치아 줄기 세포의 조절 연구를 위한 트로웰형 장기 배양 사용

요약

Trowell 형 장기 배양 방법은 치아 발달을 제어하는 복잡한 신호 네트워크를 밝히고 최근에는 지속적으로 성장하는 마우스 앞니의 줄기 세포와 관련된 조절을 연구하는 데 사용되었습니다. 형광 리포터 동물 모델과 라이브 이미징 방법은 치과 줄기 세포와 특정 틈새 미세 환경에 대한 심층 분석을 용이하게합니다.

초록

장기 발달, 기능 및 재생은 줄기 세포 틈새라고하는 별개의 해부학 적 공간 내에있는 줄기 세포에 의존합니다. 지속적으로 성장하는 마우스 앞니는 조직 특이적 줄기 세포를 연구하기 위한 우수한 모델을 제공합니다. 앞니의 상피 조직 특이 적 줄기 세포는 자궁 경부 루프라고하는 틈새에서 치아의 근위 끝에 있습니다. 그들은 치아의 자체 날카롭게하는 팁의 지속적인 마모를 상쇄하기 위해 세포의 지속적인 유입을 제공합니다. 여기에 제시된 것은 줄기 세포와 그 틈새를 수용하는 마우스 앞니의 근위 말단의 분리 및 배양에 대한 자세한 프로토콜입니다. 이것은 금속 격자로 지지되는 필터의 액체/공기 계면에 있는 두꺼운 조직 조각뿐만 아니라 조직 조각(체외이식편)의 체외 배양을 가능하게 하는 수정된 Trowell 유형 장기 배양 프로토콜입니다. 여기에 설명된 장기 배양 프로토콜은 생체 내에서 불가능한 조직 조작을 가능하게 하며, 형광 리포터의 사용과 결합하면 줄기 세포를 포함하여 시간이 지남에 따라 살아있는 조직에서 개별 세포 집단을 식별하고 추적할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 다양한 조절 분자 및 약리학 적 화합물이이 시스템에서 줄기 세포 및 그 틈새에 미치는 영향을 테스트 할 수 있습니다. 이것은 궁극적으로 줄기 세포 조절 및 유지를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

서론

마우스 앞니는 치아 구성 요소의 끊임없는 생산을 지원하는 줄기 세포 (SC)의 평생 보존으로 인해 지속적으로 성장합니다. 여기에는 법랑질 생성 흑색 모세포를 생성하는 상피 SC와 다른 세포^중에서 상아질 생성 치모 세포를 생성하는 중간엽 줄기 세포(MSC)가 포함됩니다1. 지속적으로 성장하는 앞니의 상피 SC는 처음에는 표지 유지 세포 ^2,3으로 확인되었으며 이후 Sox2⁴를 포함한 여러 잘 알려진 줄기 유전자를 발현하는 것으로 나타났습니다. 이 세포는 다른 기관의 상피 SC와 공통된 특징을 공유하며 앞니의 순음쪽에 위치한 자궁 경부 루프라고하는 SC 틈새 내에 있습니다. 틈새는 SC 활성을 조절하는 세포와 세포외 기질로 구성된 동적 실체입니다⁵. 계통 추적 연구에 따르면 Sox2+ 상피 SC는 치아의 전체 상피 구획을 재생할 수 있으며 연속적인^{치아 형성에} 중요합니다^6,7. 상아질 회복 또는 재생 잠재력을 가진 MSC는 혈관 및 신경

프로토콜

이 프로토콜은 동물의 사용을 포함하며 모든 절차는 헬싱키 대학의 동물 사용 및 관리에 관한 윤리위원회 및 동물 시설의 승인을 받았습니다.

