방법 논문

인간 다능성 줄기 세포에서 3D 망막 조직의 파생을 위한 망막 오르간로이드 유도 시스템

DOI:

10.3791/62435

⸱

2021년 4월 12일

 ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou, China, 510060

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포주에 적합한 최적화된 망막 오르간성 유도 시스템을 설명하여 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

망막 퇴행성 질환은 효과적인 치료없이 돌이킬 수없는 실명의 주요 원인입니다. 망막 세포의 모든 모형으로 분화할 가능성이 있는 만능 줄기 세포, 심지어 미니 망막 조직조차, 이 질병을 가진 환자를 위한 거대한 약속을 개최하고 질병 모델링 및 약 검열에 있는 많은 기회를 보유합니다. 그러나 hPSCs에서 망막 세포에 이르는 유도 과정은 복잡하고 시간이 많이 소요됩니다. 여기서, 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포에 적합한 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성하기 위하여 최적화된 망막 유도 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 원뿔 광수용체의 농축에 유익한 망막산을 첨가하지 않고 수행됩니다. 이 프로토콜의 장점은 망막 유도의 효율성과 반복성을 크게 향상시키기 위해 EB 크기와 도금 밀도의 정량화입니다. 이 방법을 사용하면 모든 주요 망막 세포가 순차적으로 나타나고 망막 발달의 주요 단계를 다시 수거합니다. 질병 모델링 및 세포 치료와 같은 다운스트림 응용 프로그램을 용이하게 합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

노화와 관련된 황반 변성(AMD) 및 망막색색소증(RP)과 같은 망막 퇴행성 질환(RDs)은 광수용체 세포의 기능 장애 및 사망을 특징으로 하며 전형적으로 효과적인 치료 방법 없이 돌이킬 수 없는 시력 상실로이어집니다. 이러한 질병의 근본적인 기계장치는 인간 질병 모형2의부족 때문에 부분적으로 알려지지 않았습니다. 지난 수십 년 동안 줄기 세포 기술을 통해 재생 의학에서 상당한 발전이 이루어졌습니다. 우리 자신을 포함한 많은 연구자들은 인간 배아 줄기 세포 (hESC)와 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)를 포함한 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)가 모든 종류의 망막 세포로 분화 할 수 있음을 보여주었으며, 다양한 분화 접근법3,4,5,6, 7,7, 8,9, 10,10, 10 도 11,질병 모델링 및 세포 치료에서 큰 잠재력을 제공하는12,13,14.

그러나 hPSCs에서 망막 세포에 이르는 유도 과정은 매우 복잡하고 반복성이 낮은 시간이 소요되며, 풍부한 경험과 높은 기술을 가진 연구원이 필요합니다. 복잡하고 역동적인 유도 과정에서 여러 가지 요인이 망막 조직의수율(15,16,17)에영향을 미칩니다. 또한, 상이한 유도 방법은 종종 샘플 수집 및 데이터 해석3을혼동할 수 있는 망막 마커의 타이밍과 견고한 발현에 상당히 차이가 있다. 따라서 단계별 지침이 있는 hPSC에서 망막 분화의 간단한 프로토콜이 수요가 있을 것입니다.

여기서, 당사의 발표된 연구18,19,20,21을기반으로, hPSC로부터 풍부한 콘 광수용체를 가진 망막 오르가노이드(ROs)를 생성하는 최적화된 망막 유도 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 레티노산(RA)의 보충제를 필요로 하지 않는다. 이 프로토콜은 신경 망막 및 RPE를 생성하는 다단계 방법의 설명에 중점을 둡니다. EB 형성은 초기 유도 단계의 필수적인 부분입니다. EB의 크기와 도금 밀도는 정량적으로 최적화되어 있으며, 이는 망막 조직의 수율을 과학적으로 향상시키고 반복성을 촉진합니다. 유도의 두 번째 부분에서, 광학 소포(OV)는 서스펜션 문화에서 준수 문화와 RO 형태로 자체 구성; 이 부분의 시간 과정과 효율성은 hPSC 라인에서 상당히 다릅니다. ROs의 망막 세포의 성숙 및 사양은 주로 유도의 중간 및 후기 단계에서 발생합니다. RA를 첨가하지 않고, 풍부한 원콘과 막대를 모두 갖춘 성숙한 광수용체를 생산할 수 있습니다.

