방법 논문

성인 얼룩말 피시의 부분 간 절제술

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DOI:

10.3791/62349

⸱

2021년 4월 4일

 , 
1Harvard Medical School, 2Brigham and Women’s Hospital, 3Massachusetts General Hospital

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 간 재생의 연구를 가능하게 하기 위하여 성인 얼룩말물고기에 있는 간의 복부 엽을 제거하기 위한 절차를 기술합니다.

초록

간 부전은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나이며, 만성 간 질환으로 인한 사망률은 미국에서 급격히 증가하고 있습니다. 건강한 간은 독성 손상에서 재생할 수 있지만, 고급 간 질환에서, 재생 간 자연 능력이 손상된다. Zebrafish는 재생을 연구하기위한 강력한 실험 시스템으로 부상했습니다. 그들은 부분 간 절제술에서 간 재생을 연구하기위한 이상적인 모델입니다, 간 의 일부가 수술로 제거되는 직접 임상 관련성을 가진 절차, 그대로 나머지를 떠나. 부분 간 절제술에 대한 표준 프로토콜은 없습니다. 이 모델을 사용한 이전 연구는 약간 다른 프로토콜을 사용하고 이질적인 결과를 보고했습니다. 여기에 설명된 것은 성인 얼룩말피에서 부분 적인 간 절제술을 수행하기위한 효율적이고 재현 가능한 프로토콜입니다. 우리는 제브라피쉬가 절제된 로브의 상형 재생이 가능한지 보여주기 위해 이 기술을 사용합니다. 이 프로토콜은 제브라피시의 간 재생에 필요한 메커니즘을 더 심문하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

인간에서 고체 기관 중, 간은 재생 할 수있는 유일한기관이다 1. 이것은 중요 한, 간 필수 장기, 주요 신진 대사 기능에 대 한 책임, 에너지 저장, 혈액 해독, 혈 장 단백질의 분 비, 그리고 담 즙 생산2. 독성 또는 염증 성 손상으로 인해 손실 된 간구는 주로 나머지 간세포1의분할을 통해 대체됩니다. 간 재생을 연구하기위한 하나의 고전적인 실험 모델은 부분 간 절제술이며, 간의 개별 엽을 제거하여 나머지 로브를 그대로남겨 둡니다 3. 이 절차는 처음에 간 질량의 대략 2/3이 제거되는 쥐에서 개발되었습니다. 포유류의 부분 적인 간 절제술 후, 보상 재생은 간이 초기 질량을 회복 할 때까지 나머지 엽에서 발생합니다. 특히, 포유류 간은 누락 된 엽을 대체하지 않습니다.

제브라피쉬(다리오리리오)는성인 장기 재생4를연구하기 위한 가기관 모델을 나타낸다. 제브라피쉬 간은 포유류 간과 구조적으로 다르지만 동일한 세포 유형으로 구성되며 포유류2와동일한 기능을 제공합니다. 그것은 3 개의 엽으로 구성 되며, 두 개의 등산 엽과 내장을 따라 평평 하 게 단일 복부 엽. 부분 간 절제술은 이전에 재생의 정확한 모드에 관해서는 상반되는 계정과 함께, 제브라피시에서 수행되었습니다. 전형적으로, 1/3 부분 간 절제술은 전체 복부 엽의 제거에 의해 수행된다. 초기 보고서는 복부 엽의 제거 후, 그것은 완전히 주 내에 재생 되었다 지적5,6,7,포유류 간반대로, 제브라피시 간 은 상형 재생 할 수 있음을 시사. 후속 연구는 복부 엽의 제거가 누락 된 복부 엽의 재생보다는 등쪽 엽에서 보상 재생을 초래하고 궁극적으로 주8,9이내에 간 질량의 회복을 초래했다는 것을 입증했다. 복부 엽의 절제술에 따른 등산 엽의 전사 프로파일링은 보상재생(10)과관련된 중요한 변화를 드러냈다. 간 재생 모드가 부상의 정도에 따라 다를 수 있음을 감안할 때8,우리는 결과에서 불일치가 연구 그룹 사이의 부분 적인 간 절제술 프로토콜의 기술적 변화에 기인 할 수 있다고 추측.

