공초점 현미경을 사용하여 리슈마니아 의 식균작용 조사

Leishmaniasis는 Leishmania 속의 원생 동물 기생충에 의해 야기 된 방치 된 열대 질환으로, 피부 리슈 마니아증, 점막 피부 리슈 마니아증 및 내장 리슈 마니아증¹을 포함하여 척추 동물 숙주에서 광범위한 임상 증상을 나타냅니다. 세계 보건기구 (WHO)는 10 억 명이 넘는 사람들이 위험에 처해 있으며 연간 백만 건 이상의 새로운 사례가보고되고^{있다고 추정합니다 2}.

Leishmania spp.는 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포를 포함한 숙주 세포 내에서 생존하는 의무적 인 세포 내 원생 동물입니다³. 리슈마니아-대식세포 상호작용은 직접적인 상호작용을 통해 또는 보체 수용체 ^4,5를 수반하는 옵소닌화에 의해 다수의 숙주 세포 수용체 및 기생충 리간드를 포함하는 복잡한 과정이다. 고전적 표면 수용체, 예컨대 CR1, CR3, 만노스-푸코스, 피브로넥틴, 톨-유사 및 스캐 빈저 수용체는 대식세포 6,7,8에 대한 기생충 부착을 매개한다. 이 수용체는 63 kDa 당단백질 (gp63) 및 당지질 리포스포글리칸 (LPG)⁹을 포함하여 리슈마니아의 표면에있는 분자를 인식합니다. 이들은 프로마스티고테스의 표면에서 가장 풍부한 분자이며, 숙주 면역 반응의 전복에 필수적인 역할을 하며, 포유동물 세포⁽¹⁰)에서 기생충 감염의 확립을 선호한다. 기생충 표면 리간드가 대식세포 수용체에 결합한 후, F-액틴은 포유류 세포 표면에 축적되어 기생충을 둘러싸고 식균작용을 한다. 이어서, 이것은 기생충-유도된 구획의 형성으로 이어지고, 이는 식리소좀 특징(¹¹)을 제시한다. 일단 이러한 식세포 내부에 들어가면, 기생충은 생존과 증식에 필수적인 몇 가지 변화를 겪습니다³.

PVs의 생물발생은 이 병원체⁽¹²)의 세포내 생존에 매우 중요한 고도로 조절된 막 밀매 과정이다. 이 구획의 형성은 숙주 내시성 경로의 식세포와 구획 사이의 순차적 융합 사건으로부터 초래된다. 고전적 세포 생물학 연구에 따르면 PV의 성숙은 단량체 G 단백질 Rab 5 및 Rab 7 단백질의 획득을 포함하며, 이는 주로 초기 및 후기 엔도솜 성숙과 관련이 있습니다¹³. 또한, 이들 구획은 리소좀 관련 막 단백질 1 및 2 (LAMP 1, LAMP 2), 리소좀 막 및 미세소관 관련 단백질 1A/1B 경쇄 3 (LC3), 오토파고좀 마커¹⁴의 주요 단백질 구성성분을 획득한다. 명백한 유사성에도 불구하고, PV 형성^15,16의 동역학과 이들 구획의 형태학은 리슈마니아 종에 따라 다양하다. 예를 들어, L. mexicana 또는 L. amazonensis에 의한 감염은 많은 수의 기생충⁽¹⁷)을 함유하는 큰 구획의 형성을 유도한다. 대조적으로, L. braziliensis 및 L. infantum과 같은 다른 종은 일반적으로 각 액포⁽¹⁸)에 하나 또는 두 개의 기생충 만 포함하는 더 작은 액포를 형성합니다.

숙주 세포-리슈마니아 상호작용을 둘러싼 이러한 지식에도 불구하고, 숙주 수용체와 기생충 리간드 사이의 접촉에 의해 촉발된 초기 사건은 완전히 해명되지 않았다. 이러한 사건은 기생충 감염의 결과의 결정 요인으로 알려져 있으며 기생충 종, 기생충을 인식하기 위해 모집 된 숙주 세포 수용체의 유형 및 대식세포 신호 전달 경로의 활성화^19,20에 의존합니다. 따라서 리슈마니아로 유도된 PV의 생물발생에 관여하는 분자를 확인하고 감염 확립 및 결과에서 이들 분자가 수행하는 역할을 결정하는 것이 필수적이다. 여기에서, 우리는 결합, 내재화, 식기 형성 및 성숙을 포함하여 Leishmania의 식세포 작용 중에 발생하는 초기 사건을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 PLC, Akt, Rab5, Rab7 및 LC3가 다른 리슈마니아 종에 의해 유도 된 PV의 형성에 참여하는 것을 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중요하게도, 이 프로토콜은 PV 성숙에 관여하는 다른 단백질의 참여를 조사하는데 사용될 수 있다. 미래의 연구는 Leishmania-host cell 상호 작용에 관련된 메커니즘을 둘러싼 지식을 확장하고 새로운 화학 요법 전략의 설계에 기여할 것입니다.