이 프로토콜의 목적은 경험이 부족한 연구원이 반복할 수 있도록 각 단계를 정량적으로 설명하고 자세히 설명하는 것입니다. 다양한 hPSC 라인은 콘이 풍부한 망막 조직의 강력한 수율과 높은 반복성을 가진 이 프로토콜에 의해 로오스로 성공적으로 유도되었습니다. 이 프로토콜을 가진 HPSCs 유래 RSo는 생체 내에서망막 발달의 주요 단계를 재구성하고 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 세포 치료와 같은 다운스트림 응용 프로그램을 용이하게 하는 장기적인 생존을 할 수 있습니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hPSC의 문화 및 확장

  1. HPSC 문화
    1. 세포 외 매트릭스 (ECM, hESC 자격 매트릭스)와 6 웰 플레이트의 두 개의 우물을 코팅합니다. 덜벡코의 수정독수리 매체(DMEM)에서 ECM의 8-12 μg/mL를 포함하는 ECM 용액 50mL를 준비한다. DMEM의 49mL에서 해동된 ECM 스톡 솔루션(50x)의 1mL을 추가합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 ECM 용액 1mL을 추가합니다. 인큐베이터에서 37°C 및 5% CO2에서1h로 배양한다.
    2. 제조업체의 지시에 따라 hPSC 유지 보수 매체(MM)를 준비합니다.
    3. 실온(RT)에서 30분 동안 미리 따뜻합니다.
    4. 37°C에서 37°C에서 수조에서 인큐베이션하여 액체 질소 탱크로부터 hPSC(hiPSC 또는 hESC)(약 1 x106)의극저온 바이알을 해동한다.
    5. 유리병을 꺼내서 75% 소독 알코올 스프레이를 사용하여 조심스럽게 소독하십시오. 생물 안전 캐비닛에 넣어.
    6. 유리병에서 15mL 튜브로 셀 서스펜션을 옮기고, 5mL 파이펫을 사용하여 튜브에 드롭하여 5mL의 미리 데운 MM 드롭을 추가한다. 한편, 부드럽게 hPSC를 혼합 튜브를 흔들어.
    7. 5 분 동안 170 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 1mL 파이펫을 사용하여 대부분의 상체를 조심스럽게 제거하고 셀을 잃지 않도록 약 50 μL의 상체를 남겨 둡니다.
    8. 튜브에 MM 1mL을 추가하고 1mL 파이펫으로 한두 번 부드럽게 피펫을 사용하여 펠릿을 다시 놓습니다.
      참고: hPSC의 단일 세포의 생존은 낮습니다. 3-5 세포를 가진 작은 세포 덩어리는 식민지에서 성장하는 hPSC를 유지하는 것이 바람직하다.
    9. 미리 코팅된 우물(단계 1.1.1)에서 ECM을 제거하고, 각 웰에 1.5mL의 MM을 추가한 다음 우물당 0.5mL의 셀 서스펜션을 분배한다.
    10. 플레이트를 부드럽게 흔들어 hPSC를 균일하게 분배하고 플레이트를 37°C 및 5% CO2에서인큐베이터에 넣습니다. 세포 준수를 촉진하기 위해 적어도 24 시간 동안 플레이트를 이동하지 마십시오.
    11. 매일 MM을 변경하고 합류가 약 80 %에 도달하면 hPSC를 통과합니다.
  2. hPSC의 패시징
