 리포터를 갖는 독립적인 실험이 서로 정렬될 수 있다. 이러한 방식으로 다수의 시그널링 리포터들의 진동들 사이의 위상 관계가 간접적으로 결정될 수 있다¹⁰.

따라서, 제시된 미세유체 시스템은 발달하는 마우스 배아의 생체외 배양물에서 신호전달 진동의 조절을 허용한다. 세그먼트 형성 및 분화를 위한 마커의 이미징과 함께, 이 시스템은 이제 세분화 시계의 신호전달 경로가 어떻게 상호작용하는지, 그리고 이들이 소마이트 형성을 어떻게 조절하는지를 해부하는데 적용될 수 있다.

그림 1: 미세유체 프로토콜의 개략적인 개요. (A) 칩 금형은 CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 설계할 수 있습니다. 마우스 소미토제네시스의 생체외 모델에서 신호전달 진동을 훈련시키기 위한 칩 설계가 제공된다. 예를 들어, 금형은 3D 인쇄로 생성되거나 주문할 수 있습니다. 미세유체 칩은 PDMS의 성형에 의해 생산된다. 경화된 PDMS 칩은 절단되고 플라즈마 오븐을 사용하여 유리 슬라이드에 공유 결합된다. 칩 내의 유리 표면은 해부 된 조직이 부착 될 수 있도록 피브로넥틴으로 코팅되어 있습니다. 배아 조직은 로딩 입구를 통해 칩 상에 로딩되고, 이는 이후에 폐쇄된다. 다른 매체 조건을 가진 펌프가 칩의 입구에 부착되고 흐름 프로그램이 초기화됩니다. 조직은 실험 동안 공초점 현미경을 사용하여 이미징 할 수 있습니다. (Sonnen et al., 201810에서 채택 된 Kymographs. Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0에 따라 Cell에서 재인쇄 및 수정되었습니다.) (b) 후부 마우스 배아 조직의 온칩 배양을 위한 주형 설계의 개략도도. 미세유체 채널의 높이는 500 μm이며, 배아 후부 마우스 꼬리의 배양에 충분하다. 이 몰드를 인쇄하는 파일은 보충 파일 1에 제공되며 대안은 보충 파일 2에 제공됩니다. (c) PDMS 기둥 온칩으로 둘러싸인 E10.5 단면화된 마우스 꼬리의 브라이트필드 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 미세유체학 실험의 대표적인 결과. (A) 배지 및 약물 펌프를 이용한 동반 실험의 개략적인 표현. 신호전달 경로 조절제의 펄스는 마우스 배아의 생체외 배양에 적용되고, 신호전달 진동은 동적 신호전달 리포터(예를 들어, 노치 신호전달 리포터 LuVeLu5 및 Wnt 신호전달 리포터 Axin2T2A10)의 실시간 이미징에 의해 시각화될 수 있다. 파선은 시간 경과에 따른 분석에 사용되는 영역을 나타냅니다. (B-F) LuVeLu 리포터 진동은 노치 신호전달 억제제 DAPT의 주기적 펄스에 의해 수반된다. (B,D) DAPT 또는 DMSO 대조군을 사용하여 인연행시 전방 PSM에서의 노치 신호 진동의 정량화. (C,E) 노치 신호 진동의 위상과 외부 DAPT/DMSO 펄스의 타이밍 사이의 위상-위상 관계 플롯. 동반의 경우, 안정된 위상 관계가 확립된다. (f) DMSO 및 DAPT 펄스로 연행된 샘플을 비교하는 리포터 진동의 평균 기간 및 SEM의 정량화. (Sonnenet al., 201810에서 채택 된 그림. Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.)에 따라 Cell에서 재인쇄 및 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

문제	제안된 솔루션
PDMS는 유리에 결합하지 않는다.	- PDMS와 유리가 모두 깨끗한지 확인하십시오.
	- 챔버 주위에 본딩을 위해 충분한 PDMS가 있는지 확인하십시오.
	- 플라즈마 오븐의 설정을 최적화합니다.
내 칩에 기포가 있습니다.	- 펌프가 켜져 있는지 확인합니다.
	- 칩에 조직을 로딩하기 전에 칩을 탈기합니다.
	- 실험 시작 전에 배지를 탈기한다.
	- 인큐베이션 챔버의 습도가 충분히 높은지 확인하십시오.
조직은 실험 초기에 죽습니다.	- 칩을 적재하고 조립 할 때 매체에 HEPES를 추가하십시오.
	- 로딩하는 동안 조직을 너무 자주 안팎으로 플러시하지 마십시오.
	- 유속이 너무 높지 않은지 확인하십시오.
조직은 이미징 중에 사망합니다.	- 영상에서 광독성이 없는지 확인
	- 오염이 없는지 확인하십시오.
	- 유속이 너무 높아서는 안됩니다.
이미징 중에 초점이 변경됩니다.	- 이미징 중에 자동 초점을 사용하여 이미징 슬라이드의 드리프트를 조정합니다.
	- 칩이 적어도 30 분 동안 현미경 내의 온도와 평형화되도록하십시오.
콘센트/입구 분리.	- 모든 튜브를 완전히 아래로 밀어 내립니다.
칩의 유리가 깨집니다.	- 더 조심하십시오, 유리는 매우 연약합니다.
	- 얇은 유리는 이미징에만 필요합니다. 이미징이 수행되지 않으면 일반적으로 더 두꺼운 유리 슬라이드를 사용할 수 있습니다.
	- 브레이크가 칩 외부에 있으면 문제가되지 않을 수 있습니다. 칩의 유리 씰이 파손되면 액체가 새어 나와 공기가 들어옵니다.
내 칩에 오염이 있습니다.	- 배양 배지에 항생제를 첨가하십시오.
	- 모든 장비와 튜브를 살균하십시오.
	- 빠르고 깨끗하게 작업하십시오.

