자동화된 조직 해부를 통한 디지털 주석은 낮은 종양 함량의 경우에 종양을 농축하는 혁신적인 접근 방식을 제공하며 파라핀 및 냉동 조직 유형 모두에 적응할 수 있습니다. 설명 된 워크 플로는 정확성, 재현성 및 처리량을 향상 시키며 연구 및 임상 설정 모두에 적용될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
낮은 종양 함량 조직에서의 종양 농축은, 방법에 따라 종양 함량이 20% 미만인 조직에서, 차세대 시퀀싱과 같은 많은 다운스트림 분석으로 재현가능하게 양질의 데이터를 생성하기 위해 요구된다. 자동화된 조직 해부(Automated tissue dissection)는 염색되지 않은 슬라이드에 디지털 이미지 주석 오버레이를 사용하여 기존의 매크로 해부 및 시간, 비용 및 전문 지식의 한계를 줄임으로써 이러한 일반적인, 낮은 종양 함량의 조직에서 종양 농축을 자동화하고 개선하는 새로운 방법론입니다. 여기서, 디지털 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 주석은 염색되지 않은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE)에서 직경250μm2 인 블레이드 또는 핵산 추출 및 전체 엑소메 시퀀싱(WES) 전에 자동화된 종양 농축을 위해 두께가 최대 20μm인 신선한 냉동 절편을 사용하여 작은 종양 영역을 표적으로 하는 데 사용됩니다. 자동화된 해부는 핵산 추출을 위해 단일 또는 다중 절편으로부터 낮은 종양 함량 조직에서 주석이 달린 영역을 수확할 수 있다. 또한 광범위한 수확 전후 수집 메트릭을 캡처하는 동시에 정확성, 재현성을 향상시키고 슬라이드를 더 적게 활용하여 처리량을 높일 수 있습니다. 기술된 프로토콜은 종양 함량이 낮은 동물 및/또는 인간 FFPE 또는 신선한 냉동 조직에 대한 자동화된 해부와 함께 디지털 주석을 가능하게 하며, 또한 임상 또는 연구 워크플로우에서 다운스트림 시퀀싱 애플리케이션에 대한 적절성을 높이기 위해 관심 영역 농축에 사용될 수 있다.
서론
차세대 염기서열 분석(NGS)은 환자 치료와 암 연구 모두에 점점 더 많이 활용되어 치료를 안내하고 과학적 발견을 촉진합니다. 조직은 종종 제한적이며 가변 종양 함량을 가진 작은 표본이 일상적으로 사용됩니다. 따라서 종양 적합성과 완전성은 의미있는 데이터를 얻는 데 장벽으로 남아 있습니다. 종양 백분율이 낮은 샘플은 실제 변이체와 시퀀싱 아티팩트를 구별하는 데 어려움을 야기할 수 있으며 종종 NGS1에 적합하지 않습니다. 20% 미만의 낮은 종양 함량의 경우의 종양 농축은 재현 가능한 시퀀싱 데이터를 생성하고 저주파 변이체가 놓치지 않도록 충분한 물질을 산출하는 데 도움이 되는 것으로 나타났다2,3. 그러나 제한은 사용 된 플랫폼과 생성 된 데이터의 계획된 사용에 따라 다릅니다.
전통적으로, 추출을 위한 종양 영역의 농축은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 슬라이드의 수동 매크로해부 또는 레이저 포획 미세해부(LCM)에 의해 수행된다. 수동 매크로 해부 또는 슬라이드에서 지정된 조직 영역을 긁어내는 것은 종양 영역을 제거하여 상대적으로 저렴한 비용으로 하류 분석에 사용할 수 있지만 정확도는 낮....
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프로토콜
시작하기 전에 IRB(기관 검토 위원회) 프로토콜에 따라 적절한 조직 표본을 확보하십시오. 여기에 설명 된 모든 방법은 Genentech, Inc.의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
1. 조직 및 슬라이드 준비
- FFPE 또는 신선한 냉동 조직 블록을 선택하고 아래의 해당 처리 방법을 활용하십시오.
- 조직 블록 섹션을 원하는 두께로 양전하를 띤 유리 슬라이드로 자릅니다. 리본 내의 FFPE 조직을 H&E 염색에 적합한 두께(즉, 4 μm)로 절단한 다음, 필요성 및 조직 가용성에 따라 4-20 μm 범위의 두께로 1-4개의 절편을 절단하여 리본으로 연속적으로 절편한다. 조직 절편을 양전하를 띤 유리 현미경 슬라이드에 모으십시오.
