Leishmania 감염에서 식균작용과 관련된 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기에서, 우리는 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명한다.
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방법 논문
공초점 현미경을 사용하여 리슈마니아 의 식균작용 조사
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Phagocytosis는 뚜렷한 단계를 포함하는 오케스트레이션 된 과정입니다 : 인식, 결합 및 내면화. 전문 식세포는 식균작용에 의해 Leishmania 기생충을 흡수하며, 여러 숙주 세포 수용체에 의해 기생충 표면의 리간드를 인식하는 것으로 구성됩니다. 대식세포막에 대한 리슈마니아 의 결합은 보체 수용체 유형 1 (CR1) 및 보체 수용체 유형 3 (CR3) 및 패턴 인식 수용체를 통해 발생한다. 리포포스포글리칸(LPG)과 63kDa 당단백질(gp63)은 대식세포-리슈마니아 상호작용에 관여하는 주요 리간드이다. 숙주 세포 수용체에 의한 기생충 리간드의 초기 인식에 따라, 기생충은 기생충 액포 내에서 내재화되고, 생존하고, 증식합니다. 리슈마니아-유도된 액포의 성숙 과정은 단량체성 G 단백질 Rab 5 및 Rab 7, 리소좀 관련 막 단백질 1 (LAMP-1), 리소좀 관련 막 단백질 2 (LAMP-2), 및 미세소관 관련 단백질 1A/1B-경쇄 3 (LC3)을 포함하는 세포 내 소포로부터 분자의 획득을 포함한다.
여기에서, 우리는 공초점 현미경을 사용하여 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명하는데, 여기에는 (i) 결합 (ii) 내재화 및 (iii) 식세포 성숙이 포함된다. 감염 결과의 이러한 결정 요인을 둘러싼 지식의 본문에 추가함으로써, 우리는 리슈 마니아 감염의 병인에 대한 이해를 향상시키고 새로운 화학 요법 표적에 대한 최종 검색을 지원하기를 희망합니다.
서론
Leishmaniasis는 Leishmania 속의 원생 동물 기생충에 의해 야기 된 방치 된 열대 질환으로, 피부 리슈 마니아증, 점막 피부 리슈 마니아증 및 내장 리슈 마니아증1을 포함하여 척추 동물 숙주에서 광범위한 임상 증상을 나타냅니다. 세계 보건기구 (WHO)는 10 억 명이 넘는 사람들이 위험에 처해 있으며 연간 백만 건 이상의 새로운 사례가보고되고있다고 추정합니다 2.
Leishmania spp.는 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포를 포함한 숙주 세포 내에서 생존하는 의무적 인 세포 내 원생 동물입니다3. 리슈마니아-대식세포 상호작용은 직접적인 상호작용을 통해 또는 보체 수용체 4,5를 수반하는 옵소닌화에 의해 다수의 숙주 세포 수용체 및 기생충 리간드를 포함하는 복잡한 과정이다. 고전적 표면 수용체, 예컨대 CR1, CR3, 만노스-푸코스, 피브로넥틴, 톨-유사 및 스캐 빈저 수용체는 대식세포
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프로토콜
세포는 국가 연구 윤리위원회 (ID : 94648218.8.0000.0040)의 절차 승인에 따라 건강한 기증자로부터 얻어졌다.
1. 세포 배양
- 인간 단핵구 유래 대식세포
참고: 시험관 내에서 대식세포로의 분화를 위한 인간 단핵구 유래 대식세포를 수득하려면, 건강한 기증자로부터 혈액을 수집하고 D. English 및 B. R. Andersen21에 의해 기술된 바와 같이 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 정제한다.- 말초혈액(50 mL)을 채취한 후, 이를 헤파린화된 튜브에 붓고 실온에서 인산완충용액(PBS)에 혈액을 1:1로 희석하였다. 희석된 헤파린화된 혈액을 이전에 분포된 밀도 구배 매질의 상부에 부드럽게 놓는다.
- 용혈을 피하기 위해 튜브를 24°C에서 30분 동안 252 × g 에서 원심분리한다.
