여기에서, 마우스 종양 모델에서 종양 내재 및 주변부 유래 종양 침윤된 림프구의 특성화를 위한 종양 이식 프로토콜을 제시한다. 유세포 분석기를 사용한 수용자 유래 면역 세포의 유입에 대한 특이적 추적은 항종양 면역 반응 동안 이들 세포의 표현형 및 기능적 변화의 역학을 드러낸다.
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정오 공지
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요약
초록
T 세포 매개 면역은 종양에 대한 면역 반응에 중요한 역할을하며, 세포독성 T 림프구 (CTLs)는 암 세포를 근절하는 데 주도적 인 역할을합니다. 그러나, 종양 미세환경(TME) 내의 종양 항원-특이적 CD8+ T 세포의 기원 및 보충은 모호한 채로 남아있다. 이 프로토콜은 대리 신항원, 난알부민 (OVA) 및 TCR 트랜스제닉 OT-I 마우스를 안정적으로 발현하는 B16F10-OVA 흑색종 세포주를 채용하며, 여기서 CD8+ T 세포의 90% 이상이 클래스 I 주조직 적합성 복합체 (MHC) 분자 H2-Kb에 결합된 OVA 유래 펩티드 OVA 257-264 (SIINFEKL)를 특이적으로 인식한다. 이러한 특징들은 종양발생 동안 항원-특이적 T 세포 반응의 연구를 가능하게 한다.
이 모델을 종양 이식 수술과 결합하여, 기증자의 종양 조직을 종양과 일치하는 합성 수용자 마우스에 이식하여 이식된 기증자 조직으로의 수용자 유래 면역 세포의 유입을 정확하게 추적하여, 종양 고유 및 주변부 기원 항원 특이적 CD8+ 의 면역 반응을 분석할 수 있게 하였다. T 세포. 이 두 집단 사이에서 역동적 인 전환이 일어나는 것으로 나타났습니다. 총체적으로,이 실험 설계는 TME에서 CD8+ T 세포의 면역 반응을 정확하게 조사하기위한 또 다른 접근법을 제공했으며, 이는 종양 면역학에 대한 새로운 빛을 비출 것입니다.
서론
CD8+ T 세포-매개 면역 반응은 종양 성장을 조절하는데 중추적인 역할을 한다. 종양 생성 동안, 나이브 CD8+ T 세포는 MHC 클래스 I-제한 방식으로 항원 인식시 활성화되고, 이어서 이펙터 세포로 분화되고 종양 질량 1,2로 침윤된다. 그러나, 종양 미세환경(TME) 내에서, 장기간의 항원 노출, 뿐만 아니라 면역억제 인자는, 침윤된 종양 특이적 CD8+ T 세포를 "고갈"3으로 알려진 저반응 상태로 유도한다. 고갈된 T 세포 (Tex)는 급성 바이러스 감염에서 생성된 이펙터 또는 기억 T 세포와 구별되며, 전사적으로 및 후성유전학적으로 둘 다이다. 이들 텍스 세포는 주로 일련의 억제 수용체의 지속적이고 상승된 발현뿐만 아니라 이펙터 기능의 계층적 손실을 특징으로 한다. 또한, 소진된 CD8+ T 세포의 손상된 증식 능력은 종양 특이적 T 세포의 수의 감소를 초래하여, TME 내의 잔류 CD8+ T 세포가 종양 진행에 대해 충분한 보호 면역을 간신히 제공할 수 있다3. 따라서, 종양내 항원-특이적 ....
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프로토콜
모든 마우스 실험은 세 번째 군사 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 6-8 주령의 C57BL / 6 마우스와 18-22 g의 나이브 OT-I 트랜스제닉 마우스를 사용하십시오. 무작위 추출이나 "눈부심"없이 남성과 여성 모두를 사용하십시오.
1. 배지 및 시약의 제조
- 앞서 기술한 바와 같이 세포 배양 배지 D10을 준비하고, 둘베코의 변형 이글 배지에 10% 우태아 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 첨가한다.
- RPMI-1640에 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100mg/mL 스트렙토마이신을 보충하여 세포 배양 배지 R10을 준비합니다.
참고: 배양 배지인 D10 및 R10은 2-4°C에서 보관할 때 적어도 2주 동안 멸균되고 안정하게 유지될 수 있다. - 1x 인산완충식염수(PBS)에 2% FBS와 0.01%의 아지드나트륨을 보충하여 형광활성화세포분류(FACS) 완충액을 준비한다.
