방법 논문

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

DOI:

10.3791/62391

⸱

2021년 3월 31일

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Medicine, Yale University School of Medicine, 4Department of Genetics, Yale University School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 것은 약 1 주일 내에 인간 다 능성 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화를위한 간단한 프로토콜이다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

혈관은 신체의 모든 조직에 편재하게 분포되어 있으며 다양한 기능을 수행합니다. 따라서 인간 만능 줄기 세포에서 혈관 내강을 감싸는 성숙한 혈관 내피 세포를 유도하는 것은 다양한 조직 공학 및 재생 응용 분야에 중요합니다. 생체 내에서 원시 내피 세포는 중배엽 계통에서 파생되며 동맥, 정맥, 모세 혈관, 혈구 및 림프를 포함한 특정 하위 유형에 대해 지정됩니다. 혈구 내피 세포는 발달 과정에서 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하여 평생 동안 모든 혈통을 생성하기 때문에 특히 중요합니다. 따라서, 시험관 내에서 혈구 내피 세포를 생성하는 시스템을 만드는 것은 내피에서 조혈로의 전이를 연구할 기회를 제공할 것이며, 인간 혈액 제제의 생체외 생산 및 인간 기증자에 대한 의존도 감소로 이어질 수 있다. 전구 및 원시 내피 세포의 유도를 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 인간 줄기 세포로부터 잘 특성화된 혈구 내피 세포의 생성은 설명되지 않았습니다. 여기에서는 약 1 주일 만에 인간 배아 줄기 세포로부터 조혈 내피 세포를 유도하는 방법을 제시합니다 : GSK3β 억제제 (CHIR99021)에 반응하여 형성된 원시 줄무늬 세포를 이용한 분화 프로토콜, bFGF에 의해 매개되는 중배엽 계통 유도, BMP4 및 VEGF-A에 의해 촉진 된 원시 내피 세포 발달, 마지막으로 레티노 산에 의해 유도 된 혈구 내피 세포 사양. 이 프로토콜은 분자 조절 및 내피에서 조혈로의 전이를 더 이해하는 데 사용할 수 있는 잘 정의된 혈구 내피 세포 집단을 생성하며, 이는 다운스트림 치료 응용 분야에 적용될 가능성이 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

내피 세포(EC)는 인체 전체와 조작된 조직에서 여러 기능을 수행하는 이질적인 세포 집단입니다. 다른 세포 유형(즉, 심근세포1, 조골세포2)을 지지하고 조절하는 것 외에도, 이러한 기능에는 혈액과 조직 사이에 선택적 장벽을 형성하고 조직 형성을 돕는것3이 포함됩니다. 정상적인 발달 과정에서 성숙한 EC를 차별화하려면 다양한 신호 경로가 필요합니다. 원시 EC는 중배엽 전구 세포에서 파생 된 다음 성숙한 동맥, 정맥, 모세 혈관 및 림프 표현형으로 지정됩니다4. 또한, 배아 외 난황낭 및 배아 대동맥-생식선-메소네프로스(AGM) 영역에 있는 EC의 작은 하위 집합도 조혈성 EC가 되도록 지정되며, 이는 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)를 생성하여 태아 간 및 태아 골수로 이동하여 출생 후에도남아 평생 동안 모든 유형의 혈액 세포를 생성합니다4. 다양한 범위의 EC 표현형은 모든 조직 발달 및 유지에 필수적입니다.

따라서 EC와 그 파생물은 인간 발달 및/또는 질병의 모델링 및 해명 메커니즘뿐만 아니라 재생 의학 및 조직공학 응용 5,6,7,8을 목표로 하는 연구의 중요한 구성 요소입니다. 그러나 이러한 유형의 연구에 대한 주요 한계는 필요한 양에서 1 차 인간 EC의 가용성이 부족하다는 것입니다. 대부분의 치료 응용 프로그램에 최소 3 x 108 EC가 필요한 것으로 추정됩니다6. 이 문제를 해결하기 위해 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)의 사용이 다양한 혈통 잠재력과 많은 수의 자손을 생성 할 수있는 능력으로 인해 제안되었습니다 6,9.

실제로, hESC 또는 hiPSC에서 유래 한 세포의 유용성은 질병 모델링 및 약물 스크리닝10,11,12에 초점을 맞춘 여러 연구에서 입증되었습니다. OOC(Organ-on-a-Chip) 기술은 세포와 조직을 3차원 스캐폴드로 통합하여 인체의 생리학을 보다 충실하게 요약하는 데 사용되었습니다. 또한, 다수의 개별 OOC(소위 바디- 또는 휴먼-온-어칩, BOC/HOC)의 연결은 미세유체공학을 통해 달성되어 관심 기관(13,14,15) 간의 혼선을 허용할 수 있다. 혈관구조와 같은지지 조직은 OOC 및 BOC / HOC의 중요한 구성 요소입니다. 혈관 구조를 통합하면 조직 전체에 영양분, 산소 및 파라 크린 인자를 운반 할 수 있으므로 필요한 조직 특이 적 미세 환경 3,12을 촉진 할 수 있습니다. 따라서 동맥, 정맥, 림프 및 hemogenic EC와 같은 성숙한 인간 EC를 유도하는 방법은 이러한 조직 공학 접근법을 발전시키는 데 중요합니다.