    참고: hPSC에서 미분화 상태의 유지 관리는 추가 응용 분야에서 매우 중요합니다. 준수 조건하에서 hPSC는 잘 정의된 테두리를 가진 식민지에서 자랍니다. 세포는 hPSC의 합류가 대략 80%에 도달할 때 통과되어야 합니다.
    1. 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 표시 및 기계적으로 통과하기 전에 명확하게 보이는 분화 세포 (<5 %)를 제거합니다.
    2. 1.1.1 단계에서 설명된 대로 ECM 코팅 플레이트를 준비한다.
    3. CA2+ 및 RT에서 Mg2+ 없이 미리 웜 MM 및 1x 인산완충액 식염수(PBS).
    4. 37°C에서 수조에서 0.5mM EDTA(1x PBS)용액을 미리 데우습니다.
    5. 진공 포부 시스템을 사용하여 배양 플레이트에서 배지를 제거하고, 1mL 파이펫을 사용하여 세포를 세척하고 두 번 반복하기 위해 각 웰에 1x PBS의 1mL을 추가합니다.
    6. 37°C에서 세포 배양 인큐베이터에서 hPSC를 해리하기 위해 잘 당 EDTA 용액 1mL을 추가하고 5분 동안 5%CO2를 허용한다. 단일 셀에 대한 해리를 피하기 위해 권장 인큐베이션 시간을 초과하지 마십시오.
    7. 접시를 꺼내 현미경으로 세포의 분리를 확인하십시오. confluent hPSC는 느슨해지고 각 세포 테두리를 볼 수 있지만 세포판은 부드럽게 흔들어서 쉽게 벗겨질 수 없습니다.
    8. 1mL 파이펫으로 EDTA 용액을 제거하고 1mLMM을 추가하여 해리를 막습니다. hPSC를 1mL 파이펫으로 한두 번 부드럽게 피펫하여 세포를 다시 페일 수 있습니다. 세포를 수집하기 위해 원심 분리기가 필요하지 않습니다.
      참고: 대부분의 세포가 EDTA를 가진 배양 후 플레이트에서 벗겨지면 원심분리기에 의해 세포를 수집할 수 있습니다.
    9. 미리 코팅된 우물(1.2.2단계)에서 ECM을 제거하고 웰당 1.5mL의 MM을 추가합니다.
    10. 각 우물에 세포 덩어리의 150-200 μL을 전송합니다. 일반적으로 hPSC는 1:6의 비율로 통과될 수 있다. 예를 들어, 6웰 플레이트의 한 우물에서 세포를 6개의 새로운 우물에 분배할 수 있다.
    11. 플레이트를 부드럽게 흔들어 hPSC를 균일하게 분배하고 플레이트를 건드리지 않고 적어도 24시간 동안 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이터에서 hPSC를 배양한다.
    12. 1.1 단계에서 설명된 대로 격일로 MM을 변경합니다.

2. hPSC에서 망막 분화

참고: 콜로니가 ~80%합류(도 1B)에도달하면 도 1A에서스키마화된 프로토콜에 따라 망막 오르가노이드로 분화하도록 유도될 수 있다. hPSC가 고품질과 양수량을 보장하기 위해 IFC 또는 QPCR을 사용하여 OCT4 또는 NANOG와 같은 분자 마커로 정기적으로 자성을 평가합니다. 차별화된 셀이 전체 셀의 5% 이상을 차지하는 경우 HPSC를 폐기해야 합니다. 제조업체의 지침에 따라 마이코플라즈마 검출 키트로 마이코플라즈마 오염을 확인하십시오. 마이코플라즈마는 hPSC의 차별화 기능을 변경할 수 있기 때문에 마이코플라즈마가 없는 hPSC만 사용하십시오.

