방법 논문

호스트-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 고처리량 전사 분석

DOI:

10.3791/62324

⸱

2022년 3월 5일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pathology of Infectious Diseases, Department of Pathology, Medical School, University of São Paulo, 2Scientific Platform Pasteur USP, 3Department of Clinical and Toxicological Analyses, School of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, 4Hospital Israelita Albert Einstein

이 논문에서

요약

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여기에 제시된 프로토콜은 고급 통계 분석 접근법에 품질 관리 및 전처리 단계를 포함하여 원시 읽기에서 기능 분석에 RNA-시퀀싱 전사 데이터를 분석하는 완전한 파이프라인을 설명합니다.

초록

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병원균은 다양한 전염병을 일으킬 수 있습니다. 감염에 응하여 숙주에 의해 유도된 생물학적 과정은 질병의 중증도를 결정한다. 이러한 프로세스를 연구하기 위하여는, 연구원은 감염, 임상 결과, 또는 질병 엄격의 다른 단계에서 호스트 전사의 동적 변경을 측정하는 고처리량 시퀀싱 기술 (RNA-seq)를 사용할 수 있습니다. 이 조사는 질병의 더 나은 이해로 이어질 수 있습니다., 잠재적인 약물 목표 와 치료를 발견 뿐만 아니라. 여기에 제시된 프로토콜은 원시 읽기에서 기능 분석에 RNA 시퀀싱 데이터를 분석하는 완벽한 파이프라인을 설명합니다. 파이프라인은 데이터의 (1) 품질 관리라는 다섯 단계로 나뉩니다. (2) 유전자의 매핑 및 인장; (3) 분화 유전자 및 공동 발현 유전자를 식별하는 통계 분석; (4) 시료의 섭란의 분자 정도의 결정; 및 (5) 기능 분석. 1단계는 다운스트림 분석의 품질에 영향을 줄 수 있는 기술 아티팩트를 제거합니다. 2단계에서 유전자는 표준 라이브러리 프로토콜에 따라 매핑되고 추가됩니다. 3단계의 통계 분석은 감염된 샘플에서 분화되거나 공동 발현되는 유전자를 비감염된 샘플과 비교하여 식별합니다. 시료 가변성 및 잠재적인 생물학적 이상치의 존재는 4단계에서 의 분자 정도의 교란 접근법을 사용하여 검증된다. 마지막으로, 5단계에서의 기능적 분석은 질병 표현형과 관련된 경로를 나타낸다. 제시된 파이프라인은 숙주 병원체 상호 작용 연구에서 RNA-seq 데이터 분석을 통해 연구원을 지원하고 감염의 분자 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 시험관 또는 생체 내 실험에서 미래를 추진하는 것을 목표로 합니다.

서론

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뎅기열, 황열병, 치쿤구냐 및 지카와 같은 Arboviruses는 여러 발병과 널리 연관되어 있으며 지난 수십 년 동안 인간을 감염시키는 주요 병원체 중 하나로 부상했습니다1,2. 치쿤구냐 바이러스(CHIKV)에 감염된 개인은 종종 발열, 두통, 발진, 폴리아르트랄기아 및 관절염3,4,5명이 있다. 바이러스는 세포의 유전자 발현을 전복시키고 각종 숙주 신호 경로에 영향을 미칠 수 있습니다. 최근에는 혈액 전사체 연구를 활용하여 급성 CHIKV 감염과 관련된 분화 유전자(DEGs)를 확인하기 위해 RNA-seq를 활용하여 회복6 또는 건강한 대조군7과 비교하여. CHIKV 감염된 아이들은 바이러스성 RNA를 위한 세포 센서와 관련되었던 것과 같은 선천적인 면역에 관여하는 up-regulated 유전자를 가지고 있었습니다, JAK/STAT 신호, 및 수신과 같은 수용체 신호 통로6. CHIKV에 급성....

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프로토콜

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이 프로토콜에 사용된 견본은 상파울루 대학에 생물 의학 과학의 생물학과 및 세르지페의 연방 대학의 미생물학의 학과에서 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다 (의정서: 54937216.5.5.5467 및 54835916.5546, 각각).

1. Docker 데스크톱 설치

참고: Docker 환경을 준비하는 단계는 운영 체제(OS)와 다릅니다. 따라서 Mac 사용자는 1.1로 나열된 단계를 수행해야 하며 Linux 사용자는 1.2로 나열된 단계를 수행해야 하며 Windows 사용자는 1.3으로 나열된 단계를 수행해야 합니다.

  1. MacOS에 설치합니다.
    1. Docker 웹 사이트(자료 표)에 액세스하고 Mac용 Docker 데스크톱을 클릭한 다음 Docker Hub 링크에서 다운로드 를 클릭합니다.
    2. 도커 받기 버튼을 클릭하여 설치 파일을 다운로드합니다.
    3. Docker.dmg 파일을 실행하여 설치 프로그램을 열고 아이콘을 응용 프로그램 폴더로 드래그합니다.