hESC 또는 hiPSC 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26에서 인간 원시 또는 전구 EC를 파생하는 단계를 자세히 설명하는 여러 프로토콜이 게시되었습니다. . 이러한 프로토콜의 대부분은 배아체(EB) 형성 또는 기질 세포의 쥐 영양층이 있는 ESC/iPSC의 공동 배양에 의존합니다. 이러한 전략은 낮은 EC 수율 및/또는 쥐 세포로 인한 인간 EC의 오염으로 인해 어렵고 시간이 많이 소요되는 경향이 있습니다. 기질 세포를 사용하지 않고 2D 배양에만 의존하는 프로토콜은 종종 긴 유도가 필요하거나, 유도를 위해 성장 인자 및/또는 억제제의 복잡한 조합을 사용하거나, 세포 분리 후 확장 기간이 연장되거나, 이러한 요인의 조합이 필요합니다. 생체 내에서 성숙한 EC 유형의 유도와 관련된 신호 경로 및 요인에 대한 지식을 발전시키면 간단하고 강력한 체외 차별화 프로토콜의 토대를 마련할 수 있습니다.

이전에는 개발 중에 쥐 동맥 및 호모닉 EC의 사양에서 각각 Notch 및 Retinoic Acid (RA) 신호 전달 경로의 주요 역할이 확인되었습니다. Notch 신호 전달 경로는 동맥 EC 표현형의 사양 및 유지에 여러 역할을 합니다. 쥐 망막 혈관화 모델을 사용한 연구는 유체 전단 응력이 Notch-Cx37-p27 신호 축을 유도하여 G1 세포 주기 정지를 촉진하는 경로를 식별하여 동맥 EC 사양27을 가능하게 했습니다. 세포주기 상태는 세포가 유전자 발현 및 표현형 변화를 유도 할 수있는 특정 신호를 수용하는 뚜렷한 기회 창을 제공함으로써 세포 운명 결정에 역할을하는 것으로 가정되었습니다28. 이 노치 매개 G1 정지는 에프린B2, Cx40, DLL4, 노치1 및 노치 4를 포함한 동맥 EC에서 풍부한 유전자의 발현을 가능하게 했습니다(29,30에서 검토됨). 또한 혈구 EC 사양은 RA 신호 전달31,32를 통해 생체 내에서 촉진되는 것으로 나타났습니다. 추가 연구에서는 RA 신호전달의 하류, c-Kit 및 Notch의 발현이 p27을 상향조절하여 뮤린 난황낭 및 AGM33에서 혈구 사양을 가능하게 한다는 것을 확인했습니다. 뮤린 헤모닉 EC는 내피 (즉, CD31, KDR) 및 조혈 (즉, c-Kit, CD34) 마커4 둘 다의 발현에 의해 최소한으로 확인될 수 있다. 마지막으로, 혈구 EC는 내피에서 조혈로의 전이 (EHT)를 거쳐 HSPC를 형성하며, 이는 모든 혈액 세포 유형 4,34,35를 생성 할 수 있습니다.

최근 연구에서는 이 동일한 신호 계층 구조가 인간 hemogenic EC 사양을 촉진할 수 있는지 여부를 테스트했습니다. 이를 위해 hESC에서 헤모닉 EC를 유도하기 위한 혈청 및 피더가 없는 2D 배양 프로토콜이 개발되었으며, 이러한 헤모닉 EC는 단일 세포 수준에서 CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-로 특성화되었습니다. 이 연구는 또한 FUCCI 리포터 구조체(H9-FUCCI-hESC)36를 발현하는 H9-hESC를 사용하여 다양한 세포 주기 상태를 식별하는 형광 유비퀴틴화 세포 주기 지표(FUCCI) 리포터를 활용했습니다. 이들 세포를 사용한 연구에서, RA는 ECs에서 초기 G1 세포 주기 정지를 촉진하고, 초기 G1 상태는 시험관내37에서 헤모겐 스펙을 가능하게 한다는 것이 입증되었다. 본원에서, 이들 인간 조혈성 내피 세포의 분화를 위한 상세한 프로토콜 및 이들의 정체를 확인하는 분석법이 제공된다. 이 간단한 방법은 인간 혈액 세포 발달 메커니즘에 대한 향후 연구를 위해 EC의 특수 하위 집합을 생성하는 유용한 수단을 제공합니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 시약 및 시약 준비

참고: 시약 목록은 재료 표에 나와 있습니다.

