멤브레인 결합-IL-21-변형 B 세포주를 이용한 자연살해(NK) 및 CAR-NK 세포 확장 방법

자연 살해 (NK) 세포는 CD56을 발현하고 T 세포 마커 인 CD3 ^1,2의 발현이 부족한 림프구의 중요한 하위 집합입니다. 기존의 NK 세포는 바이러스에 감염된 세포와 암세포의 면역 감시를 담당하는 선천성 면역 세포로 분류됩니다. NK 세포는 T 세포와 달리 CD16 또는 기타 활성화 수용체를 사용하여 감염 또는 악성 세포를 인식하며 항원 펩타이드와 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 분자 ^3,4 사이에 복합체를 형성 할 필요가 없습니다. 재발성 또는 불응성 CD19 양성 암(비호지킨 림프종 또는 만성 림프구성 백혈병[CLL])을 치료하기 위해 키메라 항원 수용체(CAR)-NK 세포를 사용한 최근 임상 조사는 CAR-NK^{세포의 뛰어난} 안전성 이점을 보여주었습니다5. 예를 들어, CAR-NK 세포 주입은 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 신경 독성, 심장 독성 및 사이토 카인 방출 증후군 (CRS) 6,7,8,9,10과 관련이 있습니다. 그러나 인간 NK 세포를 확장하는 기존의 방법은 강한 동족 사멸 및 텔로미어 부족을 가진 철저한 표현형을 보여 주었고, 이는 입양^{면역 요법을} 위한 적절한 수의 기능적 NK 세포를 얻는 데 큰 도전을 제시합니다11.

이러한 과제를 극복하기 위해, MHC 클래스^{I 분자의} 발현이 낮은 인간 B-림프모세포제 세포주인 721.221(이하 221) 세포주인 방사선 조사 및 유전자 조작 세포주를 사용하여 분획되지 않은 말초혈액 단핵세포(PBMC) 또는 제대혈(CB)로부터 1차 NK 세포를 직접 확장하는 방법이 개발되었습니다. 이전 연구에서는 NK 세포 확장에서 IL-21의 중요성을 보여주었습니다. 따라서, 721.221 세포주의 버전을 발현하는 유전자 조작된 막 결합 IL-21 (현재부터, 221-mIL-21)이 11,12,13,14,15로 개발되었다. 그 결과, 221-mIL-21 영양세포가 확장된 1차 NK 세포는 약 2-3주 동안 높은 NK 세포 순도를 유지하면서 평균 >40,000배로 확장되는 것으로 나타났다. 이 프로토콜의 적용에 관한 추가 정보는 Yang et ^al.16에서 찾을 수 있습니다.

이 프로토콜은 PBNK, CBNK, 조직 유래 NK 및 CAR-NK 세포의 생체 외 확장의 단계별 절차를 입증하는 것을 목표로 합니다.

이 프로토콜의 인체 조직 및 혈액 관련 작업은 Rutgers University Institutional Review Board (IRB)의 지침을 따릅니다.

1. 도 1과 같이 간 조직으로부터의 NK 세포 확장(Day 0).

참고: 초기 세포 수와 생존력은 장기 제거 이후 시간 및 초기 조직 샘플 양과 밀접한 관련이 있습니다. 그러나 조직을 행크 밸런스드 소금 용액 (HBSS) 30mL에 넣고 얼음이나 냉장고에서 밤새 4 ° C로 보관하면 NK 세포는 최대 24 시간 후에도 고순도와 생존력으로 확장 될 수 있습니다.