이 프로토콜은 복부 엽을 제거하여 성인 얼룩말에 1/3 부분 간 절제술을 수행하는 절차를 설명합니다. 이 기술은 간 재생의 메커니즘을 평가하는 데 유용 할 것입니다.

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프로토콜

제브라피쉬는 표준 절차에 따라 사육되었습니다. 실험은 브리검 과 여성 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (2016N000405)에 의해 승인되었다. 성인 얼룩말물고기는 프로토콜이 시작되기 전에 24 시간 동안 금식되었습니다. 시스템 물은 수생 시설에서 제브라피시 하우징 탱크의 물을 말합니다.

1. 준비 및 마취

  1. 시스템 물에 0.016% 트리카인 용액을 준비하십시오.
    주의: 트리카인은 눈, 피부 또는 호흡기와 접촉하면 자극제입니다.
  2. 해부 프로토콜 동안 마취 된 얼룩말 물고기를 보유하기 위해 스폰지를 준비합니다. 전체 스폰지를 분기로 자릅니다. 면도날을 사용하여 스폰지 분기의 긴 축과 평행하게 실행되는 얇은 스폰지 쐐기를 제거합니다.
    1. 슬릿은 성인 물고기를 수용 할 수있을만큼 길어야합니다 (이것은 물고기의 다른 크기마다 다릅니다). 예를 들어, 성인 물고기의 길이가 35mm인 경우 슬릿 길이는 20mm여야 합니다. 머리와 몸은 스폰지에 아늑하게 유지되지만 꼬리는 스폰지(그림 1B)의가장자리를 지나 실행됩니다.
  3. 스폰지를 0.016% 트리카인 용액으로 담그세요.
  4. 성인 얼룩말 피쉬 (남성 또는 여성) 0.016 % 트리카인 용액의 625 mL에 놓습니다.
  5. 6 분 동안 또는 물고기가 만지지 않습니다 때까지 배양.
  6. 집게를 사용하여 트리카인 탱크에서 물고기를 조심스럽게 제거하고 물고기 복부 면을 스폰지(그림 1A - B)의홈에 올려 놓습니다.
  7. 스폰지를 하향식 조명으로 해부하는 현미경 아래에 놓습니다.

2. 수술

  1. 미세 한 집게를 사용 하 여, 피부를 꼬집어 내측, 그냥 후방 심장(그림 1B).
  2. 스프링로드 가위를 사용하여 집게 아래에 컷을 만들어 체적구멍(도 1C - D)에구멍을 만듭니다. 심장이나 주요 혈관을 다치게하지 않도록주의하십시오, 이것은 증가 사망률귀착될 것이기 때문에.
  3. 스프링 로드 가위를 사용하여 복부를 따라 3-4mm 절개를 하고 절개가 골반 지느러미에 도착할 때까지 후방으로 처리합니다(도1D - E). 이 시점에서, 간의 복부 엽절을 통해 볼 수 있다.
  4. 한 손으로 스폰지의 측면을 짜서 내장 장기를 신체 구멍에서 강제로 내쫓습니다. 간의 복부 엽은 장의 상단에 볼 수 있습니다(그림 1F,2A-B). 간은 황금 갈색 장 위에 퍼지는 분홍색 또는 주황색 구조로 나타납니다. 이 시점에서 가짜 컨트롤로 지정된 동물을 회수합니다.
  5. 두 개의 tines가 만지고 있도록 미세 한 집게를 짜내. 스폰지에 압력을 유지하면서, 간과 장 사이에 미세 포셉의 타인을 밀어(도 1G). 이 증가 사망률귀착될 것이기 때문에, 창자를 펑크하지 않도록주의하십시오.
  6. 타인이 서로 멀리 이동하도록 천천히 집게에 압력을 완화(그림 1H). 이 슬라이딩 동작은 복부 엽과내장(도 2B)사이의 수많은 포털 정맥 부착물을 분리하고 복부 엽을 깨끗하게 제거할 필요가 있다. 간과 장 사이의 모든 포털 연결이 끊어질 때까지이 과정을 반복하십시오.
  7. 미세 포셉을 사용하여 장으로부터 복부 엽을 다시 껍질을 벗기고 간 의 나머지 부분에서 없는 복부 엽을 자른다(도1I).
  8. 이 절차는 1/3 부분 간절제술(그림 1J)을초래합니다.

