방법 논문

키메라 항원 수용체 T 세포의 동적 이미징 [18F]테트라플루오로보레이트 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영

DOI:

10.3791/62334

⸱

2022년 2월 17일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 임상적으로 이용가능한 플랫폼으로 생체내에서 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 T 세포를 비침습적으로 추적하는 방법론을 기술한다.

초록

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키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포는 B 세포 악성 종양 또는 다발성 골수종 (MM) 환자에 대한 중추적 인 임상 시험에서 전례없는 결과를 보여주었습니다. 그러나, 수많은 장애물들이 효능을 제한하고, 생체 내에서의 지속성의 부족뿐만 아니라 종양 부위로의 불량한 밀매 및 침윤으로 인해 CAR T 세포 요법의 광범위한 사용을 금지한다. 또한, 사이토카인 방출 증후군이나 신경 독성과 같은 생명을 위협하는 독성이 주요 관심사입니다. CAR T 세포의 효율적이고 민감한 이미징 및 추적은 T 세포 밀매, 확장 및 생체내 특성화의 평가를 가능하게 하고, CAR T 세포 요법의 현재 한계를 극복하기 위한 전략의 개발을 가능하게 한다. 이 논문은 CAR T 세포에 요오드화 나트륨 교감 (NIS)을 통합하고 전임상 모델에서 [18F]테트라플루오로보레이트-양전자 방출 단층 촬영 ([18F]TFB-PET)을 사용하는 CAR T 세포 이미징에 대한 방법론을 설명합니다. 이 프로토콜에 기재된 방법은 본 연구에 사용된 것들 이외에 다른 CAR 구축물 및 표적 유전자에 적용될 수 있다.

서론

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키메라 항원 수용체 T (CAR T) 세포 요법은 혈액학적 악성 종양 1,2,3,4,5,6에서 빠르게 출현하고 잠재적으로 치유적인 접근법이다. CD19-지시된 CAR T (CART19) 또는 B 세포 성숙 항원 (BCMA) CART 세포 요법2 후에 특별한 임상 결과가 보고되었다. 이로 인해 미국 식품의약국(FDA)은 공격적인 B 세포 림프종(axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 및 lisocabtagene maraleucel)7, 급성 림프모구성 백혈병(Tisa-Cel)5,8, 맨틀 세포 림프종(brexucabtagene autoleuce)9 및 여포 림프종(Axi-Cel)10에 대한 CART19 세포의 승인을 받았다. . 가장 최근에, FDA는 다발성 골수종 (MM) (idecabtagene vicleucel)11 환자에서 BCMA 지시 CAR T 세포 요법을 승인했다. 또한, 만성 림프구성 백혈병(CLL)에 대한 CAR T 세포 치료제는 후기 단계의 임상 개발 단계에 있으며 향후 3년 이내에 FDA 승인을 받을 것으로 예상됩니다1.

CAR T 세포 요법의 전례 없는 결과에도 불구하고, 그것의 광범위한 사용은 1) 생체내 CAR T 세포 확장이 불충분하거나 종양 부위로의 불량한 밀매에 의해 제한되며, 이는 내구성 있는 반응의 낮은 비율로 이어진다.12,13 및 2) 사이토카인 방출 증후군(CRS)14,15을 포함한 생명을 위협하는 유해 사례의 발달 . CRS의 특징은 염증성 사이토카인/케모카인의 상승된 수준을 초래하는 면역 활성화뿐만 아니라 CAR T 세포 주입 후 대규모 T 세포 증식을 포함한다15,16. 따라서, 생체내에서 CAR T 세포를 이미지화하기 위한 검증된, 임상적 등급 전략의 개발은 1) CAR T 세포 추적이 생체내에서 실시간으로 추적되어 종양 부위로의 그들의 인신매매를 모니터링하고, 내성의 잠재적 메카니즘을 밝혀내고, 2) CAR T 세포 확장의 모니터링과 CRS의 발달과 같은 잠재적으로 그들의 독성을 예측하는 것을 허용할 것이다.

경미한 CRS의 임상 적 특징은 고열, 피로, 두통, 발진, 설사, 관절통, 근육통 및 불쾌감입니다. 더 심한 CRS에서 환자는 빈맥 / 저혈압, 모세관 누출, 심장 기능 장애, 신장 / 간 기능 부전 및 전파 된 혈관 내 응고를 일으킬 수 있습니다17,18. 일반적으로, 인터페론-감마, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자, 인터루킨(IL)-10, 및 IL-6을 포함하는 사이토카인의 상승 정도는 임상 증상의 중증도와 상관관계가 있는 것으로 나타났다17,19. 그러나, CRS를 예측하기 위한 "실시간" 혈청 사이토카인 모니터링의 광범위한 적용은 높은 비용 및 제한된 가용성으로 인해 어렵다. CAR T 세포 요법의 유익한 특성을 이용하기 위해, 입양 T 세포의 비침습적 영상화는 CAR T 세포 주입 후 효능, 독성 및 재발을 예측하는데 잠재적으로 이용될 수 있다.