참고: 신선한 냉동 참조 조직 절편은 냉동 절편에 대한 일상적인 프로토콜을 사용하여 Hematoxylin 및 Eosin (H & E)으로 즉시 염색해야하며 염색되지 않은 냉동 절편은 수확에 필요할 때까지 -20 °C에서 유지해야합니다. - 모든 FFPE 섹션을 실온에서 하룻밤 동안 건조시키십시오.
- FFPE 기준 슬라이드를 60°C에서 30분 동안 구운 다음 일상적인 프....
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결과
이종이식편에서 전이성 결장직장암을 함유하는 FFPE 및 FF 마우스 간 절편을 선택하였다. 절편을 H&E 염색하고(도 1A, E, I) 20x 배율로 전체 슬라이드 이미저에서 스캔하였다. 병리학자가 관심있는 종양 영역에 디지털 주석을 달고 마스크를 상용 소프트웨어를 사용하여 생성하고 디지털 png 참조 이미지로 포맷했습니다 (그림 1B, F, J). 연속 10 μm 및 20 μm 두께의 염색되지 않은 샘플 슬라이드를 스테이지 상에 배치하고 상기 기재된 바와 같이 자동 해부를 수행하였다. 신선한 냉동 조직을 시판 키트로부터 용해 완충액에 수집하고, 제조자의 지시에 따라 핵산 추출로 직접 운반하였다. FFPE 샘플을 분자 등급 미네랄 오일을 사용하여 수집하고, 해부된 샘플을 함께 풀링하고, 4°C에서 20분 동안 25,000 x g에서 원심분리.......
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토론
여기에 제시된 것은 종양 농축 및 WES에서의 사용을 위해 낮은 종양 함량 FFPE 또는 신선한 냉동 조직으로부터 종양 영역을 해부하기 위한 디지털 주석 및 자동 해부의 적용을 위한 프로토콜이다. 디지털 주석과 마스크 생성을 자동화된 해부와 결합하면 수동 매크로 해부 및 LCM을 포함한 종양 농축의 고전적인 방법에 공통적으로 필요한 실무 시간과 전문 지식이 크게 줄어 듭니다. 이 프로토콜은 낮은 종양 함량 농축뿐만 아니라 높은 처리량과 중간 수준의 정밀도로 의미있는 종양 농축을 위해 종양 인접 정상 조직에서 멀리 떨어진 분산 종양 둥지를 해부하는 것이 어려운 경우에도 농축을 가능하게하는 잠재적으로 중요한 중급 종양 농축 옵션을 보여줍니다. 낮은 종양 함량의 이종이식편 조직에 대한 우리의 워크플로우의 사용이 여기에서 입증되는 동안, 이 프로토콜은 또한 다양한 정상 조직 및 암 적응증에 대해 인간, 뮤린 및 이종이식편 조직을 포함한 조직 유형에 걸쳐 작동한다는 것을 발견하였다.
따라.......
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공개 사항
Charles A Havnar, Oliver Zill, Jeff Eastham, Jeffrey Hung, Jennifer Giltnane, Nicolas Lounsbury, Daniel Oreper, Sarajane Saturnio 및 Amy A Lo는 Genentech와 Roche의 직원 및 주주이며 Mana Javey와 Emmanuel Naouri는 Roche의 직원 및 주주입니다.
감사의 글
저자들은 자동 해부 개발에 대한 지원뿐만 아니라이 작업을 지원 한 Genentech Pathology Core Laboratory 직원에 대해 Carmina Espiritu와 Robin E. Taylor에게 감사하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect 충전 스테이션 | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect 기기, 베이스 | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect 기기, 헤드 | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect 밀링 팁 소형 | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect, PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | , Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| 배양 버퍼 | Promega | D920D, | |
| Leica Autostainer, XL | Leica | ST5010 | 자동 염색기 |
| , 분자 등급 미네랄 오일 | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | 소화 완충액 |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA 미니 키트 | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus 완충액 | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus 양전하 현미경 슬라이드 | Thermo Scientific | 6776214 |
참고문헌
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al.
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