1. 멸균 수술 장비를 사용하여 조직 및 절편에서 림프구를 얻기 위해 생존 가능한 조직 영역을 식별합니다.
2. HBSS 30mL(칼슘 또는 마그네슘 제외)에 조직을 넣고 격리를 준비할 준비가 될 때까지 얼음 위에 두십시오.
3. 생물 안전 캐비닛 내부의 멸균 면도날 또는 가위와 집게를 사용하여 조직을 <0.5cm 입방체로 만듭니다.
4. HBSS에서 10x 스톡을 희석하여 1x 콜라게나제 IV 용액(10mg/mL)을 준비합니다(10x 콜라게나제 IV: 10mg/mL 또는 ~200U/mL).
5. 다진 조직 조각을 조직 해리 튜브에 넣습니다. 튜브에 4g 이하의 조직을 채우고 조직 조각을 ~10mL의 1x 콜라게나제 IV에 담그십시오.
   참고: DNase I을 사용하면 NK 생존력과 수율이 약간 감소할 수 있으므로 사용하지 않는 것이 좋습니다. 사용되는 특정 조직 해리 튜브에 대한 재료 표를 참조하십시오.
6. 조직 해리기 튜브를 조직 해리기에 넣고 37°C에서 혼합하여 조직을 완전히 다집니다.
   알림: 간 조직의 경우 30분 이상 걸릴 수 있습니다. 더 부서지기 쉬운 조직의 경우 약 15분이면 충분할 수 있습니다. 특정 조직 해리기 튜브 및 사용된 조직 해리기에 대한 재료 표를 참조하십시오.
7. 조직 해리기 튜브를 제거하고 5mL 주사기의 백엔드를 사용하여 40μm 나일론 세포 스트레이너를 통해 분쇄합니다. 용리액을 수집하고 소화되지 않은 큰 조각을 버립니다.
8. 실온에서 5분 동안 400 x g 의 용리액을 회전시킵니다. 상청액을 흡인하십시오.
9. 세포 펠릿을 30% 폴리비닐피롤리돈(PVP) 코팅 실리카에 재현탁하여 최종 림프구 분획을 오염시킬 지방 세포를 제거합니다.
   1. 1x PVP 코팅 실리카를 제조하려면 10x PBS에서 PVP 코팅 실리카를 9:1 희석하여 사용하십시오.
      알림: 사용된 특정 PVP 코팅 실리카에 대한 재료 표를 참조하십시오.
   2. 30% PVP 코팅 실리카를 제조하려면 1x PVP 코팅 실리카를 PBS/HBSS로 희석합니다.
10. 실온에서 5분 동안 400 x g 에서 셀 펠릿을 회전시킵니다. 상청액을 흡인하십시오.
11. 9mL의 R-10 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
    참고 : R-10 매체의 구성에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
12. 4mL의 Ficoll 또는 림프구 분리 배지에 세포 현탁액을 조심스럽게 층층화하여 적혈구 및 다형 핵 세포에서 림프구를 분리합니다.
13. 가속 및 브레이크를 끈 상태에서 실온에서 23분 동안 400 x g 에서 23분 동안 원심분리하거나 가장 낮은 설정에서 층을 분리합니다. 조심스럽게 상부 - 중간 층을 따라 내고 조직 침윤 림프구를 포함하는 간기를 수확하십시오.
14. 10mL의 배지로 세포를 헹구고 세포 계수, 유세포 분석, 세포의 분취 및 동결 또는 1차 NK 확장 프로토콜을 진행합니다.

2. 그림 2와 같이 PBMC(또는 CB 또는 장기 조직)로부터의 1차 NK 세포 확장(Day 0).

1. 동결된 PBMC를 동결시키고, 조사된 지지세포를 37°C 수조에서 해동시킨다.
2. PBMC 및 100 감마선 조사된(Gy-irradiated) 221-mIL-21 세포를 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 10 mL의 R-10 배지로 별도로 세척하였다.
3. 유동 세포분석을 위한 PBMC의 1 x 10⁶ 세포를 저장하십시오.
   참고: 초기 NK 세포 순도는 NK 세포 확장률을 계산하는 데 중요한 요소입니다.
4. 1mL의 R-10 배지에 세포를 재현탁합니다. 트리판 블루를 사용하여 세포를 세십시오.
5. 특별한 6 웰 플레이트에 있는 100 Gy 조사된 221-mIL-21 세포의 10 x 10 6 세포와 PBMC의 5x 10⁶ 세포를 섞으십시오 (물자의 표를 보십시오).
6. 인간 IL-2 (200 U / mL) 및 인간 IL-15 (5 ng / mL)가 보충 된 R-10 배지 30 mL를 추가합니다 ( 재료 표 참조).
7. 특수 6-웰 플레이트를 37°C에서 5%_CO2로 배양한다.
8. 3-4일마다 NK 세포를 유지하기 위해 인간 IL-2(200U/mL) 및 인간 IL-15(5ng/mL)가 보충된 R-10 배지로 배지를 교체합니다.
   알림: 각 배지 교체 시 추가 확장을 위해 웰당 20 x 10⁶ 셀 미만으로 유지하십시오. 최상의 생존력을 위해, 각 웰의 총 세포 수가 100 x 10⁶ 세포를 초과하지 않도록하십시오.
9. 총 세포 수, 생존율을 기록하고 3-4일 간격으로 유세포 분석을 수행하여 NK 세포 확장률을 계산하였다.

