자동화된 조직 해부를 통한 디지털 주석은 낮은 종양 함량의 경우에 종양을 농축하는 혁신적인 접근 방식을 제공하며 파라핀 및 냉동 조직 유형 모두에 적응할 수 있습니다. 설명 된 워크 플로는 정확성, 재현성 및 처리량을 향상 시키며 연구 및 임상 설정 모두에 적용될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
낮은 종양 함량 조직에서의 종양 농축은, 방법에 따라 종양 함량이 20% 미만인 조직에서, 차세대 시퀀싱과 같은 많은 다운스트림 분석으로 재현가능하게 양질의 데이터를 생성하기 위해 요구된다. 자동화된 조직 해부(Automated tissue dissection)는 염색되지 않은 슬라이드에 디지털 이미지 주석 오버레이를 사용하여 기존의 매크로 해부 및 시간, 비용 및 전문 지식의 한계를 줄임으로써 이러한 일반적인, 낮은 종양 함량의 조직에서 종양 농축을 자동화하고 개선하는 새로운 방법론입니다. 여기서, 디지털 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 주석은 염색되지 않은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE)에서 직경250μm2 인 블레이드 또는 핵산 추출 및 전체 엑소메 시퀀싱(WES) 전에 자동화된 종양 농축을 위해 두께가 최대 20μm인 신선한 냉동 절편을 사용하여 작은 종양 영역을 표적으로 하는 데 사용됩니다. 자동화된 해부는 핵산 추출을 위해 단일 또는 다중 절편으로부터 낮은 종양 함량 조직에서 주석이 달린 영역을 수확할 수 있다. 또한 광범위한 수확 전후 수집 메트릭을 캡처하는 동시에 정확성, 재현성을 향상시키고 슬라이드를 더 적게 활용하여 처리량을 높일 수 있습니다. 기술된 프로토콜은 종양 함량이 낮은 동물 및/또는 인간 FFPE 또는 신선한 냉동 조직에 대한 자동화된 해부와 함께 디지털 주석을 가능하게 하며, 또한 임상 또는 연구 워크플로우에서 다운스트림 시퀀싱 애플리케이션에 대한 적절성을 높이기 위해 관심 영역 농축에 사용될 수 있다.
서론
차세대 염기서열 분석(NGS)은 환자 치료와 암 연구 모두에 점점 더 많이 활용되어 치료를 안내하고 과학적 발견을 촉진합니다. 조직은 종종 제한적이며 가변 종양 함량을 가진 작은 표본이 일상적으로 사용됩니다. 따라서 종양 적합성과 완전성은 의미있는 데이터를 얻는 데 장벽으로 남아 있습니다. 종양 백분율이 낮은 샘플은 실제 변이체와 시퀀싱 아티팩트를 구별하는 데 어려움을 야기할 수 있으며 종종 NGS1에 적합하지 않습니다. 20% 미만의 낮은 종양 함량의 경우의 종양 농축은 재현 가능한 시퀀싱 데이터를 생성하고 저주파 변이체가 놓치지 않도록 충분한 물질을 산출하는 데 도움이 되는 것으로 나타났다2,3. 그러나 제한은 사용 된 플랫폼과 생성 된 데이터의 계획된 사용에 따라 다릅니다.
전통적으로, 추출을 위한 종양 영역의 농축은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 슬라이드의 수동 매크로해부 또는 레이저 포획 미세해부(LCM)에 의해 수행된다. 수동 매크로 해부 또는 슬라이드에서 지정된 조직 영역을 긁어내는 것은 종양 영역을 제거하여 상대적으로 저렴한 비용으로 하류 분석에 사용할 수 있지만 정확도는 낮고 정밀도는낮습니다 2,4. 최소한의 기술적 정확도는 종양의 큰 스와스가 존재하거나 최소한의 조직 손실이 결과에 큰 영향을 미치지 않는 높은 종양 함량의 경우 매우 효과적 일 수 있지만 종양 함량이 낮은 경우 또는 더 분산 된 종양이있는 경우 정밀도를 높여야합니다. 따라서 LCM은 1990 년대에 발명되었으며 포르말린 고정 파라 핀 임베디드 (FFPE) 슬라이드 5,6,7,8에서 조직의 작고 정의 된 미세한 영역을 정확하게 제거하는 귀중한 방법이되었습니다. LCM은 샘플의 복잡한 이질성이 존재할 때 단일 세포 집단을 수집하는데 활용될 수 있다(9) 이전에 분리하기 어려웠던 세포 집단의 수집을 허용한다. 그러나 LCM에는 광범위한 기술 전문 지식과 실습 시간10,11,12,13,14가 필요한 값 비싼 기계가 필요합니다.
