방법 논문

유리 가용성 페놀산 조성물과 곡물 및 콩과 식물의 항산화 능력을 결정하는 일반화 된 방법

DOI:

10.3791/62467

⸱

2022년 6월 10일

 ,  , 
1Department of Food and Human Nutritional Sciences, University of Manitoba, 2Richardson Centre for Functional Foods and Nutraceuticals, University of Manitoba

이 논문에서

요약

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페놀산은 전체 곡물에 존재하는 중요한 식물 화학 물질입니다. 그들은 항산화 보호 기능과 같은 생리 활성 특성을 가지고 있습니다. 이 연구는 HPLC 식별, 총 페놀 함량 추정 및 곡물 및 콩과 식물에서 페놀산의 항산화 능력 결정을위한 일반화 된 방법을보고하는 것을 목표로했습니다.

초록

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페놀산은 페놀기와 카르복실기를 모두 포함하는 유기 화합물의 부류이다. 그들은 곡물에서 발견되며 곡물의 밀기울이나 콩과 식물의 종자 코트에 집중됩니다. 그들은 항산화 특성을 가지고 있으며, 최근 몇 년 동안 잠재적 인 항산화 보호 건강 기능에 대한 많은 연구 관심을 불러 일으켰습니다. 이 연구는 전체 곡물에서 유리 가용성 페놀 산을 추출하고 항산화 능력을 분석하기위한 일반화 된 방법을 제시합니다. 두 개의 곡물 (밀과 노란 옥수수)과 세 개의 콩과 식물 (카우완두콩, 신장 콩 및 콩)으로 구성된 다섯 개의 전체 곡물 샘플이 사용되었습니다. 곡물을 밀가루로 분쇄하고 그들의 유리 가용성 페놀산을 수성 메탄올을 사용하여 추출하였다. 이어서, 고압 액체 크로마토그래프(HPLC)를 이용하여 화합물을 동정하였다. Folin-Ciocalteu 방법을 사용하여 총 페놀 함량을 결정하고 항산화 능력은 DPPH 라디칼 소거능, Trolox 등가 항산화 능력 (TEAC) 및 산소 라디칼 흡광도 용량 (ORAC) 분석을 사용하여 결정되었습니다. 확인된 페놀산에는 바닐릭산, 카페인산, p-쿠마르산, 페룰산이 포함되었다. 바닐산은 카우완두에서만 확인되었으며 카페산은 신장 콩에서만 확인되었습니다. p-Coumaric acid는 노란색 옥수수, 카우완두콩 및 콩에서 확인되었으며, 페룰산은 모든 샘플에서 확인되었습니다. 페룰산이 우세한 페놀산이 확인되었다. 샘플에서 페놀산의 총 농도는 다음과 같은 순서로 감소했다 : 콩 > 카우완두> 황색 옥수수 = 신장 콩 > 밀. 총 항산화 능력 (DPPH, TEAC 및 ORAC 분석의 값의 합)은 다음과 같이 감소했다 : 대두 > 신장 콩 > 황색 옥수수 = 카우완두> 밀. 이 연구는 HPLC 분석뿐만 아니라 DPPH, TEAC 및 ORAC 분석이 페놀산 조성 및 전체 곡물의 항산화 특성에 대한 유용한 정보를 제공한다는 결론을 내렸다.

서론

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페놀산은 초식 및 곰팡이 감염에 대한 식물 방어뿐만 아니라 식물 조직의 구조적 지원 및 무결성을 유지하는 데 중요한 역할을하기 때문에 식물에서 연구 된 가장 중요한 식물 화학 물질 중 하나입니다 1,2. 그들은 곡물의 밀기울과 콩과 식물의 종자 코트에 풍부합니다3. 구조적으로 그들은 두 그룹으로 나뉩니다 : 히드록시벤조산 (그림 1)과 히드 록시 신남산 (그림 2). 곡물 및 콩과 식물에서 일반적인 히드록시벤조산은 갈릭산, p-히드록시벤조산, 2,4-디히드록시벤조산, 프로토카테추산, 바닐릭산, 시링산을 포함하며, 일반적인 히드록시신남산은 카페인, p-쿠마산, 페룰릭산, 시나프산3을 포함한다. 페놀산은 또한 지방에서 산화적 산패를 일으키는 자유 라디칼을 제거하고 생리 학적 시스템 4,5에서 라디칼로 인한 산화 스트레스를 시작하고 전파 할 수 있기 때문에 항산화 특성....