3. 그림 2와 같이 293T 세포의 부착(Day 2).

1. 처리된 100mm 플레이트당 11mL의 D-10 배지에서 1.8 x 10⁶ 293T 세포를 분할합니다.
   참고: D-10 매체의 구성에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
2. 293T 세포를 37°C에서 5%_CO2로 배양한다.

4. 레트로바이러스 형질감염(3일차)

1. 1.7mL 튜브에 470μL의 환원된 혈청 배지와 30μL의 형질주입 시약을 혼합합니다.
   참고: 사용된 특정 환원 혈청 배지 및 형질주입 시약에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
2. 별도의 1.7mL 튜브에서 SFG 벡터의 pRDF 플라스미드 2.5μg, Pegpam3 플라스미드 3.75μg 및 CAR 구축물 2.5μg을 환원된 혈청 배지에 추가하여 최종 부피가 500μL가 되도록 합니다.
3. 4.1단계와 4.2단계의 용액을 적가하여 혼합합니다.
4. 튜브를 실온에서 15분 동안 배양합니다.
5. 단계 4.4의 혼합물 1 mL를 1일째에 293T 세포 플레이트에 적가한다.
6. 플레이트를 37°C에서 5% CO2로 48-72시간 동안 배양합니다.

5. 레트로넥틴 플레이트 코팅 (3일차)

1. 레트로넥틴 단백질을 인산염 완충 식염수(PBS)로 최종 농도 50-100μg/mL로 희석합니다.
2. 희석된 레트로넥틴 500μL를 미처리 24-웰 플레이트(CAR 구축물당 5웰)의 각 웰에 첨가한다. 파라필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.

6. 형질 도입 (4 일차)

1. 레트로넥틴 플레이트를 2103 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리한다. 상청액을 폐기하십시오.
2. 24웰 플레이트의 각 웰을 1mL의 R-10 배지로 차단합니다.
3. 플레이트를 5%_CO2 와 함께 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
4. 레트로넥틴 플레이트가 차단되는 동안 원심분리기를 32°C로 예열합니다.
5. 0.45 μm 필터를 사용하여 형질감염된 293T 세포를 여과하여 레트로바이러스 상청액을 수집한다.
6. 여과된 레트로바이러스 상청액 2 mL를 각 웰에 분취한다.
7. 24웰 플레이트를 2103 x g 에서 32°C에서 2시간 동안 원심분리합니다.
8. 플레이트 원심분리 동안, 0일째부터 확장된 PBNK 세포를 수집하고 트리판 블루를 사용하여 세포를 계수한다.
   참고: IL-10(200U/mL) 및 IL-200(5ng/mL)가 보충된 R-15 배지를 추가하여 PBNK 세포를 계속 확장합니다.
9. IL-2 (200 U/mL) 및 IL-15 (5 ng/mL)로 보충된 R-10 배지로 확장된 PBNK 세포를 2.5 x 10 5-5 x 10 5 세포/mL(^0.5 x 10 6-1 x 10^웰당⁶ 세포)로 희석합니다.
   참고: 총 세포 수, 생존율을 기록하고, 유세포분석을 위해 5 x 10⁵ 개의 확장된 PBNK 세포를 저장하면 이러한 값이 NK 세포 확장 속도를 결정하는 데 중요하므로 유세포분석을 합니다.
10. 원심분리 후, 각 웰로부터 레트로바이러스 상청액을 부분적으로 흡인한다.
    참고: 완전히 흡인하지 마십시오, 즉 우물당 약 100μL의 레트로바이러스 상청액을 남겨두면 형질도입 효율이 감소할 수 있습니다.
11. 단계 6.8에서 희석된 확장된 PBNK 세포 2 mL를 각 웰에 분취한다.
12. 플레이트를 600 x g에서 32°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 5% CO2와 함께 37°C에서 48-72시간 동안 인큐베이션한다.
    알림: 플레이트를 파라필름으로 필름하지 마십시오.