몇몇 연구자들은 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT)을 사용하여 방사성 핵종 기반 이미징을 사용하는 전략을 개발했으며, 이는 고해상도 및 고감도를 제공합니다.20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 CAR T 세포 트래피킹의 생체내 시각화 및 모니터링. 이러한 방사성 핵종 기반 이미징 전략 중에서 요오드화 나트륨 심포터 (NIS)는 PET 스캔31,32을 사용하여 이미지 세포 및 바이러스에 민감한 양식으로 개발되었습니다. [18F]TFB-PET를 사용한 NIS+CAR T 세포 이미징은 CAR T 세포 확장, 트래피킹 및 독성을 평가하고 진단하는 민감하고 효율적이며 편리한 기술입니다30. 이 프로토콜은 1) 높은 효능을 갖는 이중 형질도입을 통한 NIS+CAR T 세포의 발달 및 2) [18F]TFB-PET 스캔으로 NIS+CAR T 세포를 이미징하기 위한 방법론을 기술한다. MM용 BCMA-CAR T 세포는 CAR T 세포 이미징을 위한 리포터로서 NIS를 설명하기 위한 개념 증명 모델로서 사용된다. 그러나, 이들 방법론은 임의의 다른 CAR T 세포 요법에 적용될 수 있다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 Mayo Clinic의 기관 검토위원회, 기관 생물 안전위원회 및 Mayo Clinic의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침을 따릅니다.

1. NIS+ BCMA-CAR T 세포 생산

참고: 이 프로토콜은 Mayo Clinic의 기관 검토 위원회(IRB 17-008762) 및 기관 생물안전위원회(IBC Bios00000006.04)의 지침을 따릅니다.