  1. 인간 만능 줄기 세포주를 얻습니다: H1-hESC, H9-푸치-hESC.
    참고: hemogenic EC의 생성은 H1 세포주에서 더 효율적일 수 있습니다.
  2. 매트릭스 단백질 스톡을 준비합니다: 매트릭스 단백질을 사전 냉각된 1.5mL 튜브(얼음 위)에 분취하여 각 튜브에 1mg의 매트릭스 단백질이 포함되도록 합니다. 1mg의 매트릭스 단백질은 2 개의 6 웰 플레이트 (총 12 웰)의 모든 웰을 코팅하기에 충분합니다. 사용 될 때까지 분취량을 -20 ° C에서 보관하십시오.
    참고: 얼음 위 또는 4°C에서 매트릭스 단백질과 관련된 모든 단계를 수행하십시오. 매트릭스 단백질의 동결된 스톡 바이알을 얼음 위에서 밤새 해동시킨다. 해동되면 바이알을 휘저어 내용물이 혼합되도록 합니다. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브를 -20°C에서 최소 1시간 동안 예열하고 분취 직전에 얼음으로 옮깁니다.
  3. 매트릭스 단백질 코팅 플레이트 준비: 매트릭스 단백질 분취량을 4°C의 얼음에서 해동합니다. 얼음 위의 미리 냉각된 원뿔형 튜브에 12.5mL의 얼음처럼 차가운 DMEM:F12를 추가합니다. 사전 냉각된 피펫 팁을 사용하여 1개의 분취량(1mg)의 매트릭스 단백질을 원뿔형 튜브로 옮기고 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 희석된 매트릭스 단백질 1mL를 사전 냉각된 혈청학적 피펫을 사용하여 미리 냉각된 6-웰 플레이트(얼음 위)의 각 웰에 분취한다. 전체 우물이 고르게 코팅되도록 판을 소용돌이 치고 흔든다. 매트릭스 단백질이 고형화될 수 있도록 플레이트를 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다. 플레이트를 파라필름으로 감싸고 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오. 매트릭스 단백질 코팅 플레이트는 준비 후 2주 이내에 사용하십시오.
    참고: 매트릭스 단백질로 코팅된 6웰 플레이트를 사용하여 세포의 일상적인 계대와 원시 및 조수 내피 세포로의 분화를 수행하십시오. 얼음 위에서 모든 단계를 수행하십시오. 사용하기 전에 6웰 플레이트, 피펫 팁, 혈청학적 피펫 및 원뿔형 튜브를 -20°C에서 최소 1시간 동안 사전 냉각합니다. 사용할 준비가 되면 이러한 항목을 얼음으로 옮깁니다.
  4. 만능줄기세포 분화배지 100mL에 PFHM 5mL를 첨가하여 염기 분화배지를 준비한다. 4 °C에서 보관하십시오.
  5. 0.1 g BSA를 100 mL PBS에 용해시켜 0.1% BSA-PBS를 제조한다. 필터는 0.22 μm 필터를 통과시켜 BSA-PBS를 살균하고 4 °C에서 보관합니다.
  6. 스톡 HCl(12M) 1:2,400을 물로 희석하여 5mM HCl을 준비합니다. NaOH를 사용하여 pH를 3.0으로 조정합니다. 필터는 0.22 μm 필터를 통과시켜 용액을 멸균하고 4°C에서 보관한다.
  7. bFGF, BMP4, VEGF-A, 레티노산(RA) 및 DLL4 스톡을 준비합니다.
    1. bFGF: 동결건조된 분말을 0.1% BSA-PBS에서 100μg/mL로 재구성합니다. 분취량을 -20°C에서 보관한다. 준비 후 3개월 이내에 bFGF 재고를 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
    2. BMP4: 동결건조된 분말을 5mM HCl, pH 3.0에서 1mg/mL로 재구성합니다. 0.1% BSA-PBS에서 50μg/mL로 추가로 희석합니다. 분취량을 -20°C에서 보관한다. 준비 후 4개월 이내에 BMP3 주식을 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
    3. VEGF-A: 동결건조된 분말을dH2O중 1mg/mL로 재구성한다. 0.1% BSA-PBS에서 100μg/mL로 추가로 희석합니다. 분취량을 -20°C에서 보관한다. 준비 후 3 개월 이내에 VEGF-A 주식을 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
    4. RA: 동결건조된 분말을 DMSO 중에서 100 mM으로 재구성한다. 분취량을 -80°C에서 보관한다. 준비 후 1개월 이내에 RA 재고를 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
      알림: RA 주식을 빛으로부터 보호하십시오.
    5. DLL4: 동결건조된 분말을 PBS에서 1mg/mL로 재구성합니다. 분취량을 -20°C에서 보관한다. 준비 후 12개월 이내에 DLL4 재고를 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
  8. 최종 농도가 각각 25ng/mL 및 50ng/mL가 되도록 염기 분화 배지(단계 1.4)에서 VEGF-A 및 BMP4를 희석하여 사용 직전에 내피세포 분화 배지를 준비합니다.
  9. DMSO 중의 100 mM 스톡 1:1,000을 100 μM로 희석함으로써 사용 직전에 작업 RA를 준비한다.
    알림: 작동하는 RA를 빛으로부터 보호하십시오.
  10. 최종 농도가 각각 25ng/mL, 50ng/mL 및 0.5μM이 되도록 염기 분화 배지(단계 1.4)에서 VEGF-A, BMP4 및 작동 RA를 희석하여(단계 1.4) 사용 직전에 조혈 내피 세포 분화 배지를 준비합니다.
  11. 10% FBS를 함유한 HBSS를 만들어 항체 염색 완충액을 준비하고 1:500 희석 항균 시약으로 보충합니다. 멸균 여과액을 즉시 사용하십시오.
  12. 1% FBS가 포함된 HBSS를 만들어 세포 분류 완충액을 준비하고 1:500 희석 항균 시약으로 보충합니다. 멸균 여과액을 즉시 사용하십시오.
  13. 동결건조된 피브로넥틴 5mg에 멸균수 5mL를 추가하여 1mg/mL 피브로넥틴 스톡을 준비합니다. 분취량을 -20°C에서 보관한다. 동결건조된 제품 라벨의 만료일 이전에 피브로넥틴 스톡을 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
  14. 피브로넥틴으로 코팅 된 35mm 접시를 준비하십시오. 피브로넥틴 스톡(1 mg/mL)을 멸균 수에서 4 μg/mL로 희석합니다. 이 피브로넥틴 코팅 용액 1mL를 각 접시에 넣고 37°C에서 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 코팅 직후 접시를 사용하십시오.
  15. 제조업체의 지침에 따라 3 또는 4mL의 메틸셀룰로오스 기반 배지 분취량을 준비합니다. 사용 될 때까지 분취량을 -20 ° C에서 보관하십시오. 재고 제품 라벨에 표시된 만료일 전에 메틸셀룰로오스 기반 중간 분취량을 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
  16. 재조합 인간 DLL4 스톡을 PBS에서 최종 농도 10μg/mL로 희석하여 DLL4 코팅 용액을 준비합니다.
  17. 내피 세포 성장 배지를 제조자의 지시에 따라 준비하고 보관하십시오.
  18. 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 만들어 유세포 분석 완충액을 준비한다. 멸균 완충액을 여과하고 사용 시까지 4°C에서 보관한다.