  1. 미디어 및 시약 준비
    1. 다음을 혼합하여 신경 유도 매체(NIM)를 준비: 500mL 의 덜벡코 의 변형 된 독수리 중간/영양 혼합물 F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 mL 의 1% N2 보충, 0.5 mL 0.1% heparin (1 x PBS에서 2 mg/mL), 그리고 5 mL 의 1% MEM 비 필수 아미노산 (NEAA).
    2. DMEM/F-12 300mL, DMEM 기본 200mL, B27 보충제 2% 10mL, 항생제 항마이코틱 5mL, 1% MEM NEAA 5mL을 함유한 망막 분화 매체(RDM)를 준비한다.
      참고: NIM과 RDM 모두 필터링되지 않지만 멸균 검사가 수행됩니다. 중간 크기의 1mL를 꺼내 35mm 접시에 넣고 37°C및 5%CO2의인큐베이터에서 3-7일 동안 배양한다. 매체는 4°C에서 저장할 수 있으며 구성 요소의 활성을 보장하기 위해 2 주 이내에 사용해야합니다.
    3. DMSO에서 10m 블레비스타틴(1,000x)을 준비합니다. 1,710 μL의 DMSO를 추가하여 10mM 스톡 용액(1,000x),10 μL/튜브에서 알리쿼트, -20°C에 저장하기 위해 Blebbistatin 5 mg을 용해합니다.
      참고: 달리 언급되지 않는 한 모든 미디어 및 시약은 사용 전 30분 동안 RT에서 데워져야 합니다.
  2. 배아 체 (EB) 형성
    1. 0일(D0)에서 차별화를 시작합니다. ~80%의 합류로 성장한 6웰 플레이트에서 hPSC의 우물 하나를 꺼내십시오. 단계 1.2.1 에서 1.2.6 단계에 설명된 바와 같이 EDTA 해리 솔루션으로 세포를 수집합니다.
    2. EDTA 용액을 제거하고, 10 μM Blebbistatin을 함유한 MM 1mL을 추가하여 세포 해리를 중지하고, 1mL 파이펫으로 세포를 수집합니다. 세포 덩어리의 크기는 EB의 수율에 영향을 미치는 주요 요인 중 하나입니다. 대략, 덩어리 당 5개의 세포는 D5 내지 D7에 적당한 크기의 EB를 생성하는 것이 바람직하다.
      참고: 이것은 중요한 단계입니다. EB와 같은 골재는 hPSC의 단일 셀에서 형성하기 어렵기 때문에 세포를 너무 여러 번 피펫하지 마십시오.
    3. 셀 서스펜션(약 2 x 106 셀)을 100mm 초저 부착 페트리 접시에 옮기고 10μM Blebbistatin을 함유한 MM 9mL을 접시에 첨가합니다.
    4. 부드럽게 세포를 균일하게 분배하기 위해 접시를 두 번 흔들어 37 °C 및 5 % CO2에서인큐베이터에 접시를 넣습니다.
    5. D1에서, 세포가 적어도 24 시간 동안 배양 된 후, 접시를 꺼내 현미경으로 관찰하십시오. 많은 수의 소세포 응집체가 이때(도1C)에의해 자발적으로 형성될 것이다.
    6. 15mL 튜브에서 MM 및 NIM과 함께 12mL의 혼합물을 3:1 비율(MM 9mL 및 NIM 3mL)으로 준비합니다.