3. 복구

  1. 조심스럽게 스폰지에서 물고기를 제거하고 시스템 물 탱크에 배치합니다.
  2. 물고기가 스스로 수영 할 때까지 몇 분 동안 아가미 위에 물을 파이펫 시스템(그림 1K).
  3. 물고기를 2-4시간 동안 모니터링한 후 다시 시스템에 배치합니다. 수술 후 24시간 동안 생선을 먹이지 마십시오.
  4. 실험 기간 동안 매일 물고기를 모니터링합니다.
  5. 시간이 지남에 따라, 바디 벽의 절개는 봉합사(도 1L,2C)에대한 필요없이 자연스럽게 치유됩니다.

4. 장 길이 분석에 대한 복부 엽

  1. 모든 안구 운동이 중단 될 때까지 얼음 물에서 10 분 동안 분석을 위해 운명 모든 동물을 안락사.
  2. 얼음 물에서 물고기를 제거하고 스폰지의 홈에 복부 측면을 배치합니다.
  3. 스프링으로 된 가위를 사용하여 심장의 전방 후방 위치에서 복부 바디 월을 절개합니다. 그런 다음 첫 번째 절개에서 골반 지느러미까지 전방 후방 축을 따라 실행되는 두 개의 절개를 더 합니다. (그림2A).
  4. 내장 장기를 드러내기 위해 피부와 근육을 다시 껍질을 벗깁니다(그림2A).
  5. 상피 현미경을 사용하여 내장 기관의 밝은 필드 및 형광 심상을 취득합니다. 이 시야 필드에는 복부 엽이 절제된 영역이 포함됩니다. 동물은 분석 전에 안락사되기 때문에, 분석의 이 종류는 동일 물고기의 장기 화상 진찰을 배제합니다.

5. 간대 체중 비율 분석

  1. 모든 안구 운동이 중단 될 때까지 얼음 물에서 10 분 동안 분석을 위해 운명 모든 동물을 안락사.
  2. 물고기를 50mL 원물 튜브에 놓습니다.
  3. 1x PBS에 4% 파라포름알데히드의 25mL, 튜브에 0.3% 트위엔을 넣습니다.
    주의: 포름알데히드는 독성이 있으며 포름알데히드를 함유한 솔루션은 항상 화학 적 후드로 처리되어야 합니다.
  4. 4 °C에서 48 h에 대한 nutate.
  5. 1x PBS에서 10분, 0.3% 트위엔으로 10분 동안 4번의 세서스를 수행합니다.
  6. 집게로 물고기를 검색하고 종이 타월에 마른 얼룩.
  7. 전체 물고기의 무게를 기록합니다.
  8. 스프링으로 된 가위를 사용하여 심장의 전방 후방 위치에서 복부 바디 월을 절개합니다. 그런 다음 첫 번째 절개에서 골반 지느러미까지 전방 후방 축을 따라 실행되는 두 개의 절개를 더 만듭니다. (그림2A).
  9. 내장 장기를 드러내기 위해 피부와 근육을 다시 껍질을 벗깁니다(그림2A).
  10. 상피 성화 현미경을 사용하여 간 밝은 필드 이미지를 습득하십시오.
  11. 간을 해부하고, 간 조각을 계량 보트에 놓습니다.
  12. 간 무게를 기록합니다.

