이 논문은 DNA 기반 장력 프로브를 사용하여 면역 세포에 의해 가해지는 수용체 힘을 이미지화하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 수용체 힘>4.7pN을 실시간으로 매핑할 수 있으며 시간이 지남에 따라 힘을 통합할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
인접한 두 세포 사이의 접합부와 세포와 세포외 기질 사이의 접합부에서 전달되는 기계적 힘은 발달에서 면역학에 이르는 많은 과정을 조절하는 데 중요합니다. 따라서 분자 규모에서 이러한 힘을 연구하는 도구를 개발하는 것이 중요합니다. 우리 그룹은 세포에서 생성되어 특정 리간드로 전달되는 힘을 정량화하고 시각화하기 위해 분자 장력 센서 제품군을 개발했습니다. 가장 민감한 종류의 분자 장력 센서는 핵산 줄기 루프 헤어핀으로 구성됩니다. 이 센서는 형광단-소광제 쌍을 사용하여 힘을 받고 있는 DNA 헤어핀의 기계적 확장 및 풀림을 보고합니다. DNA 헤어핀 장력 센서의 한 가지 문제는 장력이 종료될 때 빠르게 헤어핀을 다시 접을 수 있어 일시적인 힘을 기록하기 어렵다는 것입니다. 이 기사에서는 기계적 정보를 "저장"할 수 있도록 "잠길" 수 있고 다시 접히는 것을 방지할 수 있는 DNA 장력 센서를 준비하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이를 통해 매우 일시적인 피코네톤 힘을 기록할 수 있으며, 이는 잠금 장치를 제거하는 상보적 핵산을 추가하여 이후에 "삭제"할 수 있습니다. 실시간 장력 매핑과 기계적 정보 저장 사이를 전환하는 이 기능은 T 세포가 면역 기능의 일부로 일반적으로 사용하는 약하고 수명이 짧으며 덜 풍부한 힘을 보여줍니다.
서론
면역 세포는 항원에 대해 표적 세포의 표면을 지속적으로 크롤링하고 스캔하여 표면을 박음으로써 병원체와 암세포를 방어합니다 1,2. 항원 인식은 T 세포 수용체(TCR)와 표적 세포 표면에서 발현되는 펩타이드-주요 조직적합성 복합체 MHC(pMHC) 복합체 사이의 결합에 따라 시작됩니다. TCR-pMHC 인식은 두 이동 셀 사이의 접합부에서 발생하기 때문에 오랫동안 기계적 힘이 발생하는 것으로 의심되어 왔습니다. 또한, 이것은 TCR 활성화의 기계 센서 모델로 이어졌으며, 이는 TCR 힘이 기능 3,4에 기여한다는 것을 시사합니다. 언제, 어디서, 어떻게 기계적 힘이 T 세포 기능에 기여하는지 이해하려면 T 세포에 의해 전달되는 분자력을 시각화하는 도구를 개발하는 것이 필수적입니다. 전통적으로, 견인력 현미경 (TFM) 및 마이크로 필러 어레이와 같은 방법은 세포력 5,6을 조사하는 데 사용됩니다. 그러나 TFM과 마이크로필러 어레이의 힘 감도는 나노뉴턴(nN) 규모이므로 세포 수용....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
OT-1 형질전환 마우스는 에모리 대학교의 동물 자원 시설부에 보관되어 있습니다. 모든 실험은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 프로토콜에 따라 승인 및 수행되었습니다.
1. 올리고뉴클레오티드 제조
- 리간드 가닥 DNA를 물에 용해시킵니다(18.2MΩ 저항률, 전체 프로토콜에 걸쳐 사용됨). Vortex 및 탁상용 원심분리기로 용액을 회전시킵니다. 최종 농도가 1mM이 되도록 물의 부피를 조정합니다. 나노드롭 분광광도계를 이용하여 농도를 검증하여 260 nm에서 흡광도를 측정하고 올리고뉴클레오티드의 흡광계수를 기준으로 최종 농도를 결정한다.