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프로토콜

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1. 샘플의 종류

  1. 이 연구를 위해 두 개의 곡물 (예 : 듀럼 밀 및 노란 옥수수)과 세 개의 콩과 식물 (예 : Blackeye cowpea 콩, 콩 및 붉은 신장 콩)으로 구성된 다섯 개의 전체 곡물 샘플을 사용하십시오.
  2. 각 곡물 50g을 세 배로 분쇄하여 밀가루로 분쇄하고 커피 분쇄기를 사용하여 500 μm 체로 통과시킵니다.
  3. -20 °C에서 보관하십시오.

2. 시료 준비

  1. 건조 물질 함량의 결정 및 건조 중량 기준의 표현
    참고: AOAC (2000)12의 방법에 따라 각 분말 샘플의 건조 물질 함량을 결정하십시오.
    1. 강제 대류 오븐을 켜고 온도를 130 °C로 설정하십시오.
    2. 건조 건조제 (실리카 겔)를 오븐에서 30 분 내지 1 시간 동안 건조시키고 건조 된 실리카 겔을 데시케이터로 옮긴다.
    3. 각 샘플의 2g을 깨끗하고 미리 건조되고 칭량된 알루미늄 캔에 정확하게 칭량합니다.
    4. 칭량된 샘플을 강제 대류 오븐에서 1시간 동안 130°C에서 건조시켰다.<....

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결과

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표 2는 곡류 및 콩과 식물 곡물에서 확인된 페놀산을 나타낸다. 사용 가능한 확실한 표준에 따라 샘플에서 네 개의 페놀산이 확인되었으며 바닐릭, 카페인, p-쿠마르산 및 페룰산입니다. 바닐산은 히드록시벤조산이고 다른 세 가지는 히드록시신남산이다. 바닐산은 Blackeye cowpea 콩에서만 확인되었으며 카페산은 신장 콩에서만 확인되었습니다. p-Coumaric acid는 노란 옥수수, 카우완두콩 및 콩에서 확인되었다. 그 농도는 건조 중량 기준으로 7.57 ~ 12.48 μg / g 밀가루 사이였으며, 노란색 옥수수는 가장 낮은 값을 보였고 콩은 가장 높은 값을 보였습니다. 페룰산은 모든 샘플에서 확인된 유일한 페놀산이었다. 그 농도는 건조 중량 기준으로 5.69 ~ 41.76 μg / g 밀가루 사이였습니다. 샘플 중에서, 페룰산 농도는 콩에서 가장 높았고, 카우완 콩이 그 뒤를 이었고, 밀, 노란 옥수수 및 강낭콩은 비교 가능한 값을 가졌다(표 2.......

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토론

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전체 곡물은 전 세계적으로 광범위한 식품 응용 분야를 찾는 대표적인 시리얼 곡물과 콩과 식물로 선정되었습니다. 각 곡물의 품종 간에는 변형이 존재할 수 있지만,이 연구의 초점은 전체 곡물에 대한 유리 페놀산 추출 및 분석을위한 일반화 된 방법을 입증하는 것이 었습니다. 추출 방법은 그러한 실험이 수행될 때 환경으로 방출될 화학물질의 양을 감소시키기 위해 샘플 및 용매의 양을 실질적으로 감소시킴으로써 변형되었다. 이 수정은 또한 전체 곡물의 밀리그램 양에서 페놀 추출을 가능하게합니다.

HPLC 분석은 샘플에서 구성 페놀산의 크로마토그램을 생성한다. 페놀산을 나타내는 각 크로마토그래피 피크는 미리 정의된 파장에서의 체류 시간을 정통 페놀산 표준의 보유 시간과 비교함으로써 확인할 수 있다. 자외선 (UV) 검출기는 일반적으로 UV 파장 범위 내의 페놀산을 식별하는 데 사용됩니다. 하이드록시벤조산은 보통 254-280 nm 사이에서 확인되는 반면, 하이드록시신남산은 보통 300-330 .......