자동 조직 해부에 사용되는 장비는 LCM (~ 10 μm)과 매크로 해부 (~ 1 mm) 사이의 정밀도를 가지고 있습니다 15. 추가적으로, 그것은 거대 해부와 LCM 사이의 비용 및 기술적 전문 지식 요구 사항을 모두 나타내며, 이전 방법(15)의 단점을 완화하기 위해 순차적 FFPE 슬라이드로부터 신속한 조직 농축을 수행하도록 설계되었습니다. 이러한 방식으로 자동화된 해부에서는 디지털 주석 또는 무대 위 슬라이드 참조 이미지 오버레이를 직렬로 단면화된 염색되지 않은 티슈 슬라이드에 활용하여 관심 영역을 해부하고 풍부하게 합니다. 이 기기는 플라스틱 방사 블레이드 밀링 팁, 1.5mL 수집 튜브를 사용하며 핵산 추출 및 시퀀싱을 포함한 다운스트림 분석을 위해 관심 영역을 수집하기 위해 해부용 다양한 유체와 함께 사용할 수 있습니다. 방사 플라스틱 밀링 팁은 내부 및 외부 시린지 배럴 저장소와 플런저를 사용하여 버퍼를 수집한 다음, 조직(16)을 밀링하고 수집한다. 가변 밀링 팁 크기 직경 (250 μm, 525 μm, 725 μm)은 비교를 위해 별도의 조직 영역, 풀링 될 수있는 다초점 영역 또는 단일 또는 다중 FFPE 슬라이드로부터의 개별 작은 영역의 해부를 허용 할 수 있습니다. 수확에 사용되는 섹션 두께는 개별 실험 요구에 따라 조정할 수 있으며 사용자는 수확에 사용 된 마지막 섹션 직후에 하나의 직렬 섹션에서 추가 H & E를 수행하여 관심 영역이 고갈되지 않았는지 확인할 수 있습니다.
자동 해부술은 종양 함량이 낮은 사례에서 종양 함량을 풍부하게하는 방법으로 확인되었으며 현재 FFPE 임상 표본에 사용하기 위해 판매되는 자동화 된 조직 해부 장비의 의도 된 기능을 최대 10 μm 두께로 테스트하고 확장했습니다. 이 연구는 자동화 된 해부가 연구 목적으로 FFPE 및 신선한 냉동 인간 또는 동물 조직 절편에 최대 20 μm 두께로 적용될 수 있음을 보여줍니다. 이 프로토콜은 또한 종양 함량이 낮은 조직 및/또는 의미 있는 거대 해부가 어렵거나 실현 가능하지 않은 중첩되고 분산된 종양이 있는 경우 종양 농축을 위한 디지털 주석을 달고 해부를 자동화하는 접근법을 시연하고 NGS에 충분한 핵산의 품질과 수율을 보여줍니다. 따라서 자동 해부는 종양 농축을 위해 중간 수준의 정밀도와 증가 된 처리량을 제공 할 수 있으며 다른 관심 영역을 풍부하게하거나 연구 또는 임상 질문에 답하기 위해 다른 플랫폼과 결합 할 수도 있습니다.
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프로토콜
시작하기 전에 IRB(기관 검토 위원회) 프로토콜에 따라 적절한 조직 표본을 확보하십시오. 여기에 설명 된 모든 방법은 Genentech, Inc.의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
1. 조직 및 슬라이드 준비
- FFPE 또는 신선한 냉동 조직 블록을 선택하고 아래의 해당 처리 방법을 활용하십시오.
- 조직 블록 섹션을 원하는 두께로 양전하를 띤 유리 슬라이드로 자릅니다. 리본 내의 FFPE 조직을 H&E 염색에 적합한 두께(즉, 4 μm)로 절단한 다음, 필요성 및 조직 가용성에 따라 4-20 μm 범위의 두께로 1-4개의 절편을 절단하여 리본으로 연속적으로 절편한다. 조직 절편을 양전하를 띤 유리 현미경 슬라이드에 모으십시오.