2. hESC의 세포 배양 및 계대 배양

  1. 매트릭스 단백질 코팅 플레이트, 줄기 세포 성장 배지 및 DMEM:F12를 실온으로 예열합니다.
  2. hESC 세포주를 37°C, 5%CO2 인큐베이터의 매트릭스 단백질이 코팅된 6웰 플레이트의 줄기세포 성장 배지(2mL/웰)에서 성장시킵니다.
  3. 매일 세포를 확인하고 필요에 따라 p200 피펫 팁을 사용하여 플레이트에서 부드럽게 긁어내어 분화된 세포를 제거합니다.
    참고: 분화된 세포는 콜로니 주변에 나타납니다. 줄기세포 성장 배지 제품 매뉴얼에서 배양된 분화된 세포의 예를 참조하십시오.
  4. 세포가 70%-80% 컨플루언스에 도달하면 통과시킵니다. 세포를 계대하려면 다음 단계를 수행하십시오.
    참고: 분화가 증가하면 70%-80% 컨플루언시에 도달하기 전에 세포를 분할해야 합니다.
    1. 세포 위의 배지를 제거하고 웰당 1mL DMEM:F12로 부드럽게 세척합니다.
    2. 웰당 DMEM:F12 1mL를 추가합니다.
    3. 웰당 160 μL/mL의 디스파제를 첨가하고, 세포를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 45분 동안 배양한다.
    4. Dispase 배양 후 웰당 1mL의 DMEM:F12를 추가하고 부드럽게 피펫하여 세포를 들어 올립니다.
      알림: 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리하지 마십시오. 세포를 작은 덩어리로 통과시킵니다.
    5. 세포를 12mL의 DMEM:F12가 들어 있는 원추형 튜브로 옮기고 세포가 중력에 의해 침전되도록 합니다(~5-10분).
    6. 상청액을 제거하고 들어 올린 세포의 웰당 줄기 세포 성장 배지 0.5mL에 펠릿을 부드럽게 재현탁하여 작은 세포 덩어리를 얻습니다.
      알림: 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리하지 마십시오. 세포를 작은 덩어리로 통과시킵니다.
    7. 준비된 매트릭스 단백질 코팅 플레이트의 웰에서 매트릭스 단백질 코팅 용액을 흡입하고 웰당 줄기세포 성장 배지 1.5mL를 추가합니다.
    8. 원하는 부피의 재현탁 세포(단계 2.4.6)를 준비된 매트릭스 단백질 코팅된 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
    9. 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 24 시간마다 배지를 신선한 줄기 세포 성장 배지로 교체하십시오.

