본 논문은 신경모세포종의 제브라피시 모델에서 종양 전이를 실시간으로 개발, 특성화 및 추적하는 방법을 소개하며, 특히 MYCN 및 LMO1의 과발현을 가진 형질형 제브라피시 라인에서 자발적으로 전이를 발생시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Zebrafish는 인간 질병, 특히 암을 연구하는 중요한 동물 모델로 부상했습니다. Zebrafish 모델링에 적용된 강력한 형질 전환 및 게놈 편집 기술과 함께 유지 보수의 용이성, 고수량 생산성 및 강력한 라이브 이미징은 모두 제브라피쉬를 생체 내에서 이 공정의 기초에 기초한 전이 및 세포 및 분자 기지를 연구하는 귀중한 모델 시스템으로 만듭니다. 전이의 첫번째 제1 제브라피시 신경모세포종 (NB) 모형은 도파민 베타-하이드록실라제 (dβh) 프로모터의 통제하에, 2개의 종양유전자, MYCN 및 LMO1를 과보로 해서 개발되었습니다. CO-표현 된 MYCN 및 LMO1 신경 모세포종 발생의 감소 된 대기 시간 및 증가 침투뿐만 아니라 종양 세포의 가속 먼 전이로 이어졌다. 이 새로운 모델은 임상적으로 관련되고 전이 연관된 유전 적 변경의 참여를 포함하여 인간 전이성 NB의 많은 주요 특징을 안정적으로 반복합니다. 생체 내에서 전이의 자연적이고 자발적인 발달; 전이의 보존 사이트. 따라서, 제브라피쉬 모델은 생체내에서 종양 전이의 복잡한 과정을 해부하는 독특한 장점을 갖는다.
서론
Zebrafish는 널리 사용되고 연구의 여러 영역에 적용되었습니다, 특히 암에서. 이 모델은 강력한 생식, 비용 효율적인 유지 보수 및 종양 성장 및 전이의 다목적 시각화와 같은 많은 이점을 제공하며, 이 중 제브라피쉬는 종양 발생 및 전이의 세포 및 분자 기지를 연구하고 조사할 수 있는 강력한 도구로 만듭니다. 대규모 게놈 매핑, 전염, 유전자 과발성 또는 녹아웃, 세포 이식 및 화학 스크린을 위한 새로운 기술은 제브라피시 모델1의 힘을 대단히 증강시켰습니다. 지난 몇 년 동안, 많은 얼룩말 물고기 라인은 백혈병, 흑색종, rhabdomyosarcoma, 및 간세포 암에 국한되지 않는 다양한 인간 암의 종양 발생 및 전이를 연구하기 위하여 개발되었습니다2,3,4,5. 또한, 신경모세포종(NB)의 제1 제1 제1 제보브라시모델은 도파민-베타-하이드록실라제(dβh) 프로모터를 통제하에 있는 말초 교감 신경계(PSNS)에서 종양유전자인 MYCN을 과발현함으로써 생성되었다. 이 모델로, 활성화된....
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프로토콜
제브라피시와 동물 관리/유지관리를 이용한 모든 연구 방법은 메이요 클리닉의 제도적 가이드라인에 따라 수행되었습니다.
1. PSNS에서 과발현을 가진 LMO1 형질전환 제브라피시 라인의 개발을 위한 트랜스진 구조의 제조 및 미세 주입
- LMO1-pDONR221 항목 클론을 개발하기 위해, PCR을 사용하여 인간 세포주로부터 얻은 cDNA로부터 인간 LMO1의 코딩 영역을 증폭시한다.
- 여기에 자세히 설명된 대로 25 μL 반응을 확인하십시오: 10x 표준 Taq 반응 버퍼의 2.5 μL, Taq DNA 폴리머라제0.125 μL, 10mm dNTPs의 0.5 μL, cDNA 템플릿 2μL, 10 μM 포워드 LMO1 ATTB1 프라이머의 0.5 μL, 10 μM 역 LMO1 ATTB2 프라이머, 물 18.875 μL.
참고: 앞으로 LMO1 ATTB1 프라이머 사용: 5'GGGGACAAGTAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
CATGATGGGTGCTGGACAAGAGA-3' 및 역 LMO1 ATTB2 프라이머: 5'-GGGGACCACTTTGTAAAGAGGTTTTTACT
가액트게가트카아그-3' - 다음 프로그램....