세포는 국가 연구 윤리위원회 (ID : 94648218.8.0000.0040)의 절차 승인에 따라 건강한 기증자로부터 얻어졌다.

1. 세포 배양

1. 인간 단핵구 유래 대식세포
   참고: 시험관 내에서 대식세포로의 분화를 위한 인간 단핵구 유래 대식세포를 수득하려면, 건강한 기증자로부터 혈액을 수집하고 D. English 및 B. R. Andersen²¹에 의해 기술된 바와 같이 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 정제한다.
   1. 말초혈액(50 mL)을 채취한 후, 이를 헤파린화된 튜브에 붓고 실온에서 인산완충용액(PBS)에 혈액을 1:1로 희석하였다. 희석된 헤파린화된 혈액을 이전에 분포된 밀도 구배 매질의 상부에 부드럽게 놓는다.
   2. 용혈을 피하기 위해 튜브를 24°C에서 30분 동안 252 × g 에서 원심분리한다.
      참고: 그라디언트 층이 혼합되지 않도록 원심분리기 브레이크오프를 설정하십시오. 원심분리 후, 불연속 구배층이 바닥에서 상부로 형성된다: 적혈구, 밀도 구배 배지, PBMC 고리 및 혈장.
   3. 밀도 구배 매질과 플라즈마 층 사이에 위치한 PBMC 고리를 새로운 튜브로 옮기고 PBS로 채워 과밀도 구배 배지를 씻어낸다.
   4. 세포를 1회 세척하고 4°C에서 10분 동안 190 × g에서 원심분리한다.
   5. 상청액을 버리고 펠렛을 완전한 RPMI 배지 1 mL에 재현탁시킨다.
   6. 25 mM N-×[2-하이드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산](HEPES), 2 g/L 중탄산나트륨, 2 mM 글루타민, 20 g/mL 시프로플록사신 및 10% 불활성화된 태아 소 혈청(FBS)(완전 RPMI 배지)이 보충된 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 500 mL의 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI)의 500 mL에 세포와 플레이트 2 및 플레이트₂를 계수하여 단핵구가 대식세포로 분화될 수 있도록 한다. 접착에 의하여.
2. THP-1 문화
   1. THP-1 세포주를⁷⁵ cm2 배양 플라스크에서 완전한 RPMI 배지 10 mL에² × 10 5 세포의 농도로 성장시킨다.
   2. 세포 배양물을 5%_CO2 하에 37°C의 인큐베이터에서 7일 동안 유지한다.
   3. 세포를 4°C에서 10분 동안 720 × g에서 원심분리하고, 펠렛을 완전한 RPMI 배지에 재현탁시켰다.
   4. 노이바우어 챔버에서 세포를 세십시오.
   5. 플레이트 세포를 13 mm 유리 커버슬립 상에서⁵ % CO×2 하에 37°C에서 100 nM 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)를 함유하는 완전한 RPMI 배지 500 μL에서 웰당₂ 내지 10 5 세포의 농도로 THP1 세포를 대식세포로 분화시킬 수 있게 한다.
   6. 사흘 후, 세포를 0.9% NaCl 용액으로 두 번 세척하여 PMA를 함유하는 배지를 제거하였다.
   7. 분화된 THP-1 세포를 실험 시작 전에 추가로 2일 동안 5%_CO2 하에 37°C에서 PMA가 없는 완전 RPMI 배지에서 인큐베이션한다.

2. 기생충 배양 및 셀트래커 레드 염색

참고: 형광 현미경을 통해 기생충을 시각화하려면 CellTracker Red 형광 염료(CMTPX)를 사용하여 염색을 수행하십시오. 대안적으로, 카르복시플루오레세인을 포함하는 다른 마커는 GFP, RFP, 또는 다른 형광 리포터 유전자를 구성적으로 발현하는 제조자 지시 또는 프로마스티고트에 따라 사용될 수 있다. 세포를 감염시키는 데 사용되는 기생충은 7 계대 이하의 프로마스티고트 축삭 배양물로부터 얻은 성장의 정지 단계에 있는 것들이다.