    7. 세포 배양을 10mL 파이펫을 수직으로 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고, 미리 데워진 혼합물의 10mL를 접시에 첨가한다.
    8. 튜브를 60 x g에서 3 분 동안 원심 분리하여 골재를 수집하고 5mL 파이펫을 사용하여 상퍼를 제거하고 셀을 잃지 않도록 약 500 μL을 남겨 둡니다.
    9. 튜브에 혼합물의 2mL를 추가하고 현탁액을 동일한 접시(2.2.7단계)로 옮기습니다.
    10. 접시를 부드럽게 흔들어 셀 골재를 균일하게 분배하고 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
    11. D2에서는 15mL 튜브에서 MM 및 NIM이 1:1 비율(MM 6mL, NIM 6mL)으로 12mL의 새로운 혼합물을 준비합니다. 2.2.5에서 2.2.10으로 단계를 반복하여 신선한 준비 된 혼합물로 세포 배지를 변경합니다.
    12. D3에서, 전술한 바와 같이 NIM의 15mL로 셀 배지를 변경한다. 정지 조건하에서 적어도 5 일 동안 세포를 배양.
      참고: D1에서 D3까지의 배지는 매일 변경하여 충분한 영양을 제공해야 합니다. D3 이후 NIM은 격일로 변경할 수 있습니다. 또한, EB는 풍부한 영양을 제공하기 위해 여러 요리로 나눌 수 있습니다.
  3. EB 씨를 시드
    참고: D5에서 D7까지의 적절한 시간 지점을 선택하여 ECM 코팅 된 접시에 EB를 적당히 접시에 담는 것은 EB의 크기에 따라 선택합니다. 약 직경 200 μm의 EB는 망막 분화에 적합합니다. 일반적으로 6웰 플레이트에 있는 hPSC의 한 우물은 약 300~1,000개의 EB를 생산할 수 있다. EB 수율의 변화는 hPSC 라인에 의해 변화된다.
    1. D4에서는 ECM 코팅 요리를 준비하여 EB를 신봉하는 문화를 준비합니다. 각 100mm 조직 배양 접시(표면 처리)에 5mL의 ECM을 넣고 하룻밤 동안 인큐베이터에 넣습니다.
    2. D5에서는 코팅된 요리에서 ECM을 제거하고 각 요리에 10mL의 미리 따뜻해지는 NIM을 추가합니다.
    3. EB가 함유된 요리를 꺼내라. 현미경에서 EB의 품질을 확인하고 매우 밝고 둥근 모양인지 확인하십시오. EB의 크기는 직경 약 200 μm입니다. 15mL 튜브에서 모든 EB를 수집합니다. 5mL 파이펫이 있는 15mL 튜브로 EB를 옮기. EB가 5분 동안 정착하게 하십시오. 대부분의 상체를 제거하고 약 2mL의 매체를 남겨 둡다.
    4. 1mL 파이펫으로 10mL의 NIM 드롭을 포함하는 코팅 된 요리에 EB를 배포하십시오. CM2당약 2-3 개의 EB의 밀도로 EB를 시드하십시오. 예를 들어 약 120-180개의 EB를 100mm 접시에 넣습니다. EB 번호를 대략 판단하려면 EB 서스펜션 1방울을 커버슬립에 놓고 현미경으로 EB 수를 계산합니다.