참고: 리간드 가닥은 각 말단, 5' 아민 및 3' 비오틴에 변형이 있어 형광단과 접합하고 비오티닐화 리간드를 제시합니다. 리간드 가닥의 아민기는 형광단과 접합되어야 합니다. Cy3B 염료는 높은 밝기와 광안정성으로 인해 이러한 접합에 사용되지만 일반적으로 상업적으로 제공되지 않으며 자체 접합이 필요합니다. 따라서, 다음 섹션에서는 아민과 NHS 에스테르 염료 사이의 접합에 대해 설명합니다. 핵산 변형을 위한 시설이나 자원에 접근할 수 없는 최종 사용자의 경우, 대신 Alexa 및 Atto 염료 제품군과 같이 밝고 광안정성이 있....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
여기서는 대표적인 표면 품질 관리 이미지를 보여줍니다(그림 4). 고품질 표면은 RICM 채널(그림 4B)에서 깨끗한 배경을 가져야 하고 Cy3B 채널(그림 4C)에서 균일한 형광 강도를 가져야 합니다. 동일한 이미징 장비와 동일한 형광 이미징 획득 조건으로, 배경 형광 강도는 DNA 프로브로 실험을 수행할 때마다 일관되고 재현 가능해야 합니다. 각 개별 실험 세트 전에 표면 품질 관리를 위한 마커로 사용하는 것이 좋습니다.
이 논문에서 우리는 닭 오브알부민을 특이적으로 인식하는 모델 세포 유형으로 OT-1 나이브 CD8+ 세포를 사용한 몇 가지 대표적인 데이터(그림 5)를 보여줍니다. CD3ε 항체는 시스템에 대한 양성 대조군으로 포함되며 동족 항.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에 제공된 자세한 절차를 통해 DNA 헤어핀 장력 프로브 기질을 준비하여 면역 세포에 의해 생성된 수용체 장력을 매핑하고 정량화할 수 있습니다. 세포가 DNA 헤어핀 장력 프로브 기판에 도금되면 수용체가 화학적으로나 기계적으로 리간드를 감지함에 따라 착지, 부착 및 확산되며, 후자는 프로브에 의해 감지됩니다. 그러나 어떤 경우에는 세포가 퍼지지 않을 수 있습니다 (그림 7A) 또는 장력 신호를 생성하지 못합니다. 이는 종종 표면 화학 문제의 결과이며 문제 해결이 필요합니다(표 1). 낮은 리간드 밀도는 세포 확산 실패를 초래하는 가장 일반적인 문제 중 하나입니다. 이는 분해된 리간드, 분해된 DNA 가닥, APTES 및/또는 LA-PEG-NHS와 같은 가수분해 시약, 응집된 금 나노입자 또는 불충분한 유리 커버슬립 세척과 같은 여러 요인의 결과일 수 있습니다. 성공적인 실험과 실패한 실험에 대한 기질 배경 형광 강도를 비교함으로써(
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작업은 NIH 보조금 R01GM131099, NIH R01GM124472 및 NSF CAREER 1350829의 지원을 받았습니다. pMHC 리간드에 대해 NIH Tetramer Facility에 감사드립니다. 이 연구는 Emory Comprehensive Glycomics Core에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3-하이드록시피콜린산 (3-HPA) | Sigma | 56197 | maldi-TOF-MS matrix |
| mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K | 표면 준비 |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane | Acros | AC430941000 | 표면 준비 |
| 10x 적혈구 용해 완충액 | Biolegend | 00-4333-57 | 완충액 |
| 8.8 nm 금 나노 입자, 탄닌 산 | Nanocomposix | 맞춤형 주문 | 표면 준비 |
| Atto647N NHS 에스테르 | 시그마 | 18373-1MG-F | 형광단, 올리고 준비 |
| Attofluor Cell Chamber, 현미경 검사용 | Thermo Fisher Scientific | A7816 | 이미징 |
| BD 주사기는 Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | 세포 |
| biotinylated anti-mouse CD3e | ebioscience | 13-0031-82 | 항체/리간드 |
| Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL) | 에 의거 대학교 NIH Tetramer Core Facility | NA | 항체/리간드 |
| 소 혈청 알부민 | Sigma | 735078001 | 비특이적 상호 작용 차단 |
| 세포 여과기 | Biologix | 15-1100 | 세포 |
| Coverslip Mini-Rack, 테플론 | Thermo Fisher Scientific | C14784 | 표면 분취 |
| Cy3B NHS 에스테르 | GE Healthcare | PA63101 | 형광단, 올리고 분취 |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) | Corning | 21-031-CM | 완충 |
| 에탄올 | 시그마 | 459836 | 표면 준비 |
| 행크' s balanced salts (HBSS) | Sigma | H8264 | 버퍼 |