  1. BCMA-CAR, NIS, 및 루시페라제-녹색 형광 단백질 (GFP)-코딩 렌티바이러스의 생산.
    참고: 2세대 BCMA-CAR 구축물을 데노보(물질표 참조)를 합성하고, 신장인자-1알파(EF-1α) 전구모터의 제어 하에 3세대 렌티바이러스 벡터로 클로닝하였다. BCMA-CAR 구축물 (C11D5.3-41BBz)은 4-1BB 공동자극 및 항인간 BCMA 항체 클론 C11D5.333,34로부터 유래된 단쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하였다. NIS는 EF-1α 프로모터의 제어 하에 있으며 자가절단펩타이드(P2A)를 통해 퓨로마이신 내성 유전자에 결합한다. 루시페라아제-GFP를 코딩하는 렌티바이러스 벡터(물질의 표 참조)는 종양 세포를 형질도입하는데 사용되며, 그 후 GFP 및 루시페라제를 발현한다.
    1. 렌티바이러스 벡터 플라스미드를 준비한다: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg), 및 pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      참고: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro 및 pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro는 퓨로마이신 내성 유전자를 함유하고 있습니다. 따라서, NIS- 또는 루시페라제-GFP-형질도입된 세포는 앞서 기술된 바와 같이, 1 μg/mL 또는 2 μg/mL의 퓨로마이신 디하이드로클로라이드로 선택될 수 있다(14,35).
    2. 20 × 293T 세포의 106개를 T175 플라스크에 시드하고, 5% CO2와 함께 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 293T 세포가 현미경으로 직접 시각화하여 70-90% 합류로 플라스크에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.
    3. 15 μg의 발현 벡터 (예를 들어, CAR, NIS, 또는 루시페라아제-GFP 선형 DNA), 7 μg의 엔벨로프 벡터 (VSV-G), 및 18 μg의 패키징 벡터 (gag, pol, rev, 및 tat)의 마스터 믹스를 제조하였다. DNA 마스터 믹스를 트랜스펙션 배지 4.5 mL에 희석하고, 이어서 111 μL의 프리콤플렉스 시약 (혼합물 A)을 첨가한다.
    4. 새로운 튜브를 준비하고, 129 μL의 리포좀 형질감염 시약을 트랜스펙션 배지 4.5 mL에 희석하였다(혼합물 B).
    5. 혼합물 A와 B를 결합하고 튜브를 흔들어 내용물을 혼합하십시오. 실온(RT)에서 30분 동안 인큐베이션한다.
    6. 인큐베이션 후, 세포를 분리하지 않고 세포 상청액을 간단히 흡인하고, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-글루타민을 함유하는 성장 배지 16 mL를 첨가한다. 이어서, 혼합물 A 및 B의 혼합물을 293T 세포 상에 적가한다. 마지막으로, 형질감염된 세포를 37°C, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
    7. 형질감염 후 1일째 및 2일에, 293T의 상청액을 수확하고, 900× g 에서 10분 동안 스핀다운하고, 0.45μm 나일론 필터를 통해 여과한다. 여액을 2시간 동안 112,700 × g 에서 초원심분리하여 24 및 48 h에서 농축하고, -80°C에서 동결시켰다.
  2. 생체 외 T 세포 분리 (그림 1)
    참고 : 무균 기술과 개인 보호 장비를 사용하여 층류 캐비닛에서 모든 세포 배양 작업을 수행하십시오. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 apheresis 동안 수집 된 건강한 자원 봉사자 기증자 혈액에서 수확됩니다36. 본 연구에 사용된 인간 세포에 대해 병원체 스크리닝을 수행하였다.
    1. 표준 밀도 구배 기술을 사용하여 PBMC를 분리합니다.
      1. 15 mL의 밀도 구배 배지 (밀도 1.077 g / mL) (알파-D-글루코피라노시드, 베타-D-프룩토푸라노실 단독중합체 및 3-(아세틸아미노)-5-(아세틸메틸아미노)-2,4,6-트리오도벤조산 모노나트륨 염)를 기포를 만들지 않고 50 mL 밀도 구배 분리관에 부드럽게 첨가 하십시오 (물표 참조).
      2. 세포 포획을 방지하려면 1:1 부피비로 2% FBS를 포함하는 인산염 완충 식염수(PBS, 염화칼륨 0.2g/L, 인산칼륨 단염기성 칼륨 0.2g/L, 염화나트륨 8g/L, 인산나트륨 이염기성 1.15g/L)로 혈액 샘플을 희석하십시오. 희석 된 혈액을 밀도 구배 매질의 꼭대기에 부드럽게 옮기고 둘 사이의 계면을 깨뜨리지 마십시오. RT에서 10분 동안 1,200 × g 에서 회전합니다.