3. hESCs의 원시 내피 세포로의 분화

  1. -1일: 상기 섹션 2에 기재된 바와 같이 세포를 배양하고 계대배양한다. 세포를 (단계 2.4.6) 평방 센티미터 당 약 2 덩어리의 밀도로 작은 덩어리 (~ 50 μm)로 시드합니다38.
    참고: 시드 밀도를 평가하고 필요한 경우 경험적으로 구체화합니다.
  2. 0일차: 세포를 파종한 후 24시간 후에 각 웰에서 배지를 흡인하고 웰당 1mL DMEM:F12로 세포를 부드럽게 세척합니다. 5μM GSK3i(CHIR99021, 신선하게 첨가)를 포함하는 염기 분화 배지 1mL를 각 웰에 추가하고 24시간(37°C, 5%CO2) 동안 배양합니다.
    알림: 모든 세척 단계에서 표시된 세척 매체를 플레이트 웰 벽에 피펫팅하여 플레이트에 천천히 추가합니다. 우물의 전체 표면이 세척 매체로 덮이도록 플레이트를 부드럽게 소용돌이 치십시오. 세척 매체가 6시 위치에 풀링되도록 플레이트를 약간 기울이고 세척 매체를 조심스럽게 흡입합니다.
  3. 1일차: 각 웰에서 배지를 흡입하고 웰당 1mL DMEM:F12로 세포를 부드럽게 세척합니다. 50ng/mL bFGF(냉동 재고에서 신선 첨가, 1:2,000 첨가)를 포함하는 염기 분화 배지 1mL를 각 웰에 추가하고 24시간(37°C, 5%CO2)에서 배양합니다.
  4. 2일차: 각 웰에서 배지를 흡인하고 웰당 1mL의 DMEM:F12로 세포를 부드럽게 세척합니다. 내피 세포 분화 배지 1mL를 각 웰에 추가하고 24시간 배양합니다(37°C, 5%CO2).
  5. 3일차: 세포 위의 배지를 웰당 새로 준비된 내피 세포 분화 배지 1mL로 교체하고 24시간(37°C, 5%CO2)에서 배양합니다.
  6. 4일차: 세포 위의 배지를 웰당 새로 준비된 내피 세포 분화 배지 1mL로 교체하고 24시간(37°C, 5%CO2)에서 배양합니다.
  7. 5일차: FACS는 세포를 정제하여 EC 표현형을 평가하거나(섹션 4-5) 배양을 유지하고 조혈 내피 세포로 분화합니다(섹션 6).

4. 원시 내피 세포의 FACS 정제

  1. 세포 위의 배지를 흡인하고 웰당 1mL의 DMEM:F12로 부드럽게 한 번 씻습니다.
  2. 웰당 1mL의 세포 분리 용액을 추가하고 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 또는 세포가 해리될 때까지12 분 동안 세포를 배양합니다.
  3. 해리된 세포를 12mL의 DMEM:F12가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮기고 펠릿을 5분 동안 원심분리하여 1,000 x g로 옮깁니다.
  4. 상청액을 제거하고 펠릿을 12mL의 DMEM:F12에 재현탁하여 세척합니다.
  5. 세포를 5분, 1,000 x g 동안 원심분리하여 펠릿화합니다.
  6. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 빙냉 항체 염색 완충액에 재현탁하고 세포를 계수합니다. 얼음처럼 차가운 항체 염색 완충액을 사용하여 농도를 1 x 105 cells/mL로 조정합니다.
  7. 항체 염색을 위해 세포를 얼음 위의 미세 원심분리 튜브로 고르게 나누고, 각각은 1 x 105 cells/mL에서 최소 600μL 세포를 포함합니다.
    참고: 원시 EC의 염색에는 염색되지 않은 대조군, CD31 단일 항체 대조군, CD45 단일 항체 대조군, CD31 및 CD45 항체가 모두 포함된 샘플의 4개의 세포 튜브가 필요합니다. 항체에 대한 정보는 재료 표에 나와 있습니다.
  8. 세포를 포함하는 튜브에 항체를 적절하게 첨가하고 얼음 위에서 배양하고 30분 동안 빛으로부터 보호합니다.
    1. 염색되지 않은 대조군: 항체를 추가하지 마십시오.
    2. CD31 단일 항체 대조군: CD31 항체만 추가합니다.
    3. CD45 단일 항체 대조군: CD45 항체만 추가합니다.
    4. 샘플: CD31 및 CD45 항체를 모두 추가합니다.
      참고: 샘플의 최종 항체 농도와 형광 접합체는 사용된 특정 항체 및 세포 분류기를 기반으로 최적화되어야 합니다.
  9. 세포를 4°C 탁상 마이크로원심분리기에서 1,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다.
  10. 상청액을 제거하고 600μL의 얼음처럼 차가운 분류 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
  11. 5mL FACS 튜브의 메쉬 필터 캡을 통해 샘플을 변형시키고 즉각적인 FACS를 위해 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 세포를 보관하십시오.
  12. 다음 단계를 수행하여 원시 내피 세포(CD31+ CD45-)를 얻습니다.
    1. CD45 음성 세포 집단 및 게이트(CD45-)를 식별합니다.
    2. (CD45-) 내에서 CD31 양성(CD31+) 세포 집단을 식별하고 세포를 6mL 빙냉 세포 분류 완충액으로 분류합니다. 다운스트림 응용 프로그램에 이러한 셀을 사용합니다(섹션 5 참조).