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결과

성인 제브라피시 간의 재생 잠재력을 검사하기 위해 성인 제브라피시(ZEBRAfish)에서 부분 적인 간 절제술(PHX)을 수행했습니다. 일반적으로 1.5~2.5세에 이르는 대형 성인(길이 30~40mm)이 선택되었다. 개별 실험 내에서, 동물은 동일한 탱크에서 선택되었고, 나이와 크기 일치하였다. 적절한 제어로, 우리는 동물이 마취되고 복부 바디 벽에 큰 절개를 받았지만 조직을 제거하지 않고 회복된 가짜 수술을 이용했습니다. 가짜 컨트롤에 대한 생존율은 남성과 여성 얼룩말 피시 모두에 대한 90 %-100 %에서 범위. PHX 동물의 생존율은 남성 제브라피시의 경우 60%-75%, 여성 제브라피시의 경우 60%-90%로, 수술 후 처음 24시간 동안 모든 사망자가 발생했습니다.

PHX 다음 간 회복을 정량화하기 위한 금 본위제는 간대 체중 비율 또는 LBR이다. 이 분석은 포유류11 및 제브라피시 모델 모두에서 간 질량 회복의 측정 모두...

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토론

간 재생을 위한 제브라피시와 포유류 모형 사이 해부학적인 다름은 간 절제술에 유일한 도전을 제시합니다. 제브라피시의 간은 심장과 창자에 가깝습니다. 실수로 어느 장기를 손상 증가 사망률에 결과. 제브라피시 간은 캡슐화되지 않아 장과 분리하기가 더 어려워지다. 간은 포털 정맥을 통해 창자에서 영양이 풍부한 혈액을 받습니다. 포유류에서, 창자를 떠나는 정맥은 간12로들어갈 때 분할하는 1 차적인 포털 정맥에 수렴합니다. 대조적으로, 제브라피쉬 간은 장에서 간으로 직접 이동하는 일련의 작은 혈관으로부터 포털 순환을받는다(도 2B). 따라서, 장의 각 엽은 장 위에 평평하게 되어, 이러한 혈관에 의해 장에 단단히 부착된다. 포털 정맥을 먼저 분리하지 않고 복부 엽을 제거하려고 하면 종종 불완전한 절제술(데이터가 표시되지 않음)이 발생할 수 있습니다. 일부 초기 프로토콜은 이러한 포털 첨부 파일5,<...

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공개 사항

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

I.M.O.는 NIAAA (F32A027135)에 의해 지원됩니다. W.G.는 R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870, 암 연구의 우수성을 위한 클라우디아 아담스 바 프로그램에 의해 지원됩니다. W.G.는 생물 의학 과학분야의 퓨 학자입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
16% 파라포름알데히드 수용액, EM 등급전자 현미경 과학15700
50mL Falcon 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 멸균코닝352098
AS 82/220.R2 PLUS 분석 저울Bay State Scale & 시스템, INC.WL-104-1051
Dumont #55 집게정밀 과학 도구11295-51
EMS Kuehne 커버 유리/표본 집게전자 현미경 과학72997-07
에피 형광 현미경ZeissDiscovery.V8
마스터탑 셀룰로오스 클리닝 스크럽 스폰지아마존B07CBSM53Z
PBS10X 액체 콩크 4LEMD Millipore6505-4L
초극세 마이크로 가위, 3 1/4" 스트레이트생물 의학 연구 기기11-1020
트리카인 메탄설포네이SyndelTRIC-M-GR-0010
트윈 20, 피셔 바이오시약Fischer ScientificBP337-500
트

참고문헌

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  3. Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
  4. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
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  11. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).
  12. Grisham, J. W. Organizational principles of the liver. The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).

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