        참고: 50 mL 밀도 구배 분리관은 혈액 샘플 4-17 mL의 분리에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 50 mL 밀도 구배 분리 튜브( 표 참조)는 원심분리 동안 "브레이크 오프"를 필요로 하지 않는다. 그러나 표준 50mL 튜브를 사용하는 경우 브레이크를 꺼야 하며 30분 동안 원심분리가 필요합니다.
      3. 상청액을 새로운 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고, 최대 50 mL를 채워서 PBS + 2% FBS로 세척한 다음, RT에서 8분 동안 300 × g 에서 스핀다운한다.
      4. 상청액을 흡인하고, 펠릿화된 세포를 50 mL의 PBS + 2% FBS에 재현탁시켰다. 세포 수를 세고 RT에서 8분 동안 300× g 으로 스핀다운합니다. 이전 단계를 반복하여 총 2회 세척합니다.
    2. 상청액을 흡인하고, 펠렛화된 세포를 PBS + 2% FBS로 50 × 106 cells/mL의 농도로 재현탁시켰다.
    3. 음성 선택 마그네틱 비드 키트를 사용하여 PBMC로부터 T 세포 분리를 수행한다.
      참고: 이상적인 음성 선택 키트에는 T 세포 이외의 세포에서 발현되는 항원에 대한 항체에 부착된 자기 비드가 포함되어 있습니다. 일반적으로 사용되는 키트에는 CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 및 CD16에 대한 자기 비드에 접합된 항체가 들어 있습니다(표 참조).
      1. PBMC를 14mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 이어서, PBMCs 및 음성 선택 항체 칵테일을 완전 자동화된 세포 분리기에 넣고, 제조자의 프로토콜에 따라 T 세포 단리를 수행한다.
  3. T 세포 자극 및 T 세포 확장 (도 1)
    1. 분리된 T 세포를 배양하기 위해, 10% 인간 혈청 알부민과 1% 페니실린-스트렙토마이신-글루타민이 보충된 무혈청 조혈 세포 배지로 만든 T 세포 확장 배지(TCM)를 준비한다14. T 세포 분리 후, 세포를 계수하고 TCM으로 2 × 106 세포/mL의 농도로 배양하였다.
    2. T 세포로 배양하기 전에 항-CD3/CD28 비드를 TCM으로 3회 세척하십시오.
      1. 소용돌이에 의해 비드가 들어있는 바이알을 혼합한다. 이어서, 필요한 부피의 비드(3:1 비드:세포)를 피펫(예를 들어, T 세포의 1.0× 106개 세포를 자극할 때, 3.0 × 106개의 항-CD3/CD28 비드를 사용하여)을 멸균 마이크로원심분리 튜브(1.5 mL) 내로 피펫하고, 1 mL의 TCM에 재현탁시킨다.
    3. 비드가 있는 마이크로원심분리 튜브를 자석 상에 1분 동안 놓고, 상청액을 흡인시킨다. 튜브를 자석으로부터 제거하고, 세척된 비드를 1 mL의 TCM에 재현탁시켰다. 이전 두 단계를 반복하여 총 3번의 세척을 수행합니다.
    4. 비드를 1 mL의 TCM에 재현탁시키고 이를 T 세포로 옮긴다. 그런 다음 T 세포를 TCM으로 1.0 × 106 cells/mL의 최종 농도로 희석하십시오. T-세포/비드 현탁액을 조직 배양으로 처리된 6-웰 플레이트로 옮기고 배양기(37°C, 5% CO2)에 넣습니다.
  4. 렌티바이러스의 적정(그림 2)
    1. 적정 분석을 위해 T 세포를 준비한다. 약 1.0 x 106 세포가 한 종류의 바이러스를 적정할 수 있는지 확인하십시오.
    2. 섹션 1.3.2에 기재된 바와 같이 T 세포를 자극한다.
    3. 플레이트 1.0 × 자극된 T 세포의 105 세포를 96-웰 플레이트 (역가 플레이트)에서 24시간 동안 37°C, 5% CO2 에서 인큐베이션한다 (도 2A). 섹션 1.2에 기재된 바와 같이 T 세포를 단리하고 자극한다.
    4. 100 μL의 TCM을 지정된 컬럼 및 형질도입되지 않은 제어 웰의 웰에 첨가하여 희석 플레이트(96-웰 플레이트)를 제조하였다(도 2B).
    5. 렌티바이러스 입자 한 병을 얼음 위에 녹이고 부드럽게 위아래로 피펫을 올려 잘 섞는다. 50 μL의 바이러스 상청액을 96-웰 플레이트의 컬럼 6의 웰 내로 옮긴다(희석 3). 피펫을 위아래로 잘 섞습니다.
    6. 연속 희석 수행 (2배 연속 희석): 웰 A6에서 웰 B6로 50 μL를 옮긴 다음 웰 B6에서 웰 C6으로 50 μL를 옮기고; G6까지 반복하십시오. 이어서, 희석된 바이러스 50 μL를 역가 플레이트에 첨가한다(도 2B).
    7. 역가 플레이트를 37°C, 5% CO2 에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 유세포 분석기에 의해 CAR-, NIS-, 또는 GFP 양성 세포의 백분율을 결정한다(도 2C).
      1. 역가 플레이트를 4°C에서 3분 동안 650 × g 에서 두 번 아래로 방사하여 웰을 세척한다.
      2. 형질도입된 T 세포를 단계 1.5.3 내지 1.5.9에 기재된 바와 같이 착색시킨다.