1. 리슈마니아 spp를 성장시키세요. ⁵⁰ μg/mL 겐타미신과 10% FBS로 보충된 슈나이더 배지 5 mL를 함유하는 세포 배양 플라스크에서 배지 1,000 μL 당 1 x 10 5 기생충에 있는 프로마티고트.
2. 기생충 축삭 배양물을 24°C에서 생화학적 산소 요구량(B.O.D.)에서 배양한 후, 노이바우어 챔버에서 매일 계수를 수행한다. 5 일 동안 기생충 형태 (얇고 길다)와 이동성을 확인하십시오. 기생충은 8 시간의 간격으로 두 개의 연속 카운트가 비슷한 양을 표시 할 때 성장의 고정 단계에서 고려됩니다.
3. 성장의 정지기에 도달하면, 기생충을 빛과의 접촉을 피한 5%_CO2 하에 37°C에서 15분 동안 1 μM CMTPX와 함께 0.9% NaCl 용액 4 mL에 인큐베이션한다.
4. FBS를 1:1 비율로 추가하고 기생충 현탁액을 추가로 1 분 동안 배양하십시오.
5. 기생충을 PBS로 세 번 세척하고, 1,781 × g에서 10분 동안 원심분리하였다.
6. 기생충 펠릿을 1,000 μL의 RPMI 완전 배지에 재현탁시킨다.
7. 노이바우어 챔버에서 기생충을 계산하십시오.

3. 대식세포에 대한 리슈마니아 결합의 평가

1. 시드 2 × 10⁵ THP-1 세포 또는 인간 단핵구 유래 대식세포를 13 mm 유리 커버슬립이 있는 24-웰 플레이트 상의 웰 당 500 μL의 완전한 RPMI 배지 중이다.
2. 세포를 37°C에서_{5% CO2 하에 24} 시간 동안 배양한다.
3. 세포를 0.9% NaCl 용액으로 두 번 세척하고 10분 동안 4°C에서 완전한 RPMI 배지에서 인큐베이션한다.
4. A. L. Petersen²² 에 의해 기술된 바와 같은 고정상상 프로마스티고트를 웰 플레이트에 10:1 비율로 첨가한 다음, 4°C 하에 5분 동안 720 × g에서 원심분리한다.
5. 4°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
6. 세포를 0.9% NaCl 용액으로 두 번 세척하여 내재화되지 않은 프로유방을 제거한다.
7. 세포를 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드에 고정시킨다.
8. 커버슬립을 실온에서 15분 동안 15 mM_NH4Cl로 인큐베이션한다.
9. PBS 0.15% 소 혈청 알부민(BSA)으로 세 번 세척한다. 블로킹 용액 (PBS 중 3% BSA)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
10. PBS로 세 번 세척한 다음, 실온에서 15분 동안 0.15% PBS-사포닌으로 투과시킨다.
11. 실온에서 1 시간 동안 phalloidin (희석 된 1:1,200)을 추가하고 빛으로부터 보호하십시오.
12. 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 장착합니다.
13. 63×/1.4 목표를 사용하여 공초점 형광 현미경을 통해 이미지를 획득합니다.

4. 대식세포에 의한 리슈마니아 식작용의 평가

1. 시드 2 × 10⁵ THP-1 세포 또는 인간 단핵구 유래 대식세포를 13 mm 유리 커버슬립이 있는 24-웰 플레이트 상의 웰 당 500 μL의 완전한 RPMI 배지 중이다.
2. 세포를 5% CO2 하에 37°C에서₂₄시간 동안 배양한다.
3. 세포를 0.9% NaCl 용액으로 두 번 세척하고, 10분 동안 4°C에서 24-웰 플레이트의 완전한 RPMI 배지에서 인큐베이션한다.
4. A. L. Petersen²²에 의해 기술된 바와 같이 고정상인 Leishmania spp.를 10:1 (기생충:숙주 세포) 비율로 첨가하고, 이어서 4°C 하에 10분 동안 720 × g에서 원심분리한다.
5. 세포를 4°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
6. 세포를 0.9% NaCl 용액으로 두 번 세척하여 내재화되지 않은 프로유방을 제거한다.
7. 세포를 보충된 RPMI 배지에서 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
8. 세포를 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오.
9. 선호하는 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 장착합니다.
10. 100×/1.4 목표를 사용하여 형광 현미경으로 무작위 필드에서 400개 이상의 세포를 계수합니다.