5. 원시 내피 세포 표현형을 확인하기위한 분석

  1. 6웰 플레이트의 3웰을 1mL/웰 DLL4 코팅 용액으로 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 30분 동안 코팅합니다. 대조군으로 플레이트의 다른 3웰을 1mL/웰 PBS로 모의 코팅합니다.
  2. DLL4 코팅 용액을 PBS 및 흡인하고, 웰당 2 mL의 내피 세포 성장 배지에 25,000개의 분류된 원시 내피 세포 (단계 4.12 참조)를 플레이트팅한다.
  3. 세포를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
  4. 세포 위의 배지를 흡인하고 2mL/웰 PBS로 한 번 세척합니다. qPCR 또는 유동 세포측정법(FUCCI 구축물을 발현하는 세포의 경우)에 의해 세포를 분석한다.
    1. qPCR로 세포를 분석하려면 다음 단계를 수행하십시오.
      1. 세포 위의 액체를 흡인하고 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 추출 키트를 사용하여 세포에서 RNA를 분리합니다.
      2. 제조업체의 프로토콜에 따라 역전사 마스터 믹스로 역전사 반응을 수행합니다.
      3. 제조업체의 프로토콜에 따라 SYBR 그린 마스터 믹스로 qPCR 반응을 수행합니다.
        참고: 사용된 프라이머(EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2)는 표 1에 나열되어 있습니다.
    2. 유동 세포분석에 의해 FUCCI 구축물을 발현하는 세포를 분석하기 위해, 하기 단계를 수행한다.
      1. 세포 위의 액체를 흡입하고 500μL/웰 0.25% 트립신-EDTA를 추가합니다.
      2. 세포를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 들어 올려질 때까지, ~5분 동안 배양한다.
      3. 세포를 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 4°C 미세 원심분리기에서 1,000 x g에서 5분 동안 세포를 펠릿화합니다.
      4. 상청액을 흡인하고 500 μL의 빙냉 유세포 분석 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다.
      5. 즉각적인 유세포 분석을 위해 5mL FACS 튜브의 메쉬 필터 캡을 통해 샘플을 변형시키고 빛으로부터 보호되는 얼음에 세포를 보관합니다.
      6. 초기 G1(색상 없음), 후기 G1(mCherry+/mVenus-), G1/S(mCherry+/mVenus+) 및 S/G2/M(mCherry-/mVenus+)에서 DLL4 대 PBS 대조군에 도말된 세포의 백분율을 분석합니다.

6. hESCs의 혈액 내피 세포로의 분화

참고: 위의 섹션 3.1-3.6에서 설명한 대로 세포를 4일차 원시 EC로 분화합니다.

  1. 5일차: 세포 위의 배지를 흡인하고 웰당 1mL의 DMEM:F12로 세포를 부드럽게 세척합니다. 웰당 새로 준비된 혈구 내피 세포 분화 배지 1mL를 추가하고 24시간(37°C, 5%CO2)에서 배양합니다.
  2. 6일차: 세포 위의 배지를 웰당 새로 준비된 조혈 내피 세포 분화 배지 1mL로 교체하고 24시간(37°C, 5%CO2)에서 배양합니다.
  3. 7일차: 세포 위의 배지를 웰당 새로 준비된 조혈 내피 세포 분화 배지 1mL로 교체하고 24시간(37°C, 5%CO2)에서 배양합니다.
  4. 8일차: FACS는 혈성 내피 세포를 분리합니다(섹션 7 참조).