      참고: EB의 도금 밀도는 망막 유도의 효율성에 영향을 미치는 주요 요인 중 하나입니다. 밀도는 각 hPSC 라인에 의해 조정될 수도 있습니다.
    5. 부드럽게 접시를 흔들어 EB를 균일하게 분배합니다. 37 °C 및 5 % CO2에서인큐베이터에 넣어.
      참고: EB의 준수를 향상시키기 위해 최소 24시간 동안 요리를 이동하지 마십시오.
  4. 부착 조건에서 광학 소포 (EV) 및 망막 안료 상피 (RPE)의 유도
    참고: ECM 코팅 된 표면에 EB를 시드 한 후 hPSC는 분화 후 D20으로 조기에 관찰 할 수있는 OV와 같은 구조를 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 특정 성장 인자 또는 신호 분자는 미디어에 N2 및 B27 보충제의 추가를 제외하고 망막 운명으로 hPSC를 안내 할 필요가 없습니다.
    1. D8-D9에서, 접시를 제거하고 현미경에서 EB를 관찰. 모든 EB가 부착되어 요리에 퍼집니다(그림1D). 10mL의 오래된 미디엄을 함유한 100mm 접시에 신선한 NIM 10mL를 추가합니다. 인큐베이터에 다시 넣습니다.
      참고: 이전 매체를 제거하지 마십시오.
    2. D12에서는 10mL 파이펫을 사용하여 NIM으로 매체의 절반을 변경합니다. 인큐베이터에 문화를 유지합니다.
    3. D16에서는 진공 포부 시스템을 사용하여 모든 NIM을 접시에서 제거합니다. 각 접시에 20mL의 RDM을 추가합니다. RDM에서 배양을 계속하고 격일로 매체의 절반을 변경합니다.
    4. D10-D30 동안, 현미경하에서 일주일에 두 번 세포의 형태학적 변화를 관찰하고 망막 분화의 효율을 평가한다.
      참고: D10 이후, 눈필드(EF) 도메인은 부착된 EB의 주변 영역에서 자체 조직됩니다. OV와 같은 구조는 D20에서 D25 사이에 나타나고, 점차적으로 접시에서 돌출되고, 자가 형성 된 광학 컵, 이는 색소 RPE(그림 1E)에둘러싸여 있습니다. TV는 밝고 굴절적이며 두꺼운 NR 링으로 쉽게 인식할 수 있습니다.
  5. 망막 오르가노이드 (ROV)를 얻기 위해 현탁액의 분리 및 배양 EV 및 RPE
    1. D28-D35에서는 대부분의 TV가 요리에 나타납니다. 텅스텐 바늘 또는 바늘을 사용하여 1 mL 주사기를 사용하여 인접한 RPE와 함께 형태학적으로 식별 가능한 TV를 기계적으로 분리하십시오. 현탁액으로 그들을 문화.
      참고: EV 및 RPE의 모양과 수율은 hPSC 라인에서 크게 다릅니다. 따라서, OV 및 RPE를 분리하는 시점은 유연하다. 인접한 RPE가 있는 명백한 TV를 분리한 다음 RDM을 포함하는 낮은 부착 배양 접시로 이동할 수 있습니다. 모든 EV와 RpEs가 들어 올릴 때까지 나머지 셀을 계속 배양하십시오.
    2. 50-60 대의 EV를 각 100mm 저부착 배양 접시에 넣고 15mL의 RDM을 함유하여 ROs형성(도 1F)을입력합니다.
    3. RSo가 둥근 모양의 D42까지 2-3일마다 RDM을 변경합니다.