5. 리슈마니아 -유도된 액포 성숙의 평가

참고: THP-1 세포 형질감염은 M. B. Maess, B. Wittig 및 S. Lorkowski ²³에 의해 기술된 바와 같이 수행되어야 한다. 여기서는 최소한의 수정으로이 프로토콜을 요약합니다. 핵형성은 핵형성자를 필요로 하는 특정 형질감염 방법이다. 대안적인 방법으로서, 세포는 리포펙타민²⁴ 및 렌티바이러스 형질도입²⁵를 사용하여 형질감염될 수 있다.

1. 리슈마니아-유도된 PV의 생물발생을 조사하기 위해, THP1 세포를 PLC 26,27, Akt^26,27, Rab 5 28,29,30 또는 Rab 7^28,29,31 플라스미드로 형질감염시켰다.
   참고: 이 방법론은 THP-1 세포를 상기 열거된 유전자 이외의 다른 유전자로 형질감염시키는 데 사용될 수 있다.
2. THP-1 세포를 1.5 x 10⁷ 에서 48시간 동안 100 ng/mL PMA 및 50 μM 2-메르캅토에탄올로 보충된 10 mL 완전 RPMI 배지를 함유하는 75 cm² 조직 배양 플라스크에 48시간 동안 시드한다.
3. 세포를 0.9% NaCl 용액으로 한 번 세척한다.
4. 비효소적 세포 해리 용액 및 실온에서 5분 동안 원심분리기(250 × g)를 사용하여 세포를 분리한다.
5. THP-1 세포를 RPMI 배지 1 mL에 재현탁하고 노이바우어 챔버에서 카운트를 수행한다.
6. THP-1 세포를 실온에서 10분 동안 다시 250 × g에서 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
7. 2 × 10⁶ 세포를 100 μL의 Nucleofector 용액에 재현탁시키고, 형광 단백질로 태그된 관심있는 단백질을 암호화하는 플라스미드 0.5 μg과 함께 인큐베이션한다.
8. THP-1 세포 및 핵산을 함유하는 현탁액을 뉴클레오펙터 큐벳으로 옮긴다.
9. 뉴클레오펙터 프로그램 Y-001을 사용하여 THP1 세포를 형질감염시킨다.
10. 형질감염된 세포(2x10⁶)를 회수하고 13mm 유리 커버슬립(4웰/형질감염)이 있는 24웰 플레이트의 500μL RPMI 배지에 시드하십시오.
11. THP-1 세포를 완전한 RPMI 배지에서 37°C에서 0.5, 2, 4, 6, 12 및 24시간 동안 인큐베이션한다.
12. 3.13단계와 3.13단계를 반복합니다.

6. LC3를 리슈마니아 spp. PV에 채용한 평가

참고: 자가포식 막 마커 LC3는 식세포가 자가포식 특징을 나타내는지 여부를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 라이슈마니아-유도된 PVs에 대한 LC3 모집은 C. Matte³² 및 B. R. S.^Dias 33에 의해 이전에 기술된 바와 같이, 항-LC3 항체를 사용한 면역표지 세포에 의한 감염 동안 평가될 수 있다.