      3. 화학식 1을 사용하여 CAR-, NIS-, 또는 GFP 양성 세포의 백분율에 기초하여 역가를 결정한다:
        역가 = 특이적 희석/부피에 ×한 형질도입시 BCMA-CAR+ 또는 NIS+ T 세포 × T 세포 계수의 백분율 (1)
  5. 렌티바이러스 및 NIS의 형질도입+BCMA-CAR T 세포 확장
    1. T 세포 자극 후 스물네 내지 48 h는, 자극된 T 세포에 대해 렌티바이러스 형질도입을 수행한다 (T 세포는 클러스터를 형성해야 한다).
      1. CAR 또는 NIS를 코딩하는 냉동 렌티바이러스를 4°C에서 해동시킨다.
      2. 자극된 T 세포를 잘 섞어 클러스터를 부수고, 5.0의 감염 다중도(MOI)에서 갓 해동된 바이러스를 추가하기만 하면 됩니다(1.0 × 106 T 세포를 형질도입할 때, 렌티비론의 5.0 × 106을 사용). 형질도입된 세포를 37°C, 5% CO2에서 인큐베이션한다.
      3. 3일, 4일, 5일에는 혈소세포계(hematocytometer)37 또는 완전 자동화된 세포 계수기(38)를 사용하여 형질도입된 T 세포를 계수하고, 신선하고 미리 가온된 TCM을 첨가하여 세포 농도를 1.0 × 106 세포/mL로 조정한다. 퓨로마이신 내성 유전자를 운반하는 NIS 형질도입된 T 세포의 경우, 3일, 4일, 5일에 1μg/mL의 퓨로마이신 디하이드로클로라이드로 세포를 치료한다.
    2. 6일째에, T 세포 클러스터를 분해하기 위해 잘 혼합함으로써 형질도입된 T 세포로부터 항-CD3/CD28 비드를 제거하고(단계 1.3.4로부터) 이를 1분 동안 자석에 넣었다. 이어서, 수집된 형질도입된 T 세포를 1.0 내지 106 세포/mL의 농도로 배양물에 다시 넣× 한다. T 세포로부터 비드를 제거한 후, 유세포 분석기에 의해 CAR 및 NIS의 발현을 평가하였다.
      참고: BCMA-CAR의 단쇄 가변 단편은 마우스로부터 유래되므로, 알렉사 플루오르 647과 접합된 염소 항-마우스 IgG (H+L)로 염색될 수 있다. NIS는 항-인간 ETNL [aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)에 상응하는 합성 펩티드]을 사용하여 검출될 수 있다. 이 항체는 NIS의 세포질 C-말단을 인식한다. 따라서, T 세포는 항-인간 NIS 항체와 함께 인큐베이션하기 전에 투과화되어야 한다.
    3. 염소 항-마우스 IgG (H+L)를 사용하여 BCMA-CAR의 표면 염색을 수행한다.
      1. 배양물의 분취량을 취하고(예를 들어, 50,000 T 세포) 유동 완충액(PBS, 1% FBS, 및 1% 나트륨 아지드)으로 세척한다. 다음에, 세포를 50 μL의 유동 완충액으로 재현탁시키고, 세포를 CAR 발현을 검출하기 위한 1 μL의 염소 항-마우스 항체 및 죽은 세포를 배제하는 0.3 μL의 살아있는 죽은 아쿠아로 염색한다.
      2. RT에서 어둠 속에서 15분 동안 인큐베이션하고, 150 μL의 유동 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고, 세포를 4°C에서 3분 동안 650 × g 에서 원심분리한다.
    4. 표면 CAR 염색 후, 100 μL의 고정 배지 (4.21% 포름알데히드를 갖는 PBS)를 첨가하여 세포를 고정시키고 투과시키고, 4°C에서 20분 동안 인큐베이션한다. 세포를 사포닌과 같은 세포 투과화제 (4°C에서 3분 동안 650 × g )를 함유하는 완충액 100 μL로 두 번 세척한다.
    5. 고정된/투과된 세포를 50μL의 투과성 완충액에 재현탁시킨다. 이어서, 0.3 ng의 항-인간 ETNL NIS 항체를 50 μL의 유동 완충액에 첨가하고, 4°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
    6. 150 μL의 유동 완충액을 첨가하고, 세포를 4°C에서 3분 동안 650 × g 에서 원심분리한다. 세포를 4°C에서 30분 동안 50 μL의 유동 완충액 중 2.5 μL의 항토끼 이차 항체로 인큐베이션하고, 150 μL의 유동 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고, 4°C에서 3분 동안 650 × g 에서 원심분리한다.
    7. 마지막으로, 200μL의 유동 완충액에 재현탁하고 유세포 분석을 수행하여 형질도입 효율을 결정한다(도 3A,B).
    8. 8일째에, T 세포를 4°C에서 8분 동안 300 × g 에서 카운트하고 스핀다운시킨다. T 세포를 10 × 106/mL의 농도로 동결 배지 (90% FBS + 10% 디메틸설폭사이드[DMSO])로 재현탁시킨 다음, 각각 1 mL를 라벨링된 cryovials로 옮긴다.
    9. 바이알을 48시간 동안 -80°C 냉동고에 넣는다. 48시간 후(및 10일째까지), T 세포를 액체 질소로 옮긴다.
      참고: NIS+ CAR T 세포 생산의 개요는 도 1을 참조하십시오. 도 3D는 3개의 상이한 공여자로부터의 생체외 T 세포 확장의 예를 나타낸다.