7. 조혈 내피 세포의 FACS 분리

  1. 위의 섹션 4.1-4.6에서 설명한대로 세포를 들어 올리고 씻습니다.
  2. 항체 염색을 위해 세포를 얼음 위의 미세 원심분리 튜브로 고르게 나누고, 각각은 1 x 105 cells/mL에서 최소 600μL 세포를 포함합니다.
    참고: 헤모닉 EC의 항체 염색에는 염색되지 않은 대조군, CD31 단일 항체 대조군, CD45 단일 항체 대조군, KDR 단일 항체 대조군, c-Kit 단일 항체 대조군, CD34 단일 항체 대조군, VE-cadherin 단일 항체 대조군 및 6개의 항체가 모두 포함된 샘플 등 8개의 세포 튜브가 필요합니다.
    참고: 항체 정보는 재료 표에 나와 있습니다.
  3. 세포를 포함하는 튜브에 항체를 적절하게 첨가하고 얼음 위에서 배양하고 30분 동안 빛으로부터 보호합니다.
    1. 염색되지 않은 대조군: 항체를 추가하지 마십시오.
    2. CD31 단일 항체 대조군: CD31 항체만 추가합니다.
    3. CD45 단일 항체 대조군: CD45 항체만 추가합니다.
    4. KDR 단일 항체 대조군: KDR 항체만 추가합니다.
    5. c-Kit 단일 항체 대조군: c-Kit 항체만 추가합니다.
    6. CD34 단일 항체 대조군: CD34 항체만 추가합니다.
    7. VE-카데린 단일 항체 대조군: VE-카데린 항체만 추가합니다.
    8. 샘플: CD31, CD45, KDR, c-키트, CD34 및 VE-카데린 항체를 추가합니다.
      참고: 샘플의 최종 항체 농도와 형광 접합체는 사용된 특정 항체 및 세포 분류기를 기반으로 최적화되어야 합니다.
  4. 세포를 4°C 미세원심분리기에서 1,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화한다.
  5. 상청액을 제거하고 600μL의 얼음처럼 차가운 분류 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.
  6. 5mL FACS 튜브의 메쉬 필터 캡을 통해 샘플을 변형시키고 즉각적인 FACS를 위해 빛으로부터 보호되는 얼음에 세포를 저장합니다.
  7. 혈성 내피 세포(CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-카데린-CD45-)를 얻으려면 다음 단계를 수행하십시오.
    1. CD45- 세포 집단 및 게이트(CD45-)를 동정한다.
    2. (CD45-) 내에서 CD31+ 세포 집단과 게이트(CD31+)를 식별합니다.
    3. (CD31+) 내에서 VE-카데린- 세포 집단 및 게이트(CDH5-)를 식별합니다.
    4. (CDH5-) 내에서 c-Kit+ 세포 집단과 게이트(KIT+)를 식별합니다.
    5. (KIT+) 내에서 CD34+ 세포 집단과 게이트(CD34+)를 식별합니다.
    6. (CD34+) 내에서 KDR+ 세포를 식별하고 6mL 얼음처럼 차가운 세포 분류 완충액으로 분류합니다. 다운스트림 애플리케이션에서 이러한 셀을 사용합니다(섹션 8 참조).

8. 콜로니 형성 단위 분석

  1. 제조업체의 지침에 따라 메틸셀룰로오스 기반 배지의 분취량을 해동합니다.
    참고: 2개의 샘플에는 1개의 3mL 분취량으로 충분하고 3개의 샘플에는 1개의 4mL 분취량으로 충분합니다.
  2. 단계 7.7에서 수득된 분류된 혈성 내피 세포를 계수한다.
  3. 제조업체의 지침에 따라 각 샘플에 최소 1,000개의 혈성 내피 세포가 포함되도록 각 메틸셀룰로오스 기반 배지 분취량에 추가할 분류된 세포의 부피를 계산합니다.
    참고: 필요에 따라 셀 수를 조정할 수 있습니다.
  4. 계산된 부피의 세포를 메틸셀룰로오스계 배지 분취량에 넣고 완전히 와동시킵니다. 메틸셀룰로오스 기반 배지 배양물을 실온에서 10분 동안 또는 기포가 소멸될 때까지 그대로 두십시오.
  5. 준비된 35mm 접시에서 피브로넥틴 코팅 용액을 흡인합니다. 제조업체의 지침에 따라 35mm 접시당 1mL의 메틸셀룰로오스 기반 배지 배양액을 분주합니다. 접시를 부드럽게 돌려 문화를 고르게 분배하십시오.
  6. 이 35mm 접시와 멸균수로 채워진 두 개의 추가 35mm 접시를 15cm 조직 배양 접시 안에 놓습니다.
  7. 배양물을 37°C, 5%CO2 배양기에서 배양하고, 8일 및 14일에 배양물을 관찰하였다.
    1. 8 일째에 CFU-E 및 BFU-E 콜로니를 계산합니다.
    2. 14일째에 CFU-GM 및 CFU-GEMM 콜로니를 계산합니다.
      참고: 콜로니 유형의 형태학적 식별에 대해서는 메틸셀룰로오스 기반 배지 설명서를 참조하십시오.

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결과

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hESC의 원시 EC 및 호모닉 EC의 사양을 요약한 개략도와 도금 후 24시간 후의 세포의 대표 이미지가 그림 1에 나와 있습니다. 사양에 따라 원시 EC와 호모닉 EC는 각각 5일과 8일에 정제된 FACS입니다. 원시 EC는 CD31+ CD45-로 정의되고 헤모제닉 EC는 CD31+ KDR+ c-키트+ CD34+ VE-카데린-CD45-로 정의됩니다. 원시 EC 및 hemogenic EC 정제를 위한 대표적인 유세포 분석 게이팅 전략이 그림 2에 나와 있습니다. 세포는 정제된 원시 EC를 얻기 위해 초기에 CD45의 음성 발현 및 CD31의 양성 발현을 기반으로 게이트됩니다(그림 2A). 정제된 헤모겐 EC를 얻기...