1. 시드 2 × 10⁵ THP-1 세포 또는 인간 단핵구 유래 대식세포를 13 mm 유리 커버슬립이 있는 24-웰 플레이트 상의 500 μL 완전 RPMI 배지에 함유하였다.
2. 세포를 5% CO2 하에 37°C에서₂₄시간 동안 배양한다.
3. 세포를 0.9% NaCl 용액으로 두 번 세척하고 완전한 RPMI 배지에서 인큐베이션한다.
4. A. L. Petersen²²에 의해 기술된 바와 같은 고정상 Leishmania spp. promastigotes를 10:1 (기생충:숙주 세포) 비율로 첨가하고, 세포를 4°C 하에 5분 동안 720 × g에서 원심분리한다.
5. 37°C에서 30분 또는 4시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 두 번 세척하고 세포를 고정시켜 감염의 초기 단계에서 리슈마니아 유도 PV 막에 대한 LC3 모집을 평가합니다.
   1. 대안으로, 감염의 후기 단계에서 PV 막으로의 LC3 모집을 평가하기 위해, 감염의 4 h에서 다른 대식세포 그룹을 두 번 세척하여 임의의 내재화된 프로마스티고트를 제거한다. 감염된 세포를 완전한 RPMI 배지에서 추가로 12시간 및 24시간 동안 인큐베이션하고, 최종적으로 두 번 세척하고 고정시킨다.
      참고: 고정된 세포는 표지될 때까지 4°C에서 PBS 또는 0.9% NaCl 용액에 보관될 수 있다.
6. 실온에서 20분 동안 0.1% 트리톤 X-100, 1% BSA, 20% 정상 염소 혈청, 6% 무지방 분유 및 50% FBS에서 고정된 세포를 동시에 차단하고 투과시킨다.
7. 세포를 실온에서 2시간 동안 PBS에 희석된 항-LC3 항체 (1:200)로 인큐베이션한다.
   참고: 면역염색의 음성 대조군으로서, 세포 그룹은 일차 항체 기원의 동물로부터 면역글로불린 G(IgG)와 함께 일차 항체에 사용된 것과 동등한 농도로 인큐베이션되어야 한다.
8. 세포를 실온에서 0.9% NaCl 용액으로 세 번 세척한다.
9. 세포를 AlexaFluor 488-접합된 염소 항-토끼 IgG (1:500) 또는 바람직한 형광-염료 접합된 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
10. 세포를 실온에서 0.9% NaCl 용액으로 세 번 세척한다.
11. 선호하는 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 장착합니다.
12. 63x/1.4 목표를 사용하여 공초점 형광 현미경을 통해 이미지를 획득합니다.

7. 공초점 현미경 수집 및 피지 정량화

참고: 면역 형광 이미지 획득은 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수행해야 합니다. 더 나은 해상도에 도달하려면 오일 침지 63x 대물 렌즈를 사용하십시오.

1. 13mm 유리 커버슬립을 실온에서 그대로 두고 최소 30분 전에 빛으로부터 보호하십시오.
2. 커버 슬립을 흡수성 조직으로 청소하십시오.
3. 목표에 침지 오일 한 방울을 추가하고 슬라이드를 추가합니다.
4. 오일이 슬라이드에 닿을 때까지 목표를 위로 움직입니다.
5. 현미경의 초점을 관찰하고 조정하고 오일로 63x 목표 옵션을 선택하십시오.
6. 라이카 프로그램을 열고 488, 552 및 405 파장에서 레이저를 조정하십시오.
7. 이미지 해상도 1,024 x 1,024를 선택합니다.
8. 라이브 버튼을 클릭하고 Z 스택을 설정 한 다음 시작 옵션을 누릅니다. 그런 다음 다시 수행하고 끝 버튼을 누릅니다. 좋은 해상도의 공초점 이미지를 얻으려면 슬라이스 두께의 경우 20μm를 사용하는 것이 좋습니다.
9. 이미지 획득을 기다린 다음 라이카 도구에서 "최대 투영" 옵션을 선택합니다.
10. 실험을 저장합니다.
11. lif 또는 tiff 형식 이미지를 컴퓨터로 내보내고 FIJI 프로그램을 엽니다.
12. 실험을 열고 하이퍼 스택으로 뷰 스택을 설정합니다. 그런 다음 개별적으로 열린 파일을 선택하고 타일을 스티치하십시오.
13. Fiji 도구 모음에서 무료 손 도구를 선택하고 손으로 셀을 신중하게 추적하십시오.
14. 분석 버튼을 누르고 측정하여 형광 강도를 시각화합니다.
15. 그룹당 각 셀에 대해 이 과정을 반복합니다.
16. 측정값을 저장하고 스프레드시트 편집기로 내보냅니다.
17. 이 데이터를 통계 분석 프로그램에 추가하고 통계 분석을 수행하십시오.

8. 통계 분석

참고: 데이터 분석 및 그래픽의 경우 통계 분석 프로그램을 사용하십시오.

1. 프로그램을 엽니다.
2. 얻은 데이터를 삽입하고 정규성 매개 변수를 테스트합니다.
3. 정규 분포가 있는 데이터의 경우 Student t-test를 사용하고 비모수 테스트인 Mann-Whitney 테스트를 사용합니다.
4. p-값이 0.05보다 작을 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 데이터를 고려하십시오.
5. 중앙 경향 측정값(평균 또는 중앙값)과 변동 측정값을 사용하여 데이터를 나타내는 그래픽을 준비합니다.