표 1: 문제 해결

보충 파일 1: 3D 프린터로 금형을 인쇄하기위한 STL 파일. 이 주형은 후부 배아 조직의 온칩 배양을 위한 미세유동 칩을 생성하는데 사용된다( 도 1에 도시된 설계). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: STL 파일은 후부 배아 조직의 온칩 배양을 위한 미세유동 칩을 생성하기 위해 3D 프린터로 주형을 인쇄한다. 보충 파일 1 및 그림 1에 표시된 설계와는 달리, 이 설계에는 소량의 공기가 주 미세 유체 챔버로 유입되는 것을 방지하기 위해 입구에 버블 트랩이 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3 : 칩을 현미경에 넣을 홀더를 생성하기위한 설계 파일. 이 홀더는 96웰 플레이트의 치수를 가지며 대부분의 현미경의 표준 홀더에 맞아야 합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

신호 역학이 다세포 시스템을 어떻게 제어하는지는 이 분야에서 오랫동안 제기되어 왔습니다. 기능적 조사는 중요한 도전 과제인데, 왜냐하면 이러한 역학은 이것을 허용하기 위해 미묘하게 변조되어야하기 때문입니다^.11. 경로 교란에 대한 이러한 시간적 제어는 원칙적으로 광유전학으로 달성될 수 있으며, 이는 또한 높은 공간 조절을 가능하게 한다³⁴. 그러나 광유전학은 문제의 각 신호 전달 경로를 분석하기위한 정교한 유전 도구의 확립을 필요로합니다. 여기에 설명된 현재 프로토콜은 모든 신호전달 경로의 교란을 위한 매우 다재다능한 도구를 제공한다. 미세 유체 학적 실험을 통해 일시적으로 제어 된 약물 펄스를 적용하여 조직 배양에서 신호 전달 경로의 역학을 기능적으로 조사 할 수 있습니다. 여기서, 초점은 생체외 배양물에서의 소미토제네시스의 연구에 있지만, 프로토콜은 임의의 다른 모델 시스템에 적합하도록 적응될 수 있다.

프로토콜의 특정 단계는 성공적인 미세유체학 실험을 수행하는 데 매우 중요합니다(표 1에 요약됨). 요점은 다음과 같이 논의됩니다. 실험 과정 동안 배지 흐름으로 인해 조직 배양은 전단 스트레스를 경험합니다. 모델 시스템이 연속 흐름에 노출되면 세포 스트레스가 발생할 수 있으며 극단적 인 경우 전단 효과로 인한 세포 사멸이 발생할 수 있습니다. 마우스 테일 버드의 생체 외 조직 배양 및 현재 칩 설계의 경우, 60 μL / h (최대 100 μL / h)의 유량이 최소한의 전단 효과로 잘 작동하는 것으로 나타났습니다. 동일한 칩에 대해 여러 펌프가 동시에 켜지면 개별 펌프의 유량을 적절하게 조정하여 총 유량이 증가하지 않도록 해야 합니다. 현재 프로토콜이 다른 모델 시스템 및 칩 설계에 맞게 조정되면 유량이 최적화되어야 합니다. 대안적으로, 매질을 연속적으로 플러시하지 않고, ^chip35 상의 매질을 주기적으로 변경할 수 있다. 이러한 설정은 또한 마우스 소미토제네시스(미공개, 데이터 미도시)에서 신호전달 진동을 제어하는데 적용될 수 있다. 또한, 조직 배양이 직접적인 유체 흐름에 노출되지 않고 약물이 이웃 채널에서 확산되어 조직에 도달하는 설정도 구상 될 수 있습니다. 이러한 시스템은 ESC 분화의 시험관내 모델에 성장 인자의 구배를 적용하는데 성공적으로 사용되었다^14,36.