2. [18F]TFB-PET 스캔을 통한 NIS+ BCMA-CAR T 세포 이미징

참고: 이 프로토콜은 Mayo Clinic의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC A00001767-16), IRB 및 IBC(Bios00000006.04)의 지침을 따릅니다. OPM-2는 BCMA+ MM 세포주이며, 이는 종종 BCMA-CAR T 세포39,40의 표적 세포주로서 사용된다.

  1. 루시페라아제+ BCMA+ OPM-2 세포를 확립한다.
    1. 500,000개의 OPM-2 세포를 조직 배양-처리된 24-웰 플레이트에 시드한다. 루시페라아제-GFP를 코딩하는 렌티바이러스를 4°C에서 해동시킨다.
    2. OPM-2 세포에 3.0의 MOI에서 갓 해동된 바이러스를 추가하고 피펫팅으로 잘 섞는다. 플레이트를 인큐베이터 (37°C, 5% CO2)에 놓는다.
    3. 형질도입 후 마흔여덟 시간 후, 퓨로마이신 2μg/mL를 첨가하여 형질도입된 세포를 선택한다. 형질도입 나흘 후, GFP 양성 세포(루시페라아제-양성)를 유세포 분석기로 평가하였다(도 3E).
  2. BCMA+ OPM-2 이종이식편 마우스 모델을 확립한다(그림 4).
    1. 루시페라아제+ OPM-2 세포를 계수하고 이를 두 번 스핀다운하여 모든 세포 배양 배지를 제거한다. OPM-2 세포를 PBS로 10 × 106 세포/mL의 농도로 재현탁시킨다.
    2. -21일째에, 루시페라아제+ OPM-2 세포의 100 μL(1.0 × 106 세포)를 8-12주령의 면역저하된 NOD-scid IL2rγnull(NSG) 마우스의 꼬리에 주입한다(도 4).
    3. OPM-2 세포 주사 후 20일째(CAR T 세포 주사의 -1일째)에, 생체발광 영상화(BLI)를 통해 종양 부담을 확인하였다(도 4).
      참고 : OPM-2 세포는 느리게 성장하는 종양을 형성하며, 이는 일반적으로 생착에 2-3 주가 걸립니다.
    4. 복강내 (IP) 주사를 통해 OPM-2 이종이식편 마우스에 10μL/g의 D-루시페린을 투여한다. 10분 후, 2% 이소플루란 가스 하에서 마우스에 대해 BLI를 수행한다(도 5A). 종양 생착을 확인한 후, 종양 부담에 따라 마우스를 무작위화한다.
    5. CAR T 세포 주입의 -1일째에, NIS+BCMA-CAR T 세포를 해동시키고, 원심분리(300 × g, 8분, 4°C)에 의해 동결 배지를 제거하였다. 이어서, 세포를 2.0 × 106 세포/mL에서 TCM으로 재현탁시키고 밤새 인큐베이션한다(37°C, 5% CO2).
    6. 0일째에, NIS+BCMA-CAR T 세포를 계수하고 원심분리한다(300 × g, 8분, 4°C). NIS+BCMA-CAR T 세포를 PBS로 50 × 106 세포/mL로 재현탁시킨다.
    7. OPM-2 이종이식편 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 NIS+BCMA-CAR T 세포의 100 μL(5.0 × 106 세포)를 투여한다. 7일째 및 15일에, PET 스캔을 이용하여 마우스를 이미지화한다.
  3. NIS+BCMA-CAR T 세포 BCMA+OPM-2 이종이식편 마우스 모델을 이용한 생체내 영상화.
    1. 이미징 전에 마우스의 무게를 측정하고 금속 귀 태그를 제거하여 금속 관련 아티팩트를 제거하십시오.
    2. 앞서 설명된 바와 같이 [18F]TFB를 준비한다41.
      참고 : [18F] TFB는 사용 당일에 생산되어야합니다. 방사성 화학 순도는 >99 %이고 몰 활성>5 GBq / mmol이어야합니다.
    3. 꼬리 정맥 주사를 통해 9.25 MBq [18F]TFB를 정맥 주사하십시오. 방사선 추적기가 신체에 분포하고 혈액을 맑게하는 데 ~ 40 분의 흡수 기간을 허용하십시오.
    4. 이소플루란 흡입을 사용하여 마우스를 마취하십시오 (2 %).
      참고: 이소플루란은 신속하고 신뢰할 수 있는 발병 및 회복을 갖기 때문에 선호되는 흡입 마취제입니다.
    5. 마우스를 마취하기 전에 소독제 클리너로 마취기의 모든 표면을 청소하십시오.
    6. 마우스를 유도 챔버 안에 넣습니다. 기화기 다이얼을 2 %로 돌리고 마우스가 1-2 분 이내에 재발하고 응답하지 않을 때까지 기다리십시오.