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결과

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전사 분석을 위한 컴퓨팅 환경이 Docker 플랫폼에서 만들어지고 구성되었습니다. 이 방법을 사용하면 초보자 Linux 사용자가 사전 관리 지식없이 Linux 터미널 시스템을 사용할 수 있습니다. Docker 플랫폼은 호스트 OS의 리소스를 사용하여 특정 사용자의 도구가 포함된 서비스 컨테이너(그림 1B)를 만듭니다. Linux OS 우분투 20.04 배포판을 기반으로 하는 컨테이너가 만들어졌으며, 명령줄 단자선을 통해 액세스할 수 있는 전사 분석을 위해 완전히 구성되었습니다. 이 컨테이너에는 모든 파이프라인 분석에 필요한 데이터 집합 및 스크립트에 미리 정의된 폴더 구조가 있습니다(그림 1C). 우리의 연구 그룹7 에 의해 간행된 연구 결과는 분석을 위해 이용되고, 건강한 개별에게서 20의 견본 및 CHIKV 심각하게 감염된 개별에게서 39의 견본을 구성했습니다 .......

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토론

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시퀀싱 라이브러리를 준비하는 것은 생물학적 질문에 가능한 최선의 방법으로 답변하는 중요한 단계입니다. 연구의 관심성적증명서 유형은 어떤 유형의 시퀀싱 라이브러리를 선택하고 생물정보 분석을 유도할 것인지를 안내합니다. 예를 들어, 병원체 및 숙주 상호작용의 시퀀싱으로부터, 시퀀싱의 유형에 따라, 호스트 전사체 모두에서 또는 바로 서열을 식별할 수 있다.

차세대 시퀀싱 장비(예: 일루미나 플랫폼)는 염기분석 품질 점수를 측정하여 베이스가 잘못 호출될 확률을 나타냅니다. 다운스트림 분석은 저품질 서열에 매우 민감하며 읽지 않거나 잘못 읽은 유전자 발현으로 이어집니다. 올바른 분석 및 해석을 수행하는 또 다른 장애물은 어댑터 시퀀스입니다. 어댑터 시퀀스는 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 도움이 되며 대부분의 경우 어댑터도 시퀀싱됩니다. 최근 연구에 따르면 매핑 도구가 최종 결과에 미치는 영향은 최소화된 것으로 확인되었습니다13. 그러나 병원체 숙주.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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HN은 FAPESP(교부금 번호: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5, 2013/08216-2) 및 CNPq(313662/2017-7)에 의해 지원됩니다.

ANAG (FAPESP 프로세스 2019/13880-5), VEM (FAPESP 프로세스 2019/16418-0), IMSC (FAPESP 프로세스 2020/05284-0), APV (FAPESP 프로세스 2019/2019/27146) RLTO (CNPq 프로세스 134204/2019-0).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CEMiToolComputational Systems Biology Laboratory1.12.2완전 자동 방식으로 공동 발현 유전자 모듈을 발견하고 분석하는 동시에 고품질 그래프가 포함된 사용자 친화적인 HTML 보고서를 제공합니다.
EdgeRBioconductor (유지보수: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])3.30.3생물학적 복제를 이용한 RNA 염기서열 분석
EnhancedVolcanoBioconductor (유지보수: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])1.6.0향상된 착색 및 라벨링을 통한 출판 준비 화산 플롯
FastQCBabraham Bioinformatics0.11.9고처리량 염
FeatureCountsBioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research2.0.0지정된 게놈 특징에 매핑된 염기서열 분석 판독 할당
MDPComputational Systems Biology Laboratory1.8.0Molecular Degree of Perturbation은 대조군의 섭동을 기반으로 전사체 데이터 샘플의 점수를 계산합니다
R R Core Group4.0.3통계 컴퓨팅 및 그래픽을 위한 프로그래밍 언어 및 자유 소프트웨어 환경
STARBioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research2.7.6a스플라이스 정렬을 고려하는 전략을 사용하여 RNA-seq 데이터 매핑의 많은 문제를 구체적으로 해결하도록 설계된 Aligner
Bowtie2Johns Hopkins University2.4.2염기서열 분석 읽기를 긴 참조 시퀀스에 정렬하기 위한 초고속 및 메모리 효율적인 도구
TrimmomaticTHE USADEL LAB0.39Illumina paired-end 및 single end 데이터에 대한 어댑터 시퀀스 작업
Docker 가져오기Docker20.10.2가능하고 예측 가능한 생물 정보 환경 만들기 (https://docs.docker.com/get-docker/)
WSL2-KernelWindowsNA
https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel Docker LinuxDockerNAhttps://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/
Docker Linux 저장소DockerNA가져오기https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository
MDP 웹 사이트전산 시스템 생물학 연구실NAhttps://mdp.sysbio.tools
Enrichr 웹 사이트MaayanLabNAhttps://maayanlab.cloud/Enrichr/
webCEMiTool전산 시스템 생물학 연구실NAhttps://cemitool.sysbio.tools/
gProfilerBioinformatics, Algorithmics and Data Mining GroupNAhttps://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost
goseqBioconductor (관리자: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])NAhttp://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html
SRA NCBI 연구NCBINAhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/
기서열분석 , . 재현

참고문헌

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  1. Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases. Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).
  2. Burt, F. J., et al. Chikungunya virus: an update o....

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