미세 유체 실험의 한 가지 주요 쟁점은 실험 중에 기포가 온칩으로 발생한다는 것입니다. 칩 또는 튜브 내의 기포는 칩 상의 균일한 액체 흐름을 방해할 수 있고 그 위치에서 배아 배양물의 제거로 이어질 수 있다. 기포의 존재를 방지하기 위해, 프로토콜의 다양한 단계는 필수적이다. 먼저, 주사기 내의 배양 배지 및 미세유동 칩 자체는 데시케이터를 사용하여 탈기되어야 한다(단계 3.1.3). 둘째, 샘플을 로딩 입구에 로딩 할 때, 샘플과 함께 칩에 공기를 파이프하지 않도록주의해야합니다 (3.2.3 단계). 셋째, 튜브를 매체로 채울 때 칩을 부착하기 전에 모든 기포를 펌핑해야합니다 (3.3.2 단계). 그렇지 않으면, 이러한 기포는 실험 중에 메인 칩으로 밀려날 것이다. 마지막으로, 실험 동안, 배지는 반투과성 튜빙으로 인해 이미징 챔버 또는 인큐베이터 내에서 평형화된다. 튜빙의 투과성은 또한 매체의 증발을 허용하므로 튜브에 새로운 기포가 형성되는 것을 방지하기 위해 실험 중에 습도가 조절되도록하십시오.

일반적으로 미세 유체 공학은 연구자의 특정 질문에 적용 할 수있는 매우 다양한 도구입니다. 현재의 설계 접근 방식은 칩 당 최대 12 개의 생체 외 배양물을 병렬로 이미징 할 수 있습니다. 이 숫자는 주로 실험 당 배아의 수와 충분한 해상도로 각 배아 배양을 이미지화하는 데 걸리는 시간에 의해 제한됩니다. 단일 실험에서 여러 조건을 비교해야 하는 경우 단일 유리 슬라이드에 여러 칩을 장착할 수 있습니다. 칩 설계가 제공되어 여러 조직 외식편을 병렬로 이미징하는 데 이상적이지만 개인화 된 설계는 높은 처리량 분석을 허용하고 단일 실험 내에서 더 많은 조건의 조합을 증가시키기 위해 샘플 수의 한계를 극복 할 수 있습니다^16,17. 마이크로유체학은 칩 상에서 배양될 수 있는 모델로 제한되며, 온칩 배양은 각 모델 시스템에 대해 개별적으로 최적화되어야 할 것이다^27,37,38.

지난 5-10 년 동안 미세 유체 공학은 높은 처리량 접근법과 신호 역학 및 구배의 미묘한 변조에 대한 잠재력으로 인해 다양한 생물학적 질문을 해결하기 위해 적용되었습니다. 요즘 미세 유체 공학은 실험실에서 쉽게 설정할 수있는 쉽게 적용 할 수 있고 저렴하며 다재다능한 도구가되었습니다. 여기서, 현재의 프로토콜은 특정 응용, 즉 소미토제네시스를 지배하는 신호전달 역학을 연구하는 데 최적화되어 있다. 조직 생물학의 개별 연구 질문에 맞게 이 프로토콜과 디자인을 적용하는 것은 간단합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10 mL 주사기	Becton, Dickinson and company	300912
184 실리콘 엘라스토머 경화제	SYLGARD	1673921
184 실리콘 엘라스토머 PDMS	SYLGARD	1673921
3 ml 주사기	Becton, Dickinson and company	309657
접착 테이프			스카치 매직 테이프 또는 이와 유사한
무딘 끝 집게 Bochem 18/10 스테인레스 스틸	Fisher Scientific	10663341
소 혈청 알부민 동결 건조 pH ~ 7	Biowest	P6154
압축 공기 시스템
결정화 접시	VWR	10754-7	멸균
D-(+) - 포도당 45 %	Sigma	G8769
건조기	VWR	467-0104
일회용 컵	Duni	173 941
일회용 포크	스테이플	511514
해부 장비
DMEM / F12	세포 배양 기술	맞춤형	DMEM / F-12, 페놀 레드 없음, L- 글루타민 없음, 포도
피브로넥틴	시그마	F1141-5MG
플로우 후드 Baker 511514의 BioVanguard Greenline	CleanAir		UV 광원
용 유리 슬라이드 번호 1.5H 고정밀, 70x70 mm	Marienfeld	107999098
HEPES 버퍼	Gibco	15630-056
L-글루타민	Gibco	25030024
현미경	Leica	Leica SP8 MP
바늘 22G	Becton, dickinson 및 회사	z412139-100EA
오븐	VWR	390-09
PBS0
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15070063
플라즈마 오븐 펨토	다이너 전자
펀치 &오슬래시; 1mm	유니-코어	WB100073
스케일	싸토리우스	엔트리스
주사기 펌프	WPI	AL-4000
튜빙 &오슬래시; 1mm	APT	AWG24T
진공 펌프	VWR	181-0308