3. 망막 발달 및 성숙

참고: 이 프로토콜에서는 장기적인 문화권에서 RSo가 성장하고 성숙하도록 하려면 혈청이 필요합니다.

  1. ROs의 망막 라미네이션 및 사양
    1. 1x PBS에서 100mMM타우린(1,000x)의 10mL를 준비한다. 125 mg의 타우린을 계량하고 1x PBS의 10mL에 용해하십시오. 0.22 μm 주사기 필터로 용액을 필터링합니다. 500 μL/튜브에서 알리쿼트하고 -20°C에 보관하십시오.
    2. 망막 배양 배지 1 (RC1)을 준비합니다. 다음 구성 요소를 혼합 : DMEM / F-12의 250 mL, DMEM 베이직 175mL, 태아소 세럼 50mL, B27 보충제 10mL, 항생제 항진제 1% 5mL, MEM NEAA 5mL, 100 μM 타우린, 5mL 2mM L-alan-L-gluta.
    3. DMEM/F-12의 450mL를 포함하는 망막 배양 매체 2(RC2)를 준비하고, 태아 소 세럼 50mL, 1% N2 보충제 5mL, 항생제 항진제 5mL, 100 μM 타우린의 0.5mL, 1% MEM NEAA 5mL, 2m L-alnyl-L-글루타민 5mL.
      참고: RC1 및 RC2는 필터링되지 않지만 불임 검사를 받습니다. 배지 1mL을 꺼내 35mm 접시에 넣고 37°C 및 5%CO2에서인큐베이터에서 3-7일 동안 배양하여 사용 전에 멸균을 보장합니다. 배지는 4°C에서 보관할 수 있으며 성분의 활성을 보장하기 위해 2주 이내에 사용해야 합니다. 모든 미디어 및 시약은 사용하기 전에 30분 동안 RT에서 미리 데워져야 합니다.
    4. D42에서는 배양 매체를 RDM에서 RC1로 전환합니다.
    5. 약 30°에서 요리를 기울이고 KO가 30s로 정착하게 하십시오. 이전 RDM을 10mL 파이펫으로 제거하여 약 1mL의 중간 을 남기고 RSo를 잃지 않도록 하십시오. 각 접시에 신선한 RC1 15mL를 추가합니다.
    6. 부드럽게 접시를 흔들어 ROs를 균일하게 분배합니다. 인큐베이터에 다시 요리를 넣습니다. 그 후 일주일에 두 번 전체 매체를 변경합니다.
    7. D50-D90 동안, 두껍고 밝은 NR둥근 모양의 장기 문화를 위해 높은 품질의 로를 선택하십시오. RC1 20mL의 100mm 낮은 부착 접시에 30-40 개의 RSO를 놓고 일주일에 두 번 전체 매체를 변경합니다.
    8. RO의 장기 서스펜션 문화의 경우 ROV가 파이펫을 사용하여 다시 부착되는 것을 피하기 위해 ROV를 피펫합니다. 요리의 표면에 집착 하는 ROs를 피하기 위해 한 달에 한 번 새로운 문화 요리에 로스를 전송 합니다.
      참고: 서스펜션 문화 조건하에서, RSo는 둥근 모양이며, 한쪽에는 밝고 두꺼운 NR 링이 부착되어 있습니다. 적층 신경 망막 개발 및 망막 세포 아류형은 광수용체 세포, 막종 세포 및 양극성 세포다음으로 먼저 생성된 망막 신경절 세포와 순차적으로 나타납니다.
  2. 로오스의 콘농축으로 인간의 광수용체 성숙
    1. D90 후, 광수용체 성숙에 적합한 RC1에서 RC2로 배지를 전환한다.
    2. 3.1.7-3.1.8 단계에 설명된 바와 같이 매체를 변경합니다.
      참고 : 이 문화 조건하에서, RSo는 D300까지 장기(그림 1G)를성장할 수 있습니다. ROs에 있는 망막 세포는 성숙해지고, 뮬러 신경교 세포, 막대 및 콘을 포함하여 신경 망막의 모든 세포 특수형은 또한 취득됩니다. RA를 추가하지 않고 콘 광수용체는 또한 ROs가 풍부합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 망막 유도 과정은 인간의 태아 망막의 발달을 모방합니다. 망막 분화를 시작하기 위해 hPSC는 작은 덩어리로 해리되고 혈소액으로 배양되어 EB의 형성을 유도하였다. D1에서, 균일한 세포 응집체 또는 EB가 형성되었다(도1C). 배양 매체는 점차 NIM으로 전환되었다. D5에서는 ECM 코팅 문화 요리에 EB를 도금했습니다. 세포는 점차 적으로 EB에서 마이그레이션(그림 1D). D10에서, 눈 필드는 준수 EB의 주변 영역에서 자체 조직. D16에서 유도 매체는 RDM으로 대체되었습니다. 그 후, NR 도메인은 점차 형성되고, 접시로부터 튀어나온, 및 RPE 세포에 둘러싸인 자체 형성 된 OV와 같은 구조(도 1E). D28-D35 동안 인접한 RPE와 함께 EV를 날카로운 바늘로 들어 올려 서스펜션으로 배양했습니다. 현탁액 배양 조건 하에서,

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 다단계 망막 유도 프로토콜에서 hPSC는 망막 운명을 얻기 위해 단계적으로 안내되었고 적층 NR 및 RPE를 포함하는 망막 오르가노이드로 자체 조직되었습니다. 분화 하는 동안, hPSCs는 생체 내에서인간 망막 발달의 모든 주요 단계를 재구성, EF에서, OV, 그리고 RPE, 망막 적각에, 망막 신경절 세포를 포함 하 여 망막 세포의 모든 하위 유형을 생성, 백막 세포, 양극성 세포, 막대, 그리고 원뿔 광수용 세포, 및 cone 측세포. 망막 발달의 회수는 망막 질병 모델링과 같은 다운스트림 응용 에 도움이 될 것입니다.