참고: 신선한 냉동 참조 조직 절편은 냉동 절편에 대한 일상적인 프로토콜을 사용하여 Hematoxylin 및 Eosin (H & E)으로 즉시 염색해야하며 염색되지 않은 냉동 절편은 수확에 필요할 때까지 -20 °C에서 유지해야합니다. - 모든 FFPE 섹션을 실온에서 하룻밤 동안 건조시키십시오.
- FFPE 기준 슬라이드를 60°C에서 30분 동안 구운 다음 일상적인 프로토콜을 사용하여 H&E로 염색합니다.
- H&E 염색된 슬라이드를 전체 슬라이드 이미저에서 20배 이상의 배율로 스캔합니다.
- 공급업체에서 제공하는 시청 플랫폼 또는 오픈 소스 뷰어를 사용하여 관심 있는 종양 영역에 대해 스캔한 슬라이드 이미지에 주석을 추가합니다. 이러한 주석을 저배율 스크린샷으로 내보내거나 다각형 꼭짓점에 해당하는 X-Y 픽셀 좌표를 포함하는 메타데이터 파일로 저장합니다.
참고 : 전자는 기술적으로 작업하기가 덜 어렵지만 후자는 프로세스 자동화에서 이점을 제공합니다. - 사용 된 접근 방식에 따라 주석이 달린 관심 영역의 디지털 마스크를 만들고 수동 주석을 내보냅니다.
참고: 주석의 스크린샷/이미지를 사용하는 경우 간단한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 영역을 선택하고 전체 선택 항목을 채울 수 있습니다. 각 ROI에 X-Y 좌표를 사용하려면 프로그래밍 언어를 사용하여 이미지 데이터와 다각형 좌표를 모두 읽음으로써 관심 영역이 채워진 낮은 매수 이미지를 만들어야 합니다. 사용자는 자동 해부 장비 공급 업체와 협력하여 개별 소프트웨어 가용성 및 요구 사항에 따라 프로세스를 수립해야합니다. 스캔, 디지털 슬라이드 주석 및/또는 디지털 마스크 생성을 사용할 수 없는 경우, 마커를 사용하는 신중한 온슬라이드 주석이 수행되어 참조 이미지로서 디지털 마스크 대신에 사용될 수 있다. 디지털 마스크 생성을 위한 의사 코드는 보충 파일 1에 제공되었습니다.
2. 자동 조직 해부
- 염색되지 않은 샘플 조직 슬라이드를 디지털 슬라이드 참조를 사용할 때 첫 번째 및 네 번째 슬라이드 위치의 스테이지 상에 놓습니다. 디지털 옵션이 아닌 온슬라이드 주석을 사용하는 경우 염색되지 않은 샘플 조직 슬라이드를 첫 번째 위치에 참조 슬라이드가 있는 두 번째 및 네 번째 슬라이드 위치의 스테이지에 배치합니다.
- 자동화된 조직 해부 소프트웨어를 사용하여 밀링 작업 생성: 작업 선택 > 새 작업 > 사례 ID 생성 > 밀링 작업 이름 지정; 위 또는 아래 화살표 탭을 사용하여 두께 > 섹션 두께로 이동하십시오. 그런 다음 조직 준비 > Paraffinized 또는 Deparaffinized, 참조 이미지 > 파일 > 가져 오기 이미지 > 파일로 이동하여 해당되는 경우 드롭 다운에서 디지털 참조로 가져옵니다. 스테이지에서 슬라이드 참조를 위해 스테이지에서 선택합니다. 필드가 완료되면 오른쪽 하단 모서리에 있는 Scan Stage 단추를 선택하여 스테이지를 스캔하여 첫 번째부터 네 번째 위치까지 각 샘플 조직 슬라이드를 캡처합니다.
- 이미지 캡처를 위한 조직 영역을 선택합니다.
- 스테이지 내 참조를 사용하는 경우 상자를 한 모서리에서 반대쪽으로 드래그하여 조직 위에 직사각형 영역을 만듭니다. 직사각형 영역 아래의 원형 버블을 선택하여 스테이지 참조 이미지를 캡처합니다. 디지털 참조 이미지를 사용하는 경우 선택한 직사각형 영역에 이미지를 오버레이합니다. 디지털 기준의 크기를 조정하고 전체적으로 확대하여 표본 조직 위의 크기와 위치에 가장 잘 맞춥니다.