- 여기에 자세히 설명된 대로 25 μL 반응을 확인하십시오: 10x 표준 Taq 반응 버퍼의 2.5 μL, Taq DNA 폴리머라제0.125 μL, 10mm dNTPs의 0.5 μL, cDNA 템플릿 2μL, 10 μM 포워드 LMO1 ATTB1 프라이머의 0.5 μL, 10 μM 역 LMO1 ATTB2 프라이머, 물 18.875 μL.
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결과
LMO1이 MYCN과 시너지 효과를 발휘하여 NB 병원체에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, dβh 프로모터의 통제하에 있는 PSNS 세포에서 LMO1(dβh:LMO1 및 dβh:mCherry) 또는 MYCN(dβh:EGFP-MYCN)의 발현을 구동하는 형질형성생성이 얼룩말피 배아배아로 주입되었다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 안정된 형질전환선의 발달 과 유전자형의 검증 후, 이종고우스 MYCN 및 LMO1 물고기는 교배되었다. 그들의 자손은 MYCN (EGFP+) 또는 LMO1 (mCherry+) 발현을 각각 1 dpf 또는 3-4 dpf로 정렬하였다. MYCN 과발현은 PSNS 개발을 억제하는 것으로 나타났다
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토론
Zebrafish는 지난 수십 년 동안 연구에서 일반적으로 사용되어 왔으며, 특히 암 연구에서는 유지 보수의 용이성, 견고한 재생산 및 생체 내 이미징1,28에 대한 명확한 이점과 같은 명백한 이유로 사용되었습니다. 제브라피시 모델은 대규모 유전 연구를 위해 쥐와 마우스와 같은 포유류 모형 유기체에 잘 보완하는 그들의 외부 풍부하게 함 및 발달 때문에 배아로 쉽게 조작될 수 있습니다1,2,3. 더욱이, 제브라피시 게놈은 인간 게놈과 높은 수준의 유사성을 갖는다. 제브라피시 게놈의 상세한 주석을 인간 기준 게놈과 비교하면, 인간 유전자의 약 70%가 제브라피시 정형소그29를 얻는 것으로 나타났다. 또한,.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 국립 암 연구소에서 보조금 R01 CA240323 (S.Z.)에 의해 지원되었다; 미국 국방부(DoD)의 보조금 W81XWH-17-1-0498(S.Z.) V학자상은 V암연구재단(S.Z.)과 마요 생물의학 발견 센터(S.Z.)의 플랫폼 보조금으로 수여됩니다. 메이요 클리닉 암 센터 및 개별 의학 센터 (S.Z.)의 지원을 받고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 벡터 키트 | 벡터 | SK-4100 | |
| 아세트산 | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| 아가로스 GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| 안티 티로신 하이드록실라제(TH) 항체 | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin 차단 키트 | 벡터 | SP-2001 | |
| BOND 인텐스 R 검출 | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND 1차 항체 희석제 | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC 기기 | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | 전자동 IHC 염색 시스템 |
| CH211-270H11 BAC 클론 | BACPAC 리소스 센터(BRFC) | N/A | |
| DP71 카메라가 장착된 복합 현미경 | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL(자일렌 기반 장착 매체) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | 즉시 사용 가능(준비 필요 없음) |
| 에탄올 | 캐롤라이나 | 86-1263 | |
| 확장 긴 템플릿 PCR 시스템 | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II 효소 믹스 | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II 효소 믹스 | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| 염소 항-Rb 2차 항체(비오틴화) | Dako | E0432 | |
| 헤마톡실린 용액, 해리스 수정 | 시그마 Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| 염산 | 아쿠아 솔루션 | 4360-1L | |
| 과산화수소, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| SceI 효소 | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| 카나마이신 설페이트 | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| 탄산리튬 | 시그마 Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| 절편용 마이크로톰 | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | 넉넉한 선물 (설명된 대로 자유롭게 배포할 수 있는 자료를 얻으려면 웹페이지 http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page 참조하십시오.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generousful gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R 기증자 벡터 | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | 넉넉한 선물 |
| 페놀 레드, 0.5% | 시그마 알드리치 | P0290 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius 적색 염색 키트 | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | |
| Proteinase K, 재조합, PCR 등급 | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| 아지드화나트륨(NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| 입체 형광 현미경 | Leica | MZ10F | |
| 이미징용 디지털 시력 DS-U1 카메라가 장착된 입체 형광 현미경 | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA 중합효소 | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI 진공 침투 프로세서 | Sakura | N/A | 모델 #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
참고문헌
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694(2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <....
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