참고: 그라디언트 층이 혼합되지 않도록 원심분리기 브레이크오프를 설정하십시오. 원심분리 후, 불연속 구배층이 바닥에서 상부로 형성된다: 적혈구, 밀도 구배 배지, PBMC 고리 및 혈장. - 밀도 구배 매질과 플라즈마 층 사이에 위치한 PBMC 고리를 새로운 튜브로 옮기고 PBS로 채워 과밀도 ....
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결과
이 보고서는 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL 형태의 CL을 제시하는 환자로부터 분리 된 L. braziliensis의 식세포 작용 중에 발생하는 초기 사건을 평가하는 것을 목표로합니다. 공초점 현미경을 사용하여 기생충의 식작용과 관련된 주요 사건 인 결합, 내재화 및 식균 성숙을 조사했습니다. 먼저 인간 단핵구 유래 대식세포에 의한 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL 결합 및 식작용을 평가하였다. 데이터는 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL 둘 다 대식세포에 유사하게 결합한다는 것을 보여준다(그림 1). 또한, 숙주 세포에 의한 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL 식작용에 관해서는 어떠한 차이도.......
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토론
리슈마니아-대식세포 상호작용은 복잡한 과정이며 질병 발생에 영향을 줄 수 있는 몇 가지 단계를 포함한다5. 비수술화된 리슈마니아와 숙주 세포의 상호작용에 관여하는 메카니즘을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 공초점 형광 현미경을 사용하여 리슈마니아 감염의 초기 단계부터 후기 단계까지 식작용을 평가하는 프로토콜을 기술하였다. 면역 표지 및 형광 표지 단백질의 발현을 포함한 세포 생물학 메커니즘을 조사하기 위해 둘 이상의 형광단을 포함하는 형광 기술을 사용하면 여러 단백질의 위치를 분석하고 세포 형태를 동시에 평가할 수 있습니다. 이들 방법에 의해 제공되는 이점들은 이들을 병원체-숙주 세포 상호작용(34)을 모니터링하기 위한 최상의 도구이다.
서로 다른 입자를 포함하는 식세포 과정을 더 잘 이해하려면 분자 수준35
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공개 사항
기금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 또는 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을하지 못했습니다. 저자들은 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
감사의 글
Gonçalo Moniz Institute, Fiocruz Bahia, Brazil 및 현미경 검사 부서에 도움을 주셔서 감사합니다. 이 연구는 INOVA-FIOCRUZ 번호 79700287000에 의해 지원되었으며, P.S.T.V.는 CNPq (305235/2019-2)의 연구 생산성 보조금을 보유하고 있습니다. 플라스미드는 캘리포니아 토론토 대학교 Mauricio Terebiznik에서 친절하게 제공했습니다. 저자는 Andris K. Walter에게 영어 개정 및 원고 카피 편집 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-메르캅토에탄올 | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 anti-LC3 antibodyNovus | Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) 염료 | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrí fuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 인큐베이터 | Thermo Fisher Scientific | X | |
| 컨포칼 형광 현미경(Leica SP8) | Leica Leica SP8 | ||
| 소 태아 혈청(FBS) | Gibco | 10270106 | |
| 형광 현미경(Olympus Lx73) | Olympus | 올림푸스 Lx73 | |
| 겐타마이신 | Gibco | 15750045 | |
| 글루타민 | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES(N-2-하이드록시에틸 피페라진-N'-2-에탄-설폰산) | Gibco | x | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | 시그마 | A9434 | |
| 일반 염소 혈청 | 시그마 | NS02L | |
| 뉴클레오펙터 2b 장치 | Lonza | AAB-1001 | |
| 뉴클레오펙터 용액 | Lonza | VPA-1007 | |
| 파라포름알데히드 | 시그마 | 158127 | |
| 팔로이딘 | 인바이트로겐 | A12379 | |
| Phorbol 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) | Sigma | P1585 | |
| 인산염 완충 용액 (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| 슈나이더의 곤충 매체 | 시그마 | S0146 | |
| 중탄산나트륨 | 시그마 | S5761 | |
| 피루브산 나트륨 | 시그마 | S8636 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 | X |
참고문헌
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1(201....
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재인쇄 및 허가