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공개 사항

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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

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저자는 Alison Ser와 Hannah Oduro-Obeng의 기술 지원과 Janice Fajardo와 Miguel del Rosario의 비디오 편집 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15mL Falcon 원추형 원심분리기 튜브Fisher Scientific05-527-90
2mL 앰버 유리 ID Surestop 바이알Thermo ScientificC5000-2W
2mL 앰버 마이크로 원심분리기 튜브VWR20170-084
2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)Sigma-Aldrich440914-100G
2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산(ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥ 98%,Sigma AldrichA1888-2G
2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6)Sigma AldrichD913-2
6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), &지; 98%Fluka Chemika56510
9mm 자동시료주입기 바이알 나사산 캡Thermo Scientific60180-670
96웰 플랫 바닥판Fisher Scientific12565501
Agilent BioTek ELx800 마이크로플레이트 리더Fisher ScientificBT-ELX800NB
Agilent BioTek Precision 2000 96/384 자동 마이크로플레이트 피펫팅 시스템Fisher ScientificN/A
Agilent BioTek FLx800 마이크로플레이트 형광 리더Fisher ScientificN/A
분석 저울 SI-114Denver InstrumentSI-114.1
Autosampler, Waters 717 Plus, WatersWAT078900
BD 3 mL 주사기 Luer-Lok TipBD309657
Bransonic 초음파 세척기, Branson 5510Millipore SigmaZ245143
Corning LSE Vortex 믹서Corning6775
Durapore 필터 (0.45 µ m PVDF 멤브레인)Merck Millipore LtdHVLP04700 
Durapore 멤브레인 필터(0.45 &마이크로; m HV)Merck Millipore LtdHVHP04700
Eppendorf Research  플러스, 0.5-10 &마이크로; LEppendorf3123000020
Eppendorf Research  또한 0.5-5 mLEppendorf3123000071
Eppendorf Research  플러스, 100-1000 &마이크로; LEppendorf3123000063
Eppendorf Research  플러스, 10-100 &마이크로; LEppendorf3123000047
에틸 아세테이트, HPLC 등급Fisher ChemicalE195-4
페룰산 표준Sigma Aldrich128708-5G
FluoresceinFisher ScientificAC119245000
Folin & Ciocalteu 페놀 시약Sigma AldrichF9252
Formic acid, 99%Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a27048-0010
Gallic acid standardSigmaG7384
고성능 액체 크로마토그래프(HPLC), Waters 2695Waters960402
메탄올, HPLC 등급Fisher ChemicalA452-4
마이크로 피펫 팁, 0.5-10 µ LFisherbrand21-197-2F
마이크로 원심분리기 Sorvall Legend Micro 21 원심분리기Thermo Scientific75002435
다채널 마이크로피펫, Proline Plus, 30-300 µ LSartorius728240
포토다이오드 어레이 검출기, Waters 2996Waters720000350EN
피펫 팁, 1000 &마이크로; LVWR83007-382
피펫 팁, 1-5 mLVWR82018-840
과황산칼륨 (K2S2O8), ≥ 99.0%Sigma Aldrich216224-100G
인산이염기성 칼륨 무수(K2HPO4)Fisher ScientificP288-500
인산칼륨 일염기성(KH2PO4)Fisher ScientificP285-500
PYREX 250 mL 짧은 목 끓는 플라스크, 라운드 바텀코닝4321-250
역상 C18 분석 컬럼 (100 x 3 mm) Accucore aQThermo Scientific17326-103030
Roto 증발기, IKA RV 10IKA 
탄산나트륨 (NaCO3) 무수피셔 케미컬S263-1
염화나트륨 (NaCl)Mallinckrodt AR®7581
인산나트륨 이염기성 무수 (Na2HPO4)Fisher ScientificBP332-500
인산나트륨 일염기성 무수 (NaH2PO4)Fisher 생물 시약BP329-500
표준화 피펫 팁 0-200µ LFisherbrand02-681-134
주사기 구동 필터 유닛 (0.22 &마이크로; m)  Millex®-GVSLGVR04NL
Target micro-serts 바이알 인서트 (400 µ L)Thermo ScientificC4011-631
초순수(펌프가 있는 Direct Q-3 UV 시스템)MilliporeZRQSVP030
0010005185

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478(2014).
  2. Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I.

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