이 보고서는 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL 형태의 CL을 제시하는 환자로부터 분리 된 L. braziliensis의 식세포 작용 중에 발생하는 초기 사건을 평가하는 것을 목표로합니다. 공초점 현미경을 사용하여 기생충의 식작용과 관련된 주요 사건 인 결합, 내재화 및 식균 성숙을 조사했습니다. 먼저 인간 단핵구 유래 대식세포에 의한 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL 결합 및 식작용을 평가하였다. 데이터는 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL 둘 다 대식세포에 유사하게 결합한다는 것을 보여준다(그림 1). 또한, 숙주 세포에 의한 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL 식작용에 관해서는 어떠한 차이도 관찰되지 않았다(도 2). 마지막으로, LC3의 모집을 감염된 세포에서 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL에 의해 유도된 PVs와 비교하였다. 감염의 30분, 4 및 12시간 후에, 우리는 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL-감염 대식세포에서 LC3 장식된 PVs의 유사한 백분율을 관찰하였다(도 3). 이들 대표적인 결과는 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL이 LC3 모집과 관련하여 PVs의 결합, 식작용 및 생물발생 동안 대식세포와 유사하게 상호작용한다는 것을 보여주었다.

PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP 플라스미드로 효율적으로 형질감염된 THP-1 세포를 나타내는 현미경 이미지는 도 4에 나타내었다.

그림 1. 인간 대식세포에 대한 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL 결합의 평가. 인간 단핵구-유래 대식세포는 L. braziliensis-LCL- 또는 L. braziliensis-DL에 감염되었다. 4°C에서 10분 후, 결합을 공초점 현미경으로 평가하였다. (A) 대식세포에 결합하는 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL (CMTPX, 빨간색으로 표지됨)의 공초점 현미경 이미지(phalloidin, green으로 표지됨). 공초점 현미경을 위해, 세포 핵을 DAPI (파란색)로 표지하였다. 화살표는 리슈마니아-대식세포 결합을 묘사한다. (B) 대식세포에 결합하는 리슈마니아의 비율. 그룹당 총 30개의 세포를 분석하였다. 데이터는 quintuplicate에서 수행된 하나의 실험의 각 복제를 나타낸다(짝을 이루지 않은 t 검정, p > 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 인간 대식세포에 의한 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL 식작용의 평가. 인간 단핵구 유래 대식세포를 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL과 함께 4°C에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, 37°C에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 형광현미경으로 분석하여 총 400개의 세포를 계수하였다. (A) L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL에 의해 감염된 인간 대식세포의 공초점 현미경 이미지. 공초점 현미경을 위해, 세포 핵을 DAPI (파란색)로 표지하였다. 화살표는 Leishmania 기생충 핵을 묘사합니다. (B) 리슈마니아 식균작용의 백분율. 원은 삼중으로 수행된 하나의 실험의 각 복제로부터의 데이터를 나타낸다(짝을 이루지 않은 t 검정, p > 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 대식세포에서 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL에 의해 유도된 PV에 대한 LC3 모집의 평가. 인간 단핵구 유래 대식세포를 감염시킨 다음, 30분, 4 및 12시간 동안 항-LC3 항체로 염색하였다. (A) 항-LC3로 표지된 L. braziliensi s-LCL 또는 L. braziliensis-DL-감염된 대식세포의 공초점 현미경 이미지를 이어서 알렉사 플루오르 488(녹색)에 접합된 이차 항토끼 IgG 항체를 수득하였다. 공초점 현미경의 경우, 세포 핵을 DAPI (파란색)로 표지하였다; (B) LC3-II로 장식된 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL-induced PV의 백분율. 그룹당 총 30개의 세포를 분석하였다. 원은 분석된 각각의 랜덤하게 선택된 필드에 대응한다(짝을 이루지 않은 t 검정, p > 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. PLC, Rab5 또는 Rab7을 발현하는 THP-1 세포. 대식세포로 분화한 후, THP-1 세포는 GFP 형광 프로브에 결합된 각각의 관심 유전자와 함께 핵형성을 실시하였다: PLC, Rab5 및 Rab7. 이어서, 이들 세포를 고정시키고, DAPI (파란색)로 핵을 염색하고, 63x/1.4 목표를 사용하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

기금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 또는 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을하지 못했습니다. 저자들은 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.