- 참조 이미지의 오른쪽 위 모서리에 있는 복사 옵션을 선택하여 이 사각형 필드를 두 번째부터 네 번째 슬라이드 위치까지의 나머지 샘플 조직 슬라이드에 복사합니다. 필요에 따라 전체적으로 정렬하고 크기를 조정합니다.
참고: 디지털 마스크가 아닌 슬라이드 상의 참조 이미지를 사용하는 경우 스테이지에서 참조로 사용할 슬라이드를 선택합니다.
- 참조 및 샘플 슬라이드 정렬
- 참조 이미지가 모든 슬라이드 위치의 조직 샘플 슬라이드에 심하게 정렬되면 화면의 오른쪽 아래 모서리에 있는 스캔 스테이지 단추를 선택하여 미세 조정 단계로 이동합니다. 첫 번째 단계 위치와 변형 도구 아이콘(오른쪽 도구 모음에서 아래쪽으로 세 번째 아이콘)을 선택하여 참조의 미세 정렬 및 확대/축소 조정을 수행하여 샘플 슬라이드 오버레이와 가장 잘 일치하도록 합니다. 화면 아래쪽에 있는 참조 대상 슬 라이딩 막대를 사용하여 참조 이미지와 샘플 이미지 사이를 전환하고 확대 및 축소 기능을 사용하여 각 슬라이드 위치를 조정하고 정렬할 수 있습니다. 이 프로세스를 두 번째 ~ 네 번째 샘플 슬라이드 위치에서 복제합니다.
- 관심 영역의 밀링 영역 선택
- 네 개의 슬라이드 위치 각각에 대한 최적의 샘플 오버레이가 달성되면 마스크된 참조 이미지의 컬러 부분에 색상 선택기 도구 아이콘(오른쪽 도구 모음의 열 번째 아이콘 아래쪽)을 사용하여 밀링 경로 지정을 그립니다. 해부를 위해 여러 슬라이드 또는 영역에 주석이 첨부된 경우 유사로 확장 상자를 선택한 다음 오른쪽 아래에 있는 주석 가져오기 단추를 선택하여 샘플 슬라이드에 밀링 경로를 그립니다.
- 첫 번째 슬라이드 위치에서 밀링 경로를 선택합니다.
참고: 첫 번째 슬라이드 위치에서 밀링 경로를 선택하면 밀링 경로가 나머지 슬라이드 위치로 복사되고 밀링 팁 사용량이 계산됩니다. 왼쪽 위 모서리의 밀링 팁 사용량은 덮인 영역과 선택한 팁 크기를 기준으로 계산됩니다. 네 개 이상의 팁이 계산되는 경우 주석이 달린 ROI를 캡처하기 위해 더 큰 팁 크기를 선택할 수 있습니다. 팁 크기는 밀 링 팁 화살표 아래의 화면 왼쪽에서 선택하거나 변경할 수 있으며 팁 사용량이 다시 계산됩니다. - 밀링 경로를 계산할 때 네 개 이하의 밀링 팁으로 주석이 달린 ROI를 수집합니다. 화면 오른쪽 하단에 있는 설정 단계 단추를 선택하여 배치된 수집 튜브에서 밀링 팁이 스테이지에서 올바르게 지정되도록 로드하라는 메시지를 표시합니다.
- 저장고를 조직 유형(FFPE 또는 신선한 냉동) 및 하류 핵산 추출 키트에 가장 적합한 해부 버퍼 3.0 mL로 채우고 화면의 오른쪽 하단 모서리에 있는 해부 버튼을 선택합니다. 분자 등급 광유 또는 상업적으로 이용가능한 핵산 추출 키트로부터의 적절한 완충액을 사용하십시오.
참고: 슬라이드와 선택한 관심 영역의 자동 해부(Automated dissection)가 시작되고 계측기에서 샘플을 수집합니다. 유닛 헤드는 스테이지 뒤쪽에서 밀링 팁을 집어 들고 저수지에서 해부 유체로 채 웁니다. 그런 다음 팁은 슬라이드에서 샘플 조직을 흡인하는 밀링 경로를 따라 완전하거나 가득 찰 때까지 회전합니다. 해부 유체로 수집 된 샘플을 무대 뒤쪽에있는 수집 튜브로 분배합니다. - 자동 해부가 완료되면 스테이지에서 수집 튜브와 해부된 샘플 슬라이드를 제거하고 각각 튜브 랙과 슬라이드 랙에 놓습니다.