    7. 불충분 한 마취 또는 호흡 기능의 과도한 우울증을 피하기 위해 마우스를 모니터링하십시오. 간단히 말해서, 불충분 한 마취를 확인하기 위해 발가락을 꼬집습니다.
      참고 : 정상적인 호흡률은 최대 180 / min이며 허용 가능한 강하율은 50 %입니다.
    8. 각막 건조와 외상을 피하기 위해 안과 연고를 바르십시오.
    9. 마이크로 PET/CT 이미징 워크스테이션에서 마취된 마우스로 주사 후 45분 후에 PET/CT 이미지를 획득 합니다(자료 표 참조). 그런 다음 15분 동안 정적 PET 이미지를 획득한 후 360° 회전으로 5분 동안 CT 이미지를 획득하고 500μA, 80keV 및 200ms 노출에서 180개의 프로젝션을 촬영합니다.
  4. 획득한 이미징 데이터 분석
    1. PET 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석합니다(그림 5B 및 보조 비디오 S1).
    2. 관심 볼륨(VOI)을 정의합니다.
    3. 수식 (2)를 사용하여 표준화 된 흡수 값 (SUV)을 계산하십시오.
      VOI에서의 SUV = VOI (MBq/mL) × 체중(g) / 투여 용량(MBq)에서의 활동 농도 (2)
  5. 유세포 분석기를 통한 종양 부위로의 NIS+BCMA-CAR T 세포 밀매의 확인
    1. [18F]TFB-PET 이미징 후 마우스를 케이지에 다시 넣습니다. 마취를 중단 한 후 동물이 의도적 인 움직임을 할 수있을 때까지 동물을 모니터링하고 음식과 물에 접근 할 수 있는지 확인하십시오.
    2. 주사된 [18F]TFB가 붕괴될 때까지 마우스를 모니터링한다. 방사성 동위원소가 검출되지 않으면 마우스를 CO2로 안락사시킵니다.
    3. 안락사시키려면 마우스를 케이지 (케이지 당 5 마리 이하의 마우스)에 넣으십시오.
    4. 약 5-10 분 안에 호흡이 완전히 중단 될 때까지 마우스를 CO2 에 노출시킵니다.
      참고: 이 안락사 방법은 동물 안락사에 대한 AVMA 지침(2020 에디션)과 일치해야 합니다.
    5. 생쥐의 죽음을 보장하려면 동물의 머리 뒤쪽과 꼬리 바닥을 움켜 잡은 다음 손을 서로 떼어 내거나 떼어 내어 자궁 경부 탈구를 수행하십시오.
    6. 골수를 수확하여 NIS+BCMA-CAR T 세포가 종양 부위로 효율적으로 소통하는지 확인합니다.
    7. 수확된 대퇴골 및 경골을 5 mL의 세포 배양 배지를 함유하는 6-웰 플레이트로 옮긴다. 대퇴골과 경골에서 근육과 힘줄을 제거하고 대퇴골과 경골의 양쪽 끝 (관절 위)을 자르십시오.
    8. 인슐린 주사기를 세포 배양 배지로 채우고 골수를 6-웰 플레이트 상에 플러시한다. 대퇴골의 경우 대퇴골 직경이 경골보다 크기 때문에 22G 바늘과 5 mL 주사기를 사용하십시오.
    9. 플런저의 평평한 끝을 사용하여 골수를 갈아냅니다. 멸균된 50 mL 원뿔형 튜브 상에 70 μm 세포 스트레이너를 놓고, 분쇄된 골수를 여과한다. 이어서, 튜브를 유동 완충액으로 채우고, 튜브를 4°C에서 8분 동안 300 × g 에서 원심분리한다.
    10. 상청액을 흡인하고, 골수를 5 mL의 유동 완충액으로 재현탁시킨다. 200μL의 골수를 96웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 300 × g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리한다. 상청액을 데칸트하고, 세포를 50 μL의 유동 완충액으로 재현탁시켰다.
    11. 0.25 μg의 마우스 CD45, 0.03 μg의 인간 CD45, 0.06 μg의 인간 CD3, 0.24 μg의 인간 BCMA 및 0.3 μL의 살/죽은 아쿠아에 대한 유동 항체로 골수를 얼룩지게 한다. 플레이트를 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 인큐베이션한다.
    12. 플레이트를 300 × g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리한다. 이어서, 200 μL의 유동 완충액을 첨가하고, 유동 세포계에서 실행한다(도 5C).