참고: 나트륨 아지드를 첨가하면 FACS 버퍼를 2-4°C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. - 이중 증류수에 155 mM
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결과
이 프로토콜의 회로도는 그림 1에 나와 있습니다. 종양 접종 8일 후, CD45.1+ 및 CD45.1+CD45.2+ OT-I 세포를 B16F10-OVA 종양 보유 C57BL/6 마우스에 주사하였다. 종양을 이식 후 8일째에 CD45.1+ OT-I 세포 이식 마우스(공여자)로부터 외과적으로 해부하고, 이식된 종양과 동일한 쪽의 등쪽 옆구리에 종양-매칭된 CD45.1+CD45.2+ OT-I 세포 이식된 마우스(수용자)에 이식하였다. 유세포 분석기(도 2에 도시된 게이팅 전략) 분석을 통해, CD44+CD8+ 종양 항원-특이적 T 세포의 2개 집단은 CD45.1+ 공여자 유래 및 CD45.1+CD45.2+ 수용자 유래 TIL을 포함하는.......
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토론
T 세포 매개 면역은 종양에 대한 면역 반응에 중요한 역할을하며, CTL은 암 세포를 근절하는 데 주도적 인 역할을합니다. 그러나, TME 내의 종양 항원-특이적 CTLs의 기원은 해명되지 않았다(30). 이러한 종양 이식 프로토콜의 사용은 종양내 항원-특이적 CD8+ T 세포가 줄기-유사 TCF1+ 전구 CD8+ T 세포의 존재에도 불구하고 오랫동안 지속되지 않을 수 있다는 중요한 단서를 제공하였다. 주목할 만하게, 종양 덩어리 내로의 주변부 유래 종양 특이적 CD8+ T 세포의 지속적인 유입이 존재한다.
우리의 지식에 따르면, 이것은 TME 내의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 유지가 종양 상주 TIL의 자기 재생 대신에 주위 유래 종양 특이적 CD8+ T 세포의 보충에 주로 의존한다는 것을 확인하는 비교적 편리하고 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 저명한 젊은 학자를위한 국립 자연 과학 기금 (31825011 번에서 LY)과 중국 국립 자연 과학 재단 (QH에 31900643 번, ZW에 31900656 번)의 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 &무; m 필터 | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1mL 투베르쿨린 주사기 | KDL | BB000925 | |
| 1.5mL 원심분리기 튜브 | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U 인슐린 주사기 | BD Biosciences | 320310 | |
| 15mL 원추형 튜브 | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2- 메틸 -2- 부탄올 | 시그마 | 240486-100ML | |
| 70 & m 나일론 세포 여과기 | BD Falcon | 352350 | |
| APC 안티 마우스 CD45.1 | BioLegend | 110714 | 클론 : A20 |
| B16F10-OVA 세포주 | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (소 혈청 알부민) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 마우스 안티 마우스 CD45.2 | BD Horizon | 562895 | 클론 : 104 |
| 세포 배양 접시 | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco의 Modified Eagle Medium | Gibco C11995500BT | ||
| EasySep 마우스 CD8+ T 세포 분리 키트 | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS 튜브 | BD Falcon | 352052 | |
| 소 태아 혈청 | Gibco | 10270-106 | |
| 유세포 분석기 | BD | FACSCanto II | |
| 혈구계 | PorLab Scientific | HM330 | |
| 이소플루란 | RWD 생명 과학 | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD 고정 가능한 근적외선 데드 셀 염색 키트, 633 또는 635nm 여기용 | Life Technologies | L10199 | |
| 바늘 캐리어 | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| 파라포름알데히드 | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE 안티 마우스 TCR V α 2 | BioLegend | 127808 | 클론:B20.1 |
| 펜 스트렙 글루타민(100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 안티 마우스 CD8a | BioLegend | 100734 | 클론:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| 아지드화나트륨 | 시그마 | S2002 | |
| 수술용 겸자 | RWD 생명 과학 | F12005-10 | |
| 외과 용 가위 | RWD 생명 과학 | S12003-09 | |
| 봉합사 | 스레드 RWD 생명 과학 | F34004-30 | |
| 트립신 - EDTA | 시그마 | T4049-100ml |
참고문헌
- Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4),....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 4/29/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