몇 가지 프로토콜은 hPSC3,4,5,

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공개 사항

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Xiufeng Zhong은 인간 다능성 줄기 세포로부터망막 세포의 생성과 관련된 특허 발명자입니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국의 국가 키 R&D 프로그램 (2016YFC1101103)에 의해 지원되었다, 2017YFA0104101), 광저우 과학기술프로젝트기금(201803010078), 광동성 과학기술프로젝트(2017B020230003), 중국 자연과학재단(NSF), 중국 자연과학재단(nsF), 81570874, 81970842), 선야센대학의 100여 인재 프로그램(PT10010100), 및 기초연구기금의 기초연구기금.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(&빼기;)-블레비스타틴시그마B0560-5mgROCK-억제제
1 ml 팁KirgenKG13131 ml
10 ml 피펫Sorfa3141001피펫
100 mm 조직 배양BIOFILTCD000100100 mm 페트리 접시
100 mm 조직 배양팔콘353003100 mm 페트리 접시
15 ml 원심분리기 튜브BIOFILCFT011150원심분리기 튜브
35mm 조직 배양 접시Falcon35300135mm 페트리 접시
5ml 피펫Sorfa313000피펫
50ml 원심분리기 튜브BIOFILCFT011500원심분리기 튜브
6웰 조직 배양 플레이트Costar3516배양 플레이트
Anti-AP2α 항체DSHB3b51차  항체
항생제 항진균제 100XGibco15240062항생제-항진균제
항-ISL1 항체BosterBM4446Primary  항체
Anti-Ki67 항체Abcamab15580기본  항체
Anti-L/M opsin Dr. jeremy/Primary로부터의 항체 선물  항체
Anti-PAX6 항체DSHBpax6기본  항체
Anti-rabbit 555InvitrogenA31572Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)
Secondary 항체, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverin 항체Milliporeab5585Primary  항체
항로돕신 항체Abcamab5417기본  항체
Anti-sheep 555InvitrogenA21436Donkey anti-Sheep IgG (H+L)
Secondary 항체, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 항체AbclonalA19710Primary  항체
Anti-VSX2 항체Milliporeab9016기본  항체
B-27 보충제 W/O VIT A (50X)Gibco12587010보충제
Cryotube 바이알Thermo scientific-NUNC3754181.8 ml
DAPIDOJINDOD5324',6-Diamidino-2-phenylindole
dihydrochloride; 여러 공급업체
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-maxSigmaD2650-100ML여러 공급업체
DMEMGibcoC11995500BTMedium
DMEM /F12GibcoC11330500BTMedium
EDTAInvitrogen15575-0200.5 M PH 8.0
FBSNATOCORSFBE세럼
필터MilliporeSLGP033RB0.22μ m, 멸균 Millex 필터
GlutaMax, 100XGibco35050061L-alanyl-L-glutamine
HeparinSigmaH3149Matrigel을 사용하기 위한 PBS의 2mg/ml
, 100xCorning354277세포외 기질(ECM)
MEM 비필수 아미노산 용액(100X)Gibco11140050MEM NEAA
mTeSR1줄기세포85850hPSC 유지 매체 (MM)
N2 보충제Gibco17502048보충제
인산염 완충 식염수 (PBS) 완충GNMGNM10010Ca+, Mg+, PH7.2± 없음; 0.1 0.1M
타우린시그마T0625보충제
초저 부착 문화 접시 100mm 페트리 접시, 저 부착CorningCLS3262-20EA페트리 접시

참고문헌

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