7. 그림 2와 같이 CAR-NK 세포 수집(6일 또는 7일차).

1. 24웰 플레이트에서 세포를 부드럽게 수집하고 세포를 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   알림: 거품을 생성하면 세포 생존력이 감소하므로 거품을 생성하지 마십시오.
2. 튜브를 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
3. 1mL의 R-10 배지로 펠릿을 재현탁하고 Trypan Blue를 사용하여 세포를 계수합니다.
   참고: 형질도입 효율을 결정하기 위해 유세포분석을 위해 5 x 10⁵ 세포를 저장합니다.
4. 재현탁된 세포를 IL-2(200U/mL) 및 IL-15(5ng/mL)가 보충된 R-10 배지 30mL가 들어 있는 특수 6웰 플레이트로 옮깁니다.
5. 특수 6-웰 플레이트를 37°C에서 5%_CO2로 배양한다.
6. IL-2 (200 U / mL) 및 IL-15 (5 ng / mL)가 보충 된 R-10 배지를 교체하여 3-4 일마다 NK 세포를 유지하십시오.
   참고: 각 변경 시 추가 확장을 위해 웰당 20 x 10⁶ 셀 미만을 유지하십시오. 최상의 생존력을 위해, 각 웰의 총 세포 수가 100 x 10⁶ 세포를 초과하지 않도록하십시오.
7. 총 세포 수, 생존율을 기록하고, 3-4일마다 유세포 분석을 수행하여 NK 세포 확장률을 계산하였다.
8. 적절한 시험관 내 또는 생체내 분석을 위해 세포를 사용한다.
   참고: 생체외 확장 PBNK 및 CAR-NK 세포는 약 4주 동안 37°C 인큐베이터에서 배양될 수 있습니다.
9. NK 세포수 및 순도를 유세포 분석기로 7일째, 11일째, 14일째, 18일째 및 21일째에 조사하였다.

221-mIL-21 영양세포 방법론을 사용한 조직 침윤 NK 세포 분리 및 PBNK 세포 확장의 개략적인 워크플로우가 그림 1 및 그림 2에 나와 있습니다. 확장된 PBNK 세포를 유세포 분석을 위해 3일 또는 4일마다 채취하여 세포를 항인간 CD56 및 항인간 CD3로 염색하여 NK 세포 순도를 확인하였다. 팽창 시스템의 재현성을 보여주기 위해 두 개의 다른 공여체를 사용하여 실험을 반복했습니다(그림 3). 221-mIL-21에 의해 확장된 PBNK 세포는 거의 5 × 104 배 확장되는 것으로 나타났다 (도 3A). 또한, NK 세포 순도는 21일 확장 기간 동안 약 85%로 높게 유지되었습니다 (그림 3B). 221-mIL-21 영양세포 확장 시스템을 사용하여 NK 세포 순도는 공여자와 무관하게 85%-95% 사이에서 일관되게 범위를 유지했습니다(데이터는 표시되지 않음). 221-mIL-21 확장 시스템의 견고성을 입증하기 위해, PBMCs는 확장 전에 항-CD56 및 항-CD3에 대해 염색되었고, 이는 NK 세포에 대해 7.09%의 세포 순도 및 높은 비율의 T 세포를 나타냈다(도 4A). PBMCs는 NK 세포를 확장시키기 위해 221-mIL-21과 공동 배양되었다; NK 순도를 4일째에 CAR-NK 형질도입 전에 확인하였다(도 4A). CAR-NK 세포를 채취하여 항-CD56, 항-CD3 및 항-hIgG(H+L) F(ab')2에 대해 염색한 결과, 높은 NK 세포 집단(7일째 86.9%)과 약 70%의 높은 CAR 형질도입 효율을 보였다(그림 4). 더 높은 형질 도입 효율 (최대 95 %)도 레트로 바이러스 패키징 시스템을 사용하여 관찰되었습니다. 전체적으로 이러한 데이터는 221-mIL-21 영양세포가 NK 세포를 성공적으로 확장하고 생체 외 NK 세포 순도를 보존할 수 있음을 보여줍니다.