1. 장기 배양 접시의 준비

1. 층류 후드에서 모든 절차를 수행하십시오. 70 % 에탄올로 작업 표면을 청소하고 고압 멸균 유리기구와 용액을 사용하십시오. 유리 구슬 살균기에서 가위 및 기타 금속 장비를 소독하십시오.
2. 일반적으로 70% 에탄올에 보관된 필터를 1x PBS로 3회 세척하여 에탄올을 제거하여 준비합니다(그림 1). 필터를 직사각형 조각 (3 x 3-5 x 5 mm)으로 자릅니다.
   알림: 세척된 필터 조각은 4°C에서 1x PBS에 며칠 동안 보관할 수 있습니다.
3. 배양 배지를 준비합니다(0.85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150μg/mL 아스코르브산, 0.2%[v/v] 페니실린[10,000 I.U./mL] 및 스트렙토마이신[10,000 μg/mL]에 1% [v/v] 200mM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드가 보충된 1:1 DMEM:F12). 4 °C에서 보관하십시오.
4. 30mm 금속 격자(조직 이미징을 가능하게 하는 직경 1-2mm 구멍 포함)를 35mm 페....

결과

상피 SC는 절치의 근위 끝에 위치한 자궁 경부 루프라고하는 틈새에 있습니다 (그림 3A). 자궁 경부 루프는 느슨하게 배열 된 상피 세포의 핵심 인 별 모양의 세망을 감싸는 내부 및 외부 법랑질 상피로 구성된 형태 학적으로 구별되는 구조입니다 (그림 3B, C). 각 절치에는 두 개의 자궁 경부 루프가 있지만 (그림 3A) 순순 자궁 경부 루프 만 SC를 포함합니다. 상피 SC는 성상 세망과 자궁 경부 루프^(20,21)의 끝에있는 인접한 법랑질 상피에 국한된다. 이들은 Sfrp5 발현을 특징으로 하는 자손을 생성하며, 이는 에나멜 분비 아멜로모세포 ^2,7

토론

체외 장기 배양은 장기 성장 및 형태 형성을 제어하는 유도 잠재력 및 상피-중간엽 상호 작용을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. Thesleff 실험실은 Trowell 유형 장기 배양의 Saxén 변형을 적용하고 치아 발달을 연구하는 데 사용하는 방법을 보여주었습니다¹⁴. 형광 리포터의 재현 가능한 조건과 발전으로 인해 치아 형태 형성과 그 안의 뚜렷한 세포 집단을 모니터링하는 데 유용한 방법이 되었습니다. 이 논문은이 프로토콜을 적용하여 상피 줄기 세포와 그들이 거주하는 미세 환경을 연구하는 방법을 설명했습니다.

출생 후 새끼와 나이든 동물로부터 SC 틈새를 포함하는 앞니의 근위 끝을 분리하는 기술이 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법의 성공 여부는 격리 시간 (조직 생존력에 직접적인 영향을 미침)과 손상되지 않은 음순 자궁 경부 루프로 손상되지 않은 근위 끝을 분리하는 능력에 달려 있습니다. 이것은 광물 화 된 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1mL 플라스틱 주사기
일회용 20/26 게이지 피하 주사 바늘	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	Gibco	14287
엑스트라 파인 본 가위	FST	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS 남미(CE)	LifeTechn.	10270106	분취로 나누고 -20°C에 보관하십시오. C
유리 구슬 살균기, Steri 250 Seconds-살균기	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm 직경	MerckMillipore	VCTP02500	실온에서 70% 에탄올에 보관하십시오.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	는 MilliQ에서 100 mg/ml를 희석하고, 필터는 20&mu에서 strerilized 그리고 분할됩니다 ; l aliquotes, 어두워진 곳에 보관, -20°C; C
저융점 아가로스	TopVision	R0801
금속 그리드			시판되거나 스테인리스 스틸 메쉬로 자체 제작(내식성, 메쉬 크기 0.7mm). 직경 약 30mm의 디스크를 자르고 가장자리를 구부려 높이를 3mm로 만듭니다. 못을 사용하여 구멍을 뚫습니다.
마이크로 집게	Medicon	07.60.03
파라포름알데히드	시그마-알드리치
페니실린-스트렙토마이신(10,000U/ml) 솔.	Gibco	15140-148
페트리 접시, 소다석회 유리	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35mm, 통풍구 포함	Duran	237554008
Petridish 90mm, 통풍구 없음 클래식	Thermo Fisher	101RT/C
소형 가위