참고: 신선한 냉동 수확은 제조업체의 지침에 따라 핵산 추출에 직접 가져와야하며 해부 후 신선한 냉동 섹션은 냉동 섹션에 대한 일상적인 프로토콜을 사용하여 즉시 H & E 염색해야합니다. - 해부된 후 조직 슬라이드를 60°C에서 30분 동안 구워낸 다음, 일상적인 프로토콜을 사용하여 H&E로 염색한다.
- 해부된 후 H&E 염색된 슬라이드를 전체 슬라이드 이미저에서 20x 배율로 스캔하고/하거나 아카이브하여 수집되지 않고 슬라이드에 남아 있는 조직을 참조합니다.
참고: 대체 검색 옵션에 대해서는 위의 1.5단계를 참조하십시오.
3. 핵산 추출
- 조직을 풀링하고 펠릿하십시오. 시판되는 키트를 사용하여 핵산 추출을 수행하고 제조업체의 지시에 따르십시오.
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결과
이종이식편에서 전이성 결장직장암을 함유하는 FFPE 및 FF 마우스 간 절편을 선택하였다. 절편을 H&E 염색하고(도 1A, E, I) 20x 배율로 전체 슬라이드 이미저에서 스캔하였다. 병리학자가 관심있는 종양 영역에 디지털 주석을 달고 마스크를 상용 소프트웨어를 사용하여 생성하고 디지털 png 참조 이미지로 포맷했습니다 (그림 1B, F, J). 연속 10 μm 및 20 μm 두께의 염색되지 않은 샘플 슬라이드를 스테이지 상에 배치하고 상기 기재된 바와 같이 자동 해부를 수행하였다. 신선한 냉동 조직을 시판 키트로부터 용해 완충액에 수집하고, 제조자의 지시에 따라 핵산 추출로 직접 운반하였다. FFPE 샘플을 분자 등급 미네랄 오일을 사용하여 수집하고, 해부된 샘플을 함께 풀링하고, 4°C에서 20분 동안 25,000 x g에서 원심분리...
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토론
여기에 제시된 것은 종양 농축 및 WES에서의 사용을 위해 낮은 종양 함량 FFPE 또는 신선한 냉동 조직으로부터 종양 영역을 해부하기 위한 디지털 주석 및 자동 해부의 적용을 위한 프로토콜이다. 디지털 주석과 마스크 생성을 자동화된 해부와 결합하면 수동 매크로 해부 및 LCM을 포함한 종양 농축의 고전적인 방법에 공통적으로 필요한 실무 시간과 전문 지식이 크게 줄어 듭니다. 이 프로토콜은 낮은 종양 함량 농축뿐만 아니라 높은 처리량과 중간 수준의 정밀도로 의미있는 종양 농축을 위해 종양 인접 정상 조직에서 멀리 떨어진 분산 종양 둥지를 해부하는 것이 어려운 경우에도 농축을 가능하게하는 잠재적으로 중요한 중급 종양 농축 옵션을 보여줍니다. 낮은 종양 함량의 이종이식편 조직에 대한 우리의 워크플로우의 사용이 여기에서 입증되는 동안, 이 프로토콜은 또한 다양한 정상 조직 및 암 적응증에 대해 인간, 뮤린 및 이종이식편 조직을 포함한 조직 유형에 걸쳐 작동한다는 것을 발견하였다.
따라...
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공개 사항
Charles A Havnar, Oliver Zill, Jeff Eastham, Jeffrey Hung, Jennifer Giltnane, Nicolas Lounsbury, Daniel Oreper, Sarajane Saturnio 및 Amy A Lo는 Genentech와 Roche의 직원 및 주주이며 Mana Javey와 Emmanuel Naouri는 Roche의 직원 및 주주입니다.
감사의 글
저자들은 자동 해부 개발에 대한 지원뿐만 아니라이 작업을 지원 한 Genentech Pathology Core Laboratory 직원에 대해 Carmina Espiritu와 Robin E. Taylor에게 감사하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect 충전 스테이션 | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect 기기, 베이스 | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect 기기, 헤드 | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect 밀링 팁 소형 | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect, PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | , Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| 배양 버퍼 | Promega | D920D, | |
| Leica Autostainer, XL | Leica | ST5010 | 자동 염색기 |
| , 분자 등급 미네랄 오일 | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | 소화 완충액 |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA 미니 키트 | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus 완충액 | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus 양전하 현미경 슬라이드 | Thermo Scientific | 6776214 |
참고문헌
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