그림 1: 고형 인간 장기 샘플의 NK 세포 확장 다이어그램. 간단히 말해서, 얻어진 인간 간 샘플은 기계적 소화를 위해 작은 입방체로 다진다. 해리 된 세포는 PVP 코팅 실리카 및 림프구 분리 배지를 사용하여 분리됩니다. 또한, NK 세포는 도 2에 기재된 확장 프로토콜을 이용하여 확장된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: PBMC에서 CAR-NK 세포 생성의 개략적인 워크플로우. 간략하게, 221-mIL21 영양세포 세포를 0일째에 IL-2 및 IL-15가 보충된 PBMC와 함께 배양하기 전에 100 Gy에서 조사하였다. 병행하여, 293T 세포를 레트로바이러스 패키징 시스템으로 형질감염시켜 CAR 레트로바이러스를 생산한 다음, IL-2 및 IL-15의 존재하에 확장된 PBNK 세포 내로 형질도입하였다. 1차 CAR-NK 세포는 7일째에 수확하고 21일 동안 계속 확장하였다. 이 수치는 Yang et al.16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: PBNK 셀의 동적 시간 경과 확장. (A) 22일 코스 동안 PBNK의 배 확장. 세포를 유동 세포분석을 위해 지시된 날에 항-CD56 및 항-CD3으로 염색하였다. NK 세포의 총 수는 전체 세포 수에 NK 세포 순도를 곱하여 결정하였다. 팽창률은 다음과 같이 생성되었다: (NK 세포의 수)Tn/(NK 세포의 수)T0, 여기서 NK 세포의 수 = (NK 세포 순도의 백분율) × (총 세포 수),T0는 시간 0일에서의 NK 세포의 수이고, Tn은 시간 n일의 NK 세포의 수이다. (B) 22일 시간 과정 동안의 NK 세포 순도. NK 세포 확장은 서로 다른 2명의 공여자와 함께 2회 반복하였다. 오차 막대는 SEM± 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: CAR-NK 세포의 대표적인 유세포 분석 (A) 18일 과정 동안 CAR-NK 세포의 NK 세포 순도의 동적 시간 경과를 보여주는 대표적인 점도표. 유동 세포분석 분석은 지시된 시점에서 세포를 항-CD56 및 항-CD3으로 염색함으로써 평가하였다. 0일차는 PBNK의 사전 확장을 나타냅니다. 4일째는 PBNK의 확장 후 및 CAR-NK 세포의 사전 형질도입을 나타낸다. 7일째는 CAR-NK 세포의 형질도입 후를 나타낸다. (B) 레트로바이러스 패키징 시스템을 이용한 CAR-NK 세포의 형질도입 효율을 보여주는 대표적인 점도표. 세포를 유세포분석을 위해 항-CD56, 항-CD3 및 항-hIgG(H+L) F(ab')2로 염색하였다. (C) 18일째에 CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+ 및 CD56-CD3-를 포함한 다양한 하위 집합에서 CAR 발현을 보여주는 대표적인 점도표. 세포를 유세포분석을 위해 항-CD56, 항-CD3 및 항-hIgG(H+L) F(ab')2 (CAR 발현을 나타냄)로 염색하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.