Method Article

엑소시토시스의 자동 검출 및 분석

DOI:

10.3791/62400

⸱

September 11th, 2021

 , 
1UNC Neuroscience Center, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

In This Article

Summary

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pH 에 민감한 형광 프로브로 표시된 외식 이벤트를 감지하기 위해 자동화된 컴퓨터 비전 소프트웨어를 개발했습니다. 여기서는 그래픽 사용자 인터페이스와 RStudio를 사용하여 융합 이벤트를 감지하고, 융합의 현면 파라미터를 분석하고 표시하며, 이벤트를 고유한 융합 모드로 분류합니다.

Abstract

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소포 SNARE 단백질에 부착된 pH-민감한 GFP(pHluorin)의 타임랩스 TIRF 현미경 검사는 세포 배양에서 단일 소포 외세포 이벤트를 시각화하는 효과적인 방법입니다. 이러한 이벤트에 대한 편견없고 효율적인 식별 및 분석을 수행하기 위해 MATLAB에서 컴퓨터 비전 기반 접근 방식을 개발하고 구현했습니다. 분석 파이프라인은 셀 세분화 및 외식 이벤트 식별 알고리즘으로 구성됩니다. 컴퓨터 비전 접근법에는 형광 부패및 피크 ΔF/F의 반감기를 비롯한 단일 이벤트의 여러 매개 변수를 조사하는 도구뿐만 아니라 외세포증 주파수의 전체 세포 분석을 포함하는 도구가 포함되어 있습니다. 이러한 융합의 매개 변수및 기타 매개 변수는 뚜렷한 융합 모드를 구별하기 위한 분류 접근 방식에 사용됩니다. 여기서 새로 구축된 GUI는 처음부터 끝까지 분석 파이프라인을 수행합니다. R Studio에서 Ripley의 K 기능을 추가로 조정하여 공간과 시간 모두에서 클러스터, 분산 또는 임의의 융합 이벤트를 구별하는 데 사용됩니다.

Introduction

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VAMP-pHluorin 구조 또는 트랜스프레린 수용체(TfR)-pHuji 구조는 이러한 pH 민감형 형광류가 소포와 혈장 멤브레인1사이의 융합 모공 개구 시 즉시 산 소포 루멘 및 형광 내에 담금질되기 때문에 외세포 현상의 우수한 마커이다. 퓨전 모공 개구부에 이어 형광은 기하급수적으로 부패하며 융합 이벤트에 대한 정보를 드러내는 이질성도가 있습니다. 여기서, 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 응용 프로그램은 자동으로 외세포 이벤트를 감지하고 분석하는 설명입니다. 이 응용 프로그램은 사용자가 자동으로 pH 민감한마커에 의해 공개 엑소시틱 이벤트를 감지 할 수 있습니다 2 분류 목적 에 사용할 수있는 각 이벤트에서 기능을 생성(그림 1A). 또한, 리플리의 K 함수를 이용한 외식 이벤트 클러스터링의 분석이 설명된다.

다른 외세포 모드로 외세포 이벤트의 자동화 된 분류는 최근보고되었다3. 엑소시토시스의 두 가지 모드, 풀 소포 융합(FVF) 및 키스 앤런 융합(KNR) 엑소시토시스는 이전에4....

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Protocol

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1. 데이터 집합 및 디렉터리 선택

  1. 분석을 위해 데이터 집합을 선택하려면 데이터 집합 찾기 버튼(그림2A,빨간색 상자 1)을클릭하여 데이터가 증착된 폴더(예: RawData 폴더)로 이동합니다. 데이터 파일은 데이터 파일을 목록으로 자동으로 채웁니다. 폴더에 두 개 이상의 데이터 집합이 있을 수 있습니다.
  2. 디렉토리 선택 버튼을 클릭하고 분석된 파일이 입금되는 디렉토리(예: 테스트)를 선택합니다(그림2A,빨간색 상자 2). 분석 버튼을 누르면 폴더 및 완성된 분석 파일 세트와 중간 임시 이미지가 이 디렉토리에서 만들어집니다. 디렉터리를 선택하지 않으면 오류가 생성됩니다.

2. 픽셀 크기와 프레임 레이트 설정

  1. 적절한 "프레임 레이트" 또는 "픽셀 크기"상자(그림 2A,그린 박스)에서 이미지의 적절한 프레임 속도와 픽셀 크기를입력합니다. 값이 제공되지 않는 경우(기본 "0"으로....

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Results

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여기서GUI(그림 2A)는TIRF(총 내부 반사 형광) 현미경을 사용하여 3DIV에서 뉴런을 발현하는 3개의 VAMP2-pHluorin으로부터 의 외세포 이벤트를 분석하는 데 활용되었다. E15.5 피질 뉴런은 격리되었고, 그 다음으로 VAMP2-pHluorin과 함께 트랜스페팅및 윙클 등에서 설명된 프로토콜을 이용한 도금 및 도금에 의해 2016년 및 비셀만 외, 20111년11,12. 이미징 매개 변수의 방법론은 Urbina 외, 20182에설명된 대로 설명되어 있습니다. 간단히, TIRF 현미경 검사는 2 분 동안 100 ms마다 뉴런의 기저 플라즈마 멤브레인을 이미지하는 데 사용되었다.

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Discussion

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외식 감지 및 분석 소프트웨어를 사용하는 경우 프로그램은 무손실 압축 .tif 파일만 입력으로 수락한다는 점을 고려하십시오. .tif 이미지 파일은 8비트, 16비트 또는 32비트 그레이스케일(단일 채널) 이미지일 수 있습니다. 다른 이미지 형식은 입력하기 전에 이러한 유형 중 하나로 변환해야 합니다. 참고로 여기에서 사용되는 예제는 16비트 회색 크기 이미지입니다.

자동 감지 프로세스에 내재된 타임랩스 이미지 세트는 자동화된 배경 감속 및 광표백 보정을 위해 처리됩니다. 배경 빼기의 경우 마스크 파일의 마스크 영역 외부의 픽셀은 전체 이미지의 시간 경과에 따라 평균되며 평균 값은 이미지 집합에서 빼됩니다. 포토표백 보정의 경우, 모노 지수 부패 핏이 비디오 의 과정을 통해 마스크의 평균 형광에 적용되며 수정된 강도는 다음과 같이 조정됩니다.

보정 강도 = (시간에 강도 t) ÷ exp-k×t 어디 k = 붕괴 상수

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Disclosures

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저자는 공개 할 것을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

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우리는 코드와 GUI를 테스트 더스틴 Revell 및 레지널드 에드워즈 감사합니다. 자금은 이 연구를 지원하는 국립 보건원에 의해 제공되었습니다: R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG), F31NS103586 (독감)을 포함.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
RR Core 팀https://www.r-project.org/
RstudioRstudio, PBChttps://rstudio.com/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  2. Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal orga....

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Exocytosis AnalysisAutomated DetectionTIRF MicroscopypHluorin ImagingVesicle FusionExocytic Event ClassificationCell SegmentationRipley s K AnalysisFluorescence DecayNeuronal Exocytosis

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