| 과산화수소 | Sigma | H1009 | 표면 준비 |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | 표면 준비 |
| Midi MACS (LS) 시작 키트 | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | 세포 |
| 마우스 CD8+ T 세포 분리 키트 | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | 세포 |
| Nanosep MF 원심 분리기 Pall | laboratory | ODM02C35 | oligo prep |
| No. 2 라운드 유리 커버 슬립 | VWR | 48382-085 | 표면 준비 |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | 표면 준비 |
| P2 젤 | Bio-rad | 1504118 | oligo prep |
| sufuric acid | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | 표면 준비 |
| Sulfo-NHS 아세테이트 | Thermo Fisher Scientific | 26777 | 표면 준비 |
| Equipment | |||
| Agilent AdvanceBio 올리고뉴클레오티드 C18 컬럼, 4.6 x 150 mm, 2.7 μ m | 653950-702 | 올리고뉴클레오티드 제제 | |
| Barnstead 나노순수 정제 시스템 | Thermo Fisher | 물 | |
| CFI Apo 100× NA 1.49 대물 | Nikon | 현미경 Cy5 | |
| 큐브 | CHROMA | 현미경 | |
| 진화 전자 증식 전하 결합 장치(EMCCD) | 광도 | 현미경 고성능 | |
| 액체 크로마토그래 | 애질런트 1100 | 올리고뉴클레오티드 제제 | |
| Intensilight epifluorescence source | Nikon | 현미경 매트릭스 | |
| 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석기(MALDI-TOF-MS) | Voyager STR | 올리고뉴클레오티드 제제 | |
| Nanodrop 2000 UV-Vis 분광 광도계 | Thermo Fisher | 올리고뉴클레오티드 제제 | |
| Nikon Eclipse Ti 도립 현미경 | Nikon | 현미경 | |
| Nikon Perfect Focus System | Nikon | 현미경 NIS | |
| 요소 소프트웨어 | Nikon | 현미경 | |
| 쿼드 밴드 TIRF 405/488/561/647 큐브 | CHROMA | 현미경 RICM | |
| 큐브 | CHROMA | 현미경 | |
| TIRF 발사기 488nm(50mW), 561nm(50mW) 및 640nm | 코히런트 | 현미경 | |
| TRITC 큐브 | CHROMA | 현미경 | |
| oligo 이름 | 5' 변형 / 3' 변형 | 시퀀스 (5' to 3') | 사용 |
| >15mer 아민 잠금 스트랜드 | 5' 변형: 변형 없음 3' 변형: /3AmMO/ | AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | 잠금 실시간 장력 신호 |
| 15mer Atto647N 잠금 스트랜드 | 5' 수정: Atto647N 3' 수정: /3AmMO/ | AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | 잠금 실시간 장력 신호 |
| 15mer 비형광 잠금 스트랜드 | 5' 수정: 수정 없음 3' 수정: 수정 없음 | 정량 분석을 위한 실시간 장력 신호 | A AAA AAC ATT TAT AC |
| 4.7 pN 헤어핀 스트랜드 | 5' 수정: 수정 없음 3' 수정: 수정 없음 | GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC | 헤어핀 프로브 |
| 아민 리간드 스트랜드 | 5' 개질: /5AmMC6/ 3' 개질: /3Bio/ | CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | 헤어핀 프로브 |
| BHQ2 앵커 스트랜드 | 5' 수정: /5ThiolMC6-D/ 3' 수정: /3BHQ_2/ | TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT | 헤어핀 프로브 |
| Cy3B 리간드 스트랜드 | 5' 개질: Cy3B 3' 개질: /3Bio/ | CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | 헤어핀 프로브 |
| 잠금 해제 스트랜드 | 5' 수정: 수정 없음 3' 수정: 수정 없음 | TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C | 누적 장력 신호 잠금 해제 |
참고문헌
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).
- Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