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토론

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본원에는 뮤린 피더 및 무혈청 2D 배양 시스템(그림 1)을 사용하여 약 1주일 내에 인간 배아 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포를 생산하는 단계가 요약되어 있습니다. 이 프로토콜은 원시 ECs38을 얻기 위해 Sriram et al. (2015) 에 의해 설명 된 방법을 확장합니다. CD31+ CD45-EC의 원시적 특성 및 사양 잠재력은 DLL4 코팅 플레이트에서 이러한 세포를 배양하고 동맥 사양과 일치하는 유전자 발현 변화를 관찰함으로써 입증됩니다(그림 3). 또한, 동맥 정체성의 획득은 후기 G1 세포주기 정지와 관련이 있으며(그림 3), 이는 이전 연구(27)와 일치합니다. 0.5μM RA, 25ng/mL BMP4 및 50ng/mL VEGF...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 NIH 보조금 HL128064 및 U2EB017103에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 추가 지원은 CT Innovations 15-RMB-YALE-04 보조금으로 제공되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15cm 접시Corning430599조직 배양 처리
35mm 접시Corning430165조직 배양 처리
6웰 플레이트Corning3516조직 배양 처리
항균 시약
브랜드 이름: Normocin		Invitrogenant-nr-1
bFGFR& D 시스템233-FB-02550ng/mL에서 사용
BMP4BioLegend59520225ng/mL에서 사용
소 혈청 알부민(BSA)Fisher ScientificBP1600-1
Cell Detatchment Solution
브랜드 이름: Accutase		Stemcell Technologies7920
디메틸 설폭사이드(DMSO)Sigma AldrichD2650-100mL
디스페이스스템셀 기술7913
DLL4R& D 시스템1506-D4/CF재조합 인간; 10 &mu에서 사용; g/mL
DMEM:F12Gibco11320-033
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS)Gibco14190144
내피 세포 성장 배지
브랜드 이름: EGM-2 내피 세포 성장 매체-2 BulletKit (EGM-2)		LonzaCC-3162
FACS 튜브Corning352235폴리스티렌 라운드 바닥(필터 캡
포함)Fetal Bovine Serum (FBS)Gemini Bio100-106
FibronectinThermoFisher Scientific330160154 &mu에서 사용; g/cm2
GSK3i/CHIR99021Stemgent04-0004-0210 mM 재고; 5 &mu에서 사용; M
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14175-095
염산 (HCl)Fisher ScientificA144S-500
매트릭스 단백질 
브랜드 이름: Matrigel		Corning356230성장 인자 감소. 단백질(Matrigel) 농도를 결정하기 위해 로트에 대한 분석 증명서를 참조하십시오. 이 농도는 단백질 1mg을 포함하는 Matrigel의 부피를 계산하는 데 필요합니다.
메틸셀룰로오스 기반 매체
브랜드 이름: MethoCult H4435 Enriched		Stemcell Technologies4435
만능 줄기세포 분화 매체
브랜드 이름: STEMdiff APEL 2		Stemcell Technologies5270
만능 줄기세포: H1, H9, H9-FUCCIWiCellWA09 (H9), WA01 (H1)human; H9-FUCCI는 Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)Gibco12040077
Retinoic AcidSigma AldrichR2625-50mg M
역전사 마스터 믹스
브랜드 이름: iScript 역전사 슈퍼믹스		BioRad1708840
RNA 추출 키트
브랜드 이름: RNeasy Mini Kit		Qiagen74104
수산화나트륨 (NaOH)Fisher ScientificSS255-1
줄기세포 성장 배지
브랜드 이름: mTeSR1		Stemcell Technologies85850
SYBR 그린 마스터 믹스
브랜드 이름 : iTaq Universal SYBR 그린 마스터 믹스		BioRad1725121
Trypsin-EDTAGibco252999560.25 %
VEGF165< / sub> (VEGF-A)PeproTech100-2050 ng / mL
α -CD31-FITCBioLegend3031042 μ g/mL*
α-CD34-퍼시픽 블루바이오레전3435122 μ g/mL*
α-CD45-APC/Cy7BioLegend3040142 μ g/mL*
α-c-Kit-APCBioLegend3132062 μ g/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7BioLegend3599112 μ g/mL*
α-VE-Cadherin-PEBioLegend3485062 μ g/mL*
* 항체 형광 접합체는 사용된 세포 분류기에 따라 최적화해야 합니다. 여기에 제시된 것은 이 연구에서 사용된 최종 농도입니다.
의 Ludovic Vallier 박사 연구실에서 얻었습니다.드

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