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

도 1은 NIS+BCMA-CAR T 세포를 생성하는 단계를 나타낸다. 0일째에, PBMCs를 분리한 다음, 음성 선택에 의해 T 세포를 분리한다. 이어서, T 세포를 항-CD3/CD28 비드로 자극한다. 1일째에, T 세포를 NIS 및 BCMA-CAR 렌티바이러스 둘 다로 형질도입한다. 3일, 4일, 5일째에 T 세포를 계수하고 배지로 사료를 공급하여 농도를 1.0 × 106/mL로 조정한다. NIS 형질도입된 T 세포의 경우, 퓨로마이신 1μg/mL를 첨가하여 NIS+ 세포를 선택하십시오. 6일째에, 세포를 자석에 잠시 동안 위치시켜 비드를 제거하였다. 이어서, 튜브로부터 비드화된 세포를 새로운 플라스크에 넣는다. 세포 (예를 들어, 50,000 세포)의 분취량을 취하고, 항체로 염색하여 유세포 분석기를 사용하여 T 세포의 표면에서 NIS 및 CAR의 발현을 확인한다. 8일째에, T 세포를 계수하고 10 ×

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문은 NIS를 CAR T 세포에 통합하고 [18F]TFB-PET 를 통해 생체 내에서 주입된 CAR T 세포를 이미징하는 방법론을 설명한다. 개념 증명으로서, NIS+BCMA-CAR T 세포는 이중 형질도입을 통해 생성되었다. 우리는 최근 NIS를 CAR T 세포에 혼입하는 것이 생체 내에서 CAR T 세포 기능 및 효능을 손상시키지 않으며 CAR T 세포 밀매 및 확장을 허용한다는 보고30을 보고하였다. CAR T 세포 요법이 현재의 B 세포 악성 종양을 넘어 CLL에서의 응용으로 계속 확장됨에 따라, 주입된 입양 T 세포의 비침습적 생체내 이미징 및 모니터링을 허용하는 도구에 대한 필요성이 더욱 커질 것이다. T 세포의 동적 이미징은 입양 T 세포 밀매의 검증을 가능하게 하고 잠재적으로 효능 및 독성의 조기 검출을 허용한다.

NIS는 임상 시...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SSK는 노바티스 (Mayo Clinic, University of Pennsylvania 및 Novartis 간의 계약을 통해)와 Mettaforge (Mayo Clinic을 통해)에게 허가 된 CAR 면역 요법의 특허에 대한 발명가입니다. RS, MJC 및 SSK는 Humanigen에 허가 된 CAR 면역 요법 분야의 특허에 대한 발명가입니다. SSK는 Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs 및 Lentigen으로부터 연구 자금을 지원받습니다. 수치는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 Mayo Clinic K2R 파이프 라인 (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) 및 Predolin Foundation (RS)을 통해 부분적으로 지원되었습니다. 그림 1, 2 및 4는 BioRender.com 로 작성되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
22 게이지 바늘Covidien8881250206
28 게이지 인슐린 주사기BD329461
96 웰 플레이트Corning3595
Anti-human (ETNL) NISImanisREA009ETNL 항체는 NIS
Anti-human BCMA, 클론 19F2, PE-Cy7BioLegend357507Flow 항체
안티 휴먼 CD45, 클론 HI30, BV421BioLegend304032Flow 항체
안티 마우스 CD45, 클론 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116Flow 항체
안티 토끼 IgGR & DF0110NIS 염색
BCMA-CAR 구조체IDT, Coralville, IA
BD  Cytofix/Cytoperm 고정/투과화 솔루션 키트BD554714
CD3 단클론 항체(OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS(세포 치료 시스템) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX 시스템  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652유세포 분석기
디메틸 설폭사이드MilliporeSigma D2650-100ML
Luer-Lok 팁이 있는 일회용 주사기BD309646
D-Luciferin, Potassium SaltGold BiotechnologyLUCK-1G
D-PBS(Dulbecco의 인산염 완충 식염수)Gibco14190-144
Dulbecco의 인산염 완충 식염수Gibco14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)AppliedBiosystemsA13346
Easy 50 EasySep 자석STEMCELL Technologies18002
EasySep 인간 T 세포 분리 키트STEMCELL Technologies17951음성 선택 마그네틱 비드; 17951RF는 팁 및 완충
소 태아 혈청Millipore SigmaF8067
염소 안티 마우스 IgG (H + L) 교차 흡착 2 차 항체, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon 다중 양식 PET / CT 스캐너Siemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
이소플루란 액체Piramal Critical Care66794-017-10
IVIS Lumina S5 이미징 시스템PerkinElmerCLS148588
IVIS® 스펙트럼 In Vivo 이미징 시스템PerkinElmer 
Lipofectamine 3000 형질주입 시약InvitrogenL3000075
LIVE/DEAD 고정성 아쿠아 데드 셀 염색 키트, 405nm 여기용InvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Nalgene Rapid-Flow 500mL 진공 필터, 0.22uM, 멸균Thermo Scientific450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500mL 진공 필터, 0.45uM, 멸균Thermo Scientific450-0045
NOD. CG-PRKDCSCID  Il2rgtm1Wjl/SzJJackson laboratory05557
OPM-2DSMZCRL-3273다발성 골수종 세포주
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389렌티바이러스 벡터 인코딩 루시페라아제-GFP
페니실린-스트렙토마이신-글루타민(100x), 액체Gibco10378-016
PMOD 소프트웨어PMODPBAS 및 P3D
풀링 인간 AB 혈청 플라즈마 파생혁신 연구IPLA-SERAB-H-100ML
퓨로마이신 디하이드로클로라이드MP Biomedicals, Inc.
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000전자동 세포 분리기
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450밀도 구배 분리 튜브
아지드화나트륨, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
T175 플라스크Corning353112
Terrell (isoflurane, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol 알코올 준비Covidien6818
X-VIVO 15 무혈청 조혈 세포 매체Lonza04-418Q
의 세포질 C 말단에 결합합니다.에 대한 2차 항체, 2세